kỹ thuật thao tác trên gen

Các bước trong phản ứng PCR và phân tích sản phẩm... Các thông số ảnh hưởng đến hiệu quả nhân bản của phản ứng PCR - Chất lượng và nồng độ của DNA dùng làm khuôn - Nhiệt độ bắt cặp của m

KỸ THUẬT THAO TÁC TRÊN GEN

2

Nhu cầu cắt chính xác vị trí trên DNA trong tạo dòng

Nhu cầu cắt chính xác vị trí trên DNA trong tạo dòng

Tạo dòng DNA mục tiêu

được nhân bản bằng kỹ

thuật PCR

6

1 KỸ THUẬT PCR

Các bước trong phản ứng PCR và phân tích sản phẩm

Các thông số ảnh hưởng đến hiệu quả nhân bản

của phản ứng PCR

- Chất lượng và nồng độ của DNA dùng làm khuôn

- Nhiệt độ bắt cặp của mồi và khuôn

- Nồng độ Mg 2+

- Nồng độ dNTP

- Thời gian của ba bước trong phản ứng

- Số lượng chu kỳ của phản ứng PCR

Mồi của PCR quyết định tính đặc hiệu

của phản ứng PCR

Chiều dài của mồi ảnh hưởng đến tính đặc hiệu

Nhiệt độ các bước trong phản ứng PCR

- Nhiệt độ các bước trong 1 chu kỳ của phản ứng PCR:

+ Nhiệt độ biến tính: thông thường 94ºC

+ Nhiệt độ bắt cặp mồi – khuôn: phụ thuộc khuôn và mồi

+ Nhiệt độ kéo dài: thông thường 72ºC (gần nhiệt độ tối ưu của Taq DNA polymerase)

- Nhiệt độ bắt cặp quyết định tính đặc hiệu của phản ứng:

+ Thấp: nhiều sự bắt cặp không chuyên biệt, tạo nhiều sản phẩm

không đặc hiệu

+ Cao: không đảm bảo sự bắt cặp của mồi-khuôn, không cho phản ứng khuếch đại

- Nhiệt độ bắt cặp tối ưu:

không cao và không quá

thấp hơn so với hơn

nhiệt độ tan Tm của

mồi-khuôn

- Xác định Tm bằng công

thức: Tm = (4x[G+C]) +

(2x[A+T])ºC

Nhiệt độ và thời gian các bước trong phản ứng PCR

Sản phẩm của phản ứng PCR và phân tích

- PCR phân tích: nhằm có thông tin về sự hiện diện hay không của một trình tự DNA chuyên biệt, số lượng bản sao của gen, sự biểu hiện của gen (RT-PCR)…

- PCR điều chế: nhằm thu được đoạn DNA, gen mục tiêu

Phân tích sản phẩm của phản ứng PCR bằng

enzyme cắt giới hạn

Tinh chế sản phẩm PCR điều chế

- Điện di trong gel agarose có nhiệt độ nóng chảy thấp

- Cắt miếng gel chứa vạch DNA của sản phẩm khuếch đại

- Đun chảy gel trong Eppendorf

- Xử lý bằng phenol, phenol chloroform, chloroform

- Tủa bằng ethanol

Một số đặc điểm lưu ý của Taq DNA polymerase

- Tổng hợp thừa một A ở đầu 3’OH

- Không có hoạt tính 5’ exonuclease để sửa sai do vậy sản

phẩm PCR chứa nhiều base sai lệch (1/300 sau 30 chu kỳ)

Sản phẩm PCR bởi

Taq DNA

polymerase chứa

nhiều sai sót

Hệ thống giới hạn, biến đổi type II

Sản phẩm cắt của RE type II

Trình tự nhận diện của một số RE type II thông dụng

Enzyme cắt tạo đầu bằng (blunt) và đầu dính (sticky)

Một số enzyme khác nhau tạo đầu dính giống nhau

Tần số trình tự nhận biết của RE trên DNA

- Tùy thuộc vào số base trong trình tự nhận diện:

+ 4 base: tần số là 1:44 (hay 1/256)

+ 6 base: tần số là 1:46 (hay 1/4096)

Bản đồ giới hạn của λ

Đệm 10X cho phản ứng cắt DNA bằng BglII

Điện di DNA trong pha lỏng

Tách các đoạn DNA theo kích thước

bằng điện di trong gel

Hiển thị các

vạch DNA

bằng EtBr

Điện di trên gel agarose

và xem vạch DNA

Ảnh kết quả

phân tích DNA bằng

điện di trên gel

agarose

Xác định kích thước vạch DNA bằng độ di động điện di

- Dùng thang kích thước gồm các vạch DNA đã biết trước kích thước (bp)

- Kích thước vạch DNA mục tiêu có thể được ước lượng bằng mắt hoặc tính toán dựa vào đường tương quan của kích thước theo

độ di động điện di

nick bằng DNA Pol I

- Đánh dấu hai đầu

3‘OH bằng Klenow

fragment

Đánh dấu không đồng vị

Phát hiện biotin

42

Xác định vị trí nhận biết của enzyme cắt giới

hạn trên DNA (restriction map)

- Thực hiện cắt bằng từng RE (cắt đơn), điện di, xác định

kích thước các vạch DNA

- Thực hiện cắt kép bằng hai RE, điện di, xác định kích

thước các vạch DNA

- So sánh kết quả cắt đơn và cắt kép để xác định vị trí nhận

biết của các enzyme RE

- Phương pháp cắt không hoàn toàn (partial digest, rút ngắn thời gian cắt hoặc giảm nhiệt độ phản ứng xuống 40C) được

Xác định restriction map của phage λ

46

Nối các đoạn DNA bằng ligase

48

Nối đầu dính

và nối đầu

bằng

Tạo đầu dính

cho các DNA

đầu bằng dựa

vào adaptor

Adaptor với đấu dính 5’OH giúp tránh sự tự

gắn của đầu dính giữa các adaptor

Tạo đầu dính

bằng homopolymer tailing nhờ terminal transferase

Lắp các nick in vivo nhờ Klenow polymerase và

ligase của tế bào