tiểu luận về enzim protease

 Ngày nay cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học các chế phẩm enzim được sản xuất ra càng nhiều trên nhiều lĩnh vực như:nông nghiệp,chăn nuôi ,thực phẩm …… ,và việc sử dụng chúng

Người làm :

Nguyễn Thị Minh Thủy

Đào Thị Sen

 Ngày nay cùng với sự phát triển của công nghệ sinh

học các chế phẩm enzim được sản xuất ra càng nhiều trên nhiều lĩnh vực như:nông nghiệp,chăn nuôi ,thực phẩm …… ,và việc sử dụng chúng cũng được phổ biến ở nhiều nước và mang lại lợi ích về

kinh tế khá lớn.

Hàng năm lượng enzim được sản xuất 300.000 tấn có

giá trị 500USD

trong sản xuất thường thu nhận động vật thực vật tuy nhiên gần đây nguồn thu enzim đã phong phú

và rẻ tiền hơn đó là nguồn thu enzim từ vi sinh vật.

 Protease được dùng khá nhiều trong cn sx như chế

biến thực phẩm như(đông tụ sữa làm pho mát,làm

mềm thịt ),chất tẩy rửa,y tế ,nông nghiệp…

Các phương pháp tách và tinh chế

 Để tách và tinh chế enzyme nói riêng

và protein nói chung thường có một loạt phương pháp hóa-lý và hóa học khác nhau Có thể chia làm ba nhóm phương pháp sau:

- Phương pháp kết tủa

- Phương pháp sắc ký

- Phương pháp phân tách hệ hai pha

nước

 Enzim xúc tác quá trình thủy phân liên kết peptit trong phân

tử protein,polipeptit đến sản phẩm cuối cùng là các axitamin.

 Nhiều proteaze cũng

có khả năng thủy

phân liên kết este và vận chuyển axit amin.

 Nguồn đông vật :

• Tụy tạng trispsin:là

nguồn enzim sứm nhất lâu đời nhất ,và có

nhiều enzim nhất

• Dạ dày bê :renin bến đổi cazein thành paracaze

có khả năng kết tủa

trong môi trường sữa có

đủ độ Ca.nếu như trong

dạ day bê bị nhiễm

pepxin thì khả năng

đông tụ cũng giảm đi Chú ý:ngần đây có nghiên cứu sản xuất protease

từ vi sinh vật có đặc tính renin như ở loài

eudothia parasitica và mucor purillus

 Nguồn thực vật :

 Promelain:thu từ quả ,chồi dứa ,vỏ dứa.

 Papain:thu từ nhựa của thân ,quả đu đủ (carica papaya)

 Pincin:thu từ nhựa cây cọ

Nguồn vi sinh

vật :

Vi khuẩn :lượng proteaza được sản xuất 59% lượng enzim sử dụng bacillus

subtilis,B.mesentericus……

protease của vi khuẩn có tính đặc hiệu rất cao,và

chúng hoạt động tốt ở pH trung tính và kiềm yếu

Nấm :aspergillus

oryza,A.saitoi…có khả năng đông tụ sữa sử dụng trong công nghệ sản xuất phomat

Xạ khuẩn :streptomyces grieus,…chúng có đặc tính đặc hiệu rộng ,có khả năng thủy phân liên kết peptido thành amino acid

Protease thu c l p th 4 c a phân l p th 3 ộ ớ ứ ủ ớ ứ

 Enzyme protease nội bào là những enzyme được tiết ra từ bên ngoài hoặc ngoại biên

màng protein và được trích ly vào môi trường bằng kỹ thuật trích ly

 Enzyme protease ngoại bào được thu nhận

từ quá trình lên men, như quá trình lên men trên môi trường rắn.

 Phương pháp gây đột biến

 Tạo những đột biến bị giảm khả năng sinh tổng hợp repretsor

 Tạo những đột biến tổng hợp enzim có cấu trúc bậc 1

 Gây đột biến hoạt hóa promotor làm tăng áp lực

của nó với ARN làm tăng tốc độ sao chép mã

 Phương pháp biến nạp :là sự biến đổi tính trạng di

truyền của 1 nòi vi sinh vật dười ảnh hưởng của AND trong dịnh chiết nhân nhận được từ tế bào của vi sinh vật khác.

 Phương pháp tiếp hợp gene:vật liệu di truyền được

truyền từ tế bào cho đến tế bào nhận vì thế vi sinh vật có khả naeng biến hợp sẽ không có khả năng tiếp hợp gene nữa.

 Phương pháp tải nạp :trong quá trình tải nạp các đoạn AND được truyền từ tế bào cho đến tb tiếp hợp với

AND của tb nhận do đó làm biến đổi tính chất di truyền

củ tb nhận

Phương pháp cấy chuyền.

* Đây là phương pháp phổ biến nhất dễ thực hiện bằng cách giữ giống trên môi trường thạch (thạch nghiêng, hộp petri,

…) với thành phần môi trường nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy thích hợp cho giống vi sinh vật đó Sau khi giống đã mọc tốt cần bảo quản ở nhiệt độ lạnh 3-40C và sau mỗi tuần phải cấy chuyền lại Khi cấy chuyền chỉ lấy bào tử hoặc khuẩn lạc mà không nên lấy cả môi trường dinh dưỡng để đảm bảo không chuyền các sản phẩm trao đổi chất vào môi trường mới (có thể gây biến đổi bất lợi không thể lường hết được) Nếu là xạ khuẩn thì không nên bảo quản giống trên môi trường thạch mà nên giữ trong đất

để khử trùng

* Để kéo dài thời gian bảo quản giống từ hàng tháng đến

1 năm, người ta phủ 1 lớp paraphin lỏng để tiệt trùng trên bề mặt giống để hạn chế sự phát triển của nó Cần lưu ý chỉ phủ lớp dầu sau khi cấy vi sinh vật đạt đến độ chín sinh lý

* Phương pháp cấy chuyền rất có hiệu quả để bảo quản các giống nấm men, vi khuẩn và rất hữu hiệu, dễ dàng triễn khai giống ra sản xuất lớn, hạn chế các tai biến có thể dẫn đến hư hỏng giống gốc

 Phương pháp làm khô.

* Bằng cách giữ giống trên cát, đất, silicagen trong điều kiện khô ráo (tất cả đều được khử trùng cẩn

thận) Trong điều kiện như vậy sẽ hạn chế sự phát

triển tiếp tục của giống khi bảo quản Phươg pháp này rất hay được sử dụng để bảo quản nấm mốc, xạ

khuẩn, một vài loại nấm men, vi khuẩn thời gian giữu giống có thể được 1 năm.

* Phương pháp làm khô cũng thực hiện đơn giản, không cần dụng cụ đắt tiền Tuy nhiên giống như phương

pháp cấy chuyền thời gian bảo quản tương đối ngắn.

 Phương pháp đông khô :

* Đông khô là quá trình mà n ướ c

đ ượ ấ c l y ra kh i m u khi các m u ỏ ẫ ẫ đang tr ng thái l nh sâu đây ở ạ ạ Ở

vi sinh v t đ ậ ượ c huy n phù trong ề môi tr ườ ng thích h p và đ ợ ượ c làm

l nh trong môi tr ạ ườ ng chân không Thi t b đông khô s hút n ế ị ẽ ướ c và

vi khu n và m t s virut Tuy ẩ ộ ố

nhiên, ph ươ ng pháp này ít đ ượ c

ng d ng đ i v i t o, đ ng v t

nguyên sinh và t bào đ ng v t ế ộ ậ

 Ph ươ ng pháp b o qu n l nh sâu: ả ả ạ

* Đ i v i ph ố ớ ươ ng pháp b o qu n l nh sâu thì vi ả ả ạ sinh v t đ ậ ượ c b o qu n trong môi tr ả ả ườ ng d ch ị

th và n ể ướ c c n cho ho t đ ng s ng c a vi sinh ầ ạ ộ ố ủ

phương pháp này thường được dùng với các chủng vi sinh vật có những đặc tính quí mà không thích hợp với phương pháp đông khô.

 Các phân tử enzyme không có khả năng đi qua màng của tế bào và màng của các cấu tử của tế bào Do đó để có thể chiết rút các enzyme nội bào, bước đầu tiên là phải phá vỡ cấu trúc của các tế bào có chứa enzyme và chuyển chúng vào dung dịch.

 Phá vỡ cấu trúc của tế bào chứa enzim:

 Nghiền nhỏ, nghiền với cát , nghiền với vụn thủy tinh, nghiền bi

 Để tế bào tự phân hủy

 Dùng tác động của siêu âm hoặc áp suất thẩm thấu ,trích li bằng muối ,dung dịch muối trung tính ,dung môi hữu cơ.

 Kết tủa enzim bằng các chất điện li thích hợp.

 Sau khi phá v t bào chuy n chúng vào dung ỡ ế ể

d ch ị

∗ Phương pháp kết tủa phân đoạn bằng (NH4)2 SO4 dựa trên cơ sở sự khác nhau về khả năng kết tủa của các protein enzyme ở một nồng độ muối (tính theo phần % nồng độ bão hòa) xác định được dùng phổ biến để loại bỏ bước đầu protein tạp của các dịch enzyme Các loại muối có thể được dùng là (NH4)2 SO4, Na2 SO4, MgSO4 người ta đã nhận thấy muối (NH4)2 SO4 là tốt nhất vì nó không làm hại mà làm ổn định (làm bền) hầu hết các loại enzyme Loại muối này lại rẻ và phổ biến Độ hòa tan của nó lại rất lớn (bão hòa 767g/l ở 250C).

∗ Phương pháp kết tủa phân đoạn bằng (NH4)2 SO4 dựa trên cơ sở sự khác nhau về khả năng kết tủa của các protein enzyme ở một nồng độ muối (tính theo phần % nồng độ bão hòa) xác định được dùng phổ biến để loại bỏ bước đầu protein tạp của các dịch enzyme Các loại muối có thể được dùng là (NH4)2 SO4, Na2 SO4, MgSO4 người ta đã nhận thấy muối (NH4)2 SO4 là tốt nhất vì nó không làm hại mà làm ổn định (làm bền) hầu hết các loại enzyme Loại muối này lại rẻ và phổ biến Độ hòa tan của nó lại rất lớn (bão hòa 767g/l ở 250C).

Sơ đ ồ các bư c trong quy trình ái l c ớ ự

Bước 5: Ổn định lại môi trường ái lực trong binding buffer.

 Dựa vào sự phân bố khác nhau của hỗn hợp trong dung dịch hai pha

không hòa tan vào nhau Các protein và mảnh vỡ tế bào có khả năng hòa tan khác nhau giữa hai pha, vì vậy phương pháp này có thể được dùng cho cả hai trường hợp: phân tách protein khỏi mảnh vỡ tế bào và phân chia các enzyme trong suốt quá trình tinh sạch protein

 Hệ hai pha nước được xem là phương pháp tốt cho việc phân tách và

tinh sạch các hỗn hợp, vì phân tách chất lỏng có mật độ khác nhau dễ dàng hơn phân tách các chất rắn ra khỏi các chất lỏng.

 So với các phương pháp tinh sạch khác thì hệ hai pha nước có một số

ưu điểm hơn như: có độ hòa tan trong nước của hai pha lớn (70-80%), đạt độ tinh sạch cao, hiệu suất cao, dễ dàng sử dụng ở quy mô lớn và đặc biệt polymer được tái sử dụng.

Phương pháp tách hệ 2 pha nước trong tách

và tinh chế protease

 Thu nhận enzyme từ hạt cốc nảy mầm.

Malt là loại hạt hoà thảo nảy mầm trong những điều kiện nhân tạo (nhiệt độ, độ

ẩm, thời gian) xác định gọi là qui tắc ủ malt.

Quá trình sản xuất malt bao gồm các khâu sau:

 Thu nhận, xử lý, làm sạch, phân loại và bảo quản hạt.

 Rửa, sát trùng và ngâm hạt.

 Ươm mầm ta sẽ thu được malt tươi.

 Sấy malt tươi.

 Xử lý và bảo quản malt khô.

Hoạt tính proteaza trong hạt ban đầu không đáng kể nhưng khi nảy mầm đã tăng lên 4÷8 lần, tăng nhanh hơn hoạt tinh amylaza và đạt cực đại vào khoảng ngày nảy mầm thứ 5 Sự thuỷ phân protein bắt đầu bằng tác dụng của proteinaza để tạo thành albumoza, polypeptit, pepton và sau đó dưới tác dụng của peptidaza tạo thành các axit amin Tuy nhiên sự biến đổi này thường không hoàn toàn vì các điều kiện nảy mầm thường không phải là điều kiện tối thích cho hoạt động của hệ enzyme proteaza của hạt.

 Thu nhận enzim từ thực vật.

 Họ dứa (Bromalaceae )

∗ Bao gồm tất cả các nòi dứa trồng lấy quả, lấy sợi (kể cả các nòi dứa dại).

∗ Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng các nguyên liệu lấy khô ở nhiệt độ 4000C sẽ giữ được hoạt tính enzyme tốt hơn so với nguyên liệu đã được bảo quản lạnh ở nhiệt độ 40C.

• Nguyên tắc chung để thu nhận Bromelain.

∗ Phế liệu dứa  làm dập  chiết lọc  ly tâm  kết tủa  ly tâm  lọc  chế phẩm kỹ thuật  sắc ký trao đổi ion  sấy thăng hoa  sản phẩm tinh khiết.

• Thu nhận Bromelain bằng phương pháp nhanh sử dụng CMC

∗ CMC được tẩm ướt bằng dung dịch đệm photphat 0,05M, pH= 6,1 Cho dịch chồi dứa vào, thỉnh thoảng khuấy trộn Enzyme này lên bề mặt của CMC Sau 2 giờ lấy

ra vắt nước loại bỏ cặn bẩn bám vào CMC, rữa trôi các protein không phải enzyme bằng đệm photphat ở pH= 6,5 Sau đó cho phần hấp thụ lần 1 Dung dịch phần hấp thụ là đệm photphat pH= 7,1, NaCl 0,5 N khuấy trộn Sau 2 giờ lấy ra vắt được dung dịch đậm đặc chứa Bromelain Tiếp tục phần hấp thụ như lần thứ 2 rồi gộp chung dịch chiết của cả hai lần kết tủa enzyme bằng axeton hay còn lạnh.

 Nhựa đu đủ (Carica Papaya L)

để từ đó tinh chế thành papain thương phẩm Papain có M= 20.700, Top=

chín), dùng khăn lau sạch vỏ, lấy dao cạo sạch nhũng đường không quá sâu, hứng nhựa vào cốc rồi làm khô Kết quả cho thấy hoạt tính papain sau khi chiết tách cao hơn khi đã để 3 tháng.

(catex) trong nước cất có bổ sung glyxerin để tăng độ hòa tan, lọc qua vải màn Kết tủa bằng axeton lạnh với tỷ lệ 2:1 so với thể tích dịch lọc Ly tâm

 Trong công ngh ch bi n ệ ế ế

th t:protease làm m m th t và ị ề ị tăng h ươ ng v cho th t b ng ị ị ằ cách ngâm th t vào dung d ch ị ị protease thik h p,t m h n ợ ẩ ỗ

h p làm m m th t(enzim,mu i ợ ề ị ố ,mì chính)

 Ưu điểm của việc thuỷ phân protease bởi enzyme là bảo toàn được vitamin của

nguyên liệu, không tạo ra các sản phẩm phụ, không làm sẫm màu dịch thuỷ

phân.

 Trong ch  bi n th y s n ế ế ủ ả :trong ch  bi n n c  ế ế ướ

 Trong công nghiệp sữa :sản xuất phomat nhờ hoạt tính làm đông tụ sữa

vd:A.candidus,P.roquerti,B.mensentericus.

 Trong công nghiệp sản xuất bánh mì ,bánh quy :protease làm giảm thời gian đảo trộn tăng độ dẻo và làm nhuyễn bột,tạo độ xốp và nở tốt hơn.

∗ Trong sản xuất bia :chế phẩm protease làm tăng độ bền của bia và rút ngắn thời gian lọc,protease của A.orirae dùng thủy phân protease trong hạ tôtt ngũ cố tạo điều kiện sử lí bia tốt hơn.

 Trong công nghiệp

da :protease được sử dụng để làm mềm da loại bỏ da khỏi các chất nhớt nhờ thủy phân một phần

protein chủ yếu là

collagen thành phần làm da dị

ứng.Protease được dùng tách ở vi khuẩn (B.mensertericus,B.s ubtilis),nấm mốc và

xạ khuẩn……….

 Trong công nghiêp dệt : Proteinase vi sinh vật

được sử dụng để làm sạch tơ tằm, tẩy tơ nhân tạo (các sợi nhân tạo được bằng các dung dịch

cazein, gelatin) để sợi được được bóng, dể

nhuộm Protease có tác dụng thủy phân lớp

protein serisin đã làm dính bết các sợi tơ tự nhiên, làm bong và tách rời các loại tơ tằm, do đó làm giảm lượng hoá chất để tẩy trắng

 Điều chế dịch đạm thủy phân dùng làm chất dinh dưỡng, chất tăng vị trong thực phẩm và sản xuất một số thức ăn kiêng.

với amylase tạo thành hỗn hợp enzyme dùng làm thức ăn gia súc có độ tiêu hóa cao, có ý nghĩa lớn trong chăn nuôi gia súc và gia cầm.

 Sản xuất keo động vật, chất giặt tổng hợp để giặt tẩy các chất bẩn protein, sản xuất mỹ phẩm,…

 Điều chế môi trường dinh dưỡng của vi sinh vật để sản xuất vaccine, kháng sinh,…