THIẾT KỀ VECTOR MANG GEN MÃ HOÁ PROTEIN BỀ MẶT CỦA VIRUT H5N1 PHỤC VỤ NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN TẠO VACCINE THỰC VẬT

THIẾT KỀ VECTOR MANG GEN MÃ HOÁ PROTEIN BỀ MẶT CỦA VIRUT H5N1 PHỤC VỤ NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN TẠO VACCINE THỰC VẬT

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

THIẾT KỀ VECTOR MANG GEN MÃ HOÁ PROTEIN

BỀ MẶT CỦA VIRUT H5N1 PHỤC VỤ NGHIÊN CỨU

CHUYỂN GEN TẠO VACCINE THỰC VẬT

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y - DƯỢC

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NCKH CẤP BỘ

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

MỞ ĐẦU

1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

3

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

4

NỘI DUNG BÁO CÁO

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

5

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

6

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn MỞ ĐẦU

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

* Vaccine nhược độc (attenuated

vaccine)

* Vaccine bất hoạt (inactivated

vaccine)

* Vaccin thế hệ mới:

- vaccine tái tổ hợp (recombination

vaccine)

- vaccine thực vật (plant-base

vaccine),

PHÒNG CHỐNG

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn VACCINE THỰC VẬT

Với mục đích tạo cơ sở cho việc sản xuất vaccine A/H5N1 ăn được, chúng tôi đã tiến

hành chọn đề tài: “Thiết kế vector mang gen

mã hoá protein bề mặt của virut H5N1 phục

vụ nghiên cứu chuyển gen tạo vaccine thực vật”

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

1 Mục tiêu nghiên cứu

- Tạo vector tái tổ hợp mang gen mã hóa protein bề mặt của virut H5N1

- Tạo chủng vi khuẩn Agrobacterium mang vector tái tổ hợp chứa gen mã hóa protein bề mặt của virut H5N1

2 Nội dung nghiên cứu

- Thiết kế gen mã hóa protein bề mặt của virus H5N1 vào vector thích hợp chuyển gen ở thực vật

- Chuyển gen mã hóa protein bề mặt virus H5N1 vào cây thuốc lá và cây đậu tương

MỤC TIÊU, NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

1 Vật liệu

Nguyên liệu thực vật:

Giống thuốc lá Nicotiana tabacum K326 từ Phòng Công nghệ

Tế bào Thực Vật-Viện Công nghệ snh học

Chủng vi khuẩn và các nguyên liệu DNA:

- Các chủng vi khuẩn E.coli và Agrobacterium do viện Công

nghệ sinh học cung cấp

- Vector pBeta-Phaso-dest mang promotor chuyên dụng được cung cấp bởi Trường Đại học Ghent, Vương quốc Bỉ

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

2 Phương pháp nghiên cứu

- Kỹ thuật PCR,colony PCR

- Các phương pháp biến nạp: sốc nhiệt,xung điện

- Tạo vector chuyển gen bằng kỹ thuật Gateway

- Các phương pháp chuyển gen và sàng lọc cây chuyển gen

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

Đặc tính kháng nguyên của virus cúm A

Mô hình cấu trúc protein 3 chiều của HA

Câu trúc protein Hemagglutinin

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

Kháng nguyên HA

Câu trúc protein Hemagglutinin

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

Kháng nguyên NA(neuraminidase)

Cấu trúc protein neuraminidase

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

Đặc tính kháng nguyên của virut cúm A

Kháng nguyên NA cùng với kháng nguyên HA của virus là các đích chủ yếu của cơ chế bảo hộ miễn dịch của cơ thể với virus cúm A, và là cơ sở điều chế các vaccine phòng cúm hiện nay cho người và gia cầm, nhằm ngăn chặn dịch cúm ở gia cầm và hạn chế lây truyền sang người

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn QUY TRÌNH SẢN XUẤT VACCINE THỰC VẬT

Chuyển vector vào khuẩn Agrobacterium

•Kiểm tra khả năng miễn dịch ở động vật

•Tinh sạch và sản xuất.

Phân tích biểu hiện gen trong cây Thiết kế vector chứa gen quan tâm

Chuyển gen quan tâm vào tế bào thực vật

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

3 May 2024

KẾT QUẢ

THIẾT KẾ VECTOR

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

3 May 2024

Size (bp) 31 63 6 372 21 18 57 6 60 6 39 12 31

RE2 LTB L

35S

attB1 2S2 B epitope G T epitope

35S attB2

KDEL

C-myc

RE3 RE1

MANKLFLVCAALALCFLLTNA LD APQSITELCSEYRNTQIYTINDKILSYTESMAGKREMVIITFKSGATFQVEVPGSQHIDSQ KKAIERMKDTLRITYLTETKIDKLCVWNNKTPNSIAAISMENSDPHVPNLDLEEFEWSYIVEKANPVNDLCYPGGG ECPKYVKS NRLVLATGLRNS KD EQKLISEEDLNGSKDEL

Protein

GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTC ATG GCA AAC AAG TTG TTC CTC GTC TGC GCA GCT CTC GCT CTC TGC TTC CTC CTC ACC AAC GCT GTC GAC GCT CCA CAA TCC ATC ACT GAG CTT TGC TCT GAG TAC AGG AAC ACT CAG ATC TAC ACC ATC AAT GAC AAG ATC CTC TCT TAC ACT GAG AGC ATG GCT GGC AAG AGG GAG ATG GTG ATC ATC ACC TTC AAG TCA GGA GCC ACT TTC CAG GTG GAG GTT CCA GGC TCA CAA CAC ATC GAT TCC CAG AAG AAG GCC ATT GAG AGG ATG AAG GAC ACC TTG AGG ATC ACC TAC CTC ACT GAG ACC AAG ATT GAC AAG CTC TGT GTG TGG AAC AAC AAG ACT CCA AAC TCC ATT GCT GCC ATC AGC ATG GAG AAC TCA GAC CCA CAC GTG CCA AAC GTC GAC CTC GAG GAA TTC

GAA TGG TCT TAC ATt GTt GAG AAG GCt AAg CCA GTt AAg GAC CTC TGT TAC CCA GGa GGC GGT

CTT GAA CAG AAA CTC ATC TCA GAA GAG GAT CTG AAT GGT TCC AAA GAC GAA CTC TGA GACCCAG CTTTCTTGTACAAAGTGGTCCCC

DNA

CẤU TRÚC GEN NHÂN TẠO

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vnBước 1:Thiết kế vector tái tổ hợp chứa cấu trúc gen HAop

Tên mồi Trình tự

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vnBước 1:Thiết kế vector tái tổ hợp chứa cấu trúc gen HAop

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vnBước 1:Thiết kế vector tái tổ hợp chứa cấu trúc gen HAop

Cắt pDONN201-HAop bằng XhoI/HindIII

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn Bước 2: Thiết kế vector đặc trưng trong hạt

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn Bước 2: Thiết kế vector đặc trưng trong hạt

Điện di kiểm tra vector tái tổ hợp pPhaso-HAop bằng PCR (A)và cắt bởi enzyme hạn chế EcoRI (B) M: Thang chuẩn 1 Kb; 1, 2, 3: mẫu vector tái tổ hợp tách từ các dòng khuẩn lạc.

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn Bước 3: Biến nạp vector tái tổ hợp vào chủng vi

khuẩn Agrobacterium

Kiểm tra dòng A tumefaciens CV58 mang gen biến

nạp bằng PCR

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

Kết quả biến nạp cấu trúc gen vào cây thuốc lá

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn Kết quả biến nạp cấu trúc gen vào cây thuốc lá

Kiểm tra gen chuyển HAop trong cây thuốc lá M: Thang chuẩn 1 Kb; 1: mẫu cây thuốc lá không chuyển gen; 2, 3, 4, 5, 6 và 7: mẫu cây thuốc lá chuyển gen HAop

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn Kết quả biến nạp vào cây đậu tương

Hạt đậu tương Hạt sau khử trùng

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

Kết quả chuyển các cấu trúc HA1 vào nách lá

mầm giống đậu tương ĐT12

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

Kết quả chuyển các cấu trúc HA1 vào nách lá

mầm giống đậu tương ĐT12

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

Các dòng đậu tương chuyển gen thế hệ T0

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

3 Sử dụng phương pháp chuyển gen thông qua nách lá mầm nhờ vi khuẩn

A.tumefacien, bước đầu đã thu được 8 dòng cây T0 mang gen HA.1 Đây là tiền đề

quan trong cho việc tạo được các dòng đậu tương mang gen mã hoá cho các kháng nguyên của virus H5N1 làm vacine ăn đựơc cho gia cầm phòng chống bệnh H5N1

ở Việt Nam.

Kết luận và kiến nghị

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

KIẾN NGHỊ

1 Tiếp tục chọn lọc các dòng đậu tương biến nạp đã thu được

2 Phân tích kiểm tra khả năng đáp ứng miễn dịch ở gia cầm

Kết luận và kiến nghị

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

XIN TRÂN TRỌNG CẢM ƠN!