Tối ưu hóa các điều kiện định lượng một số anthocyanidin trong rau củ quả bằng phương pháp sắc kí

Hiện nay, trên thế giới các nghiên cứu định lượng anthocyanidin đang được quan tâm bởi các công trình công bố trước đây thường chỉ dừng lại ở tìm điều kiện tối ưu để chiết anthocyanin ra

ii

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS.TS Nguyễn Xuân Trung

Hà Nội – 2017

i

điều kiện giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ths Vũ Thị Trang, người đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo và động viên em trong suốt quá trình làm đề tài và cảm ơn các anh chị đang làm việc, nghiên cứu tại Khoa chất lượng phụ gia và hỗ trợ chế biến thực phẩm, Viện kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh Thực phẩm Quốc gia

Em xin được gửi lời cảm ơn tới Ban lãnh đạo Viện kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh Thực phẩm Quốc gia tạo mọi điều kiện cho em được thực hiện đề tài tại đây

Em xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô giáo giảng dạy tại khoa Hoá học, đặc biệt là các thầy cô trong bộ môn Hoá Phân Tích đã cho em những kiến thức quý giá, tạo điều kiện cho em được học tập và nghiên cứu trong môi trường hiện đại

Em xin trân trọng cảm ơn ban Giám Đốc, Ban chủ nhiệm khoa Môi Trường,

Bộ môn Hóa Học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tạo điều kiện cho em được học tập để nâng cao trình độ

Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn động viên, chia sẻ mọi khó khăn cùng em

Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận văn

Chu Thị Thanh

ii

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

DANH MỤC BẢNG iv

DANH MỤC HÌNH v

DANH MỤC BẢNG VIẾT TẮT vi

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về anthocyanin và anthocyanidin 3

1.1.1 Giới thiệu về anthocyanin 3

1.1.2 Cấu trúc hóa học của anthocyanidin 4

1.1.3 Tính chất của anthocyanidin 6

1.1.4 Tác dụng của anthocyanin 8

1.1.5 Sự phân bố của anthocyanin trong thực vật 9

1.2 Phương pháp xác định anthocyanidin 9

1.2.1 Phương pháp điện di mao quản 9

1.2.2 Phương pháp phổ hấp thụ phân tử UV - VIS 11

1.2.3 Phương pháp sắc kí lỏng HPLC 12

1.3 Qui hoạch hóa thực nghiệm tìm điều kiện tối ưu quá trình thủy phân 15

CHƯƠNG 2 – THỰC NGHIỆM 18

2.1 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất 18

2.1.1 Thiết bị và dụng cụ 18

2.1.2 Hóa chất 18

2.2 Mẫu phân tích 21

2.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 22

2.3.1 Nội dung nghiên cứu 22

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu 22

2.4 Đánh giá kết quả phương pháp phân tích 25

2.4.1 Xây dựng khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng 25

2.4.2 Xử lí số liệu thực nghiệm 26

CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30

iii

3.1 Khảo sát các điều kiện tách và xác định anthocyanidin trên HPLC 30

3.1.1 Lựa chọn cột tách sắc kí 30

3.1.2 Chọn bước sóng phát hiện 30

3.1.3 Khảo sát thành phần pha động 32

3.1.4 Khảo sát chương trình gradient 33

3.1.5 Khảo sát nồng độ axit trong pha động 36

3.1.6 Khảo sát tốc độ dòng 37

3.2 Tối ưu hóa quy trình xử lý mẫu theo phương pháp mặt mục tiêu 38

3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng khối lượng mẫu 39

3.2.2 Khảo sát đồng thời các yếu tố theo phương pháp RSM 40

3.2.3 Hiệu suất thủy phân 53

3.2.4 Kết luận về điều kiện tối ưu để định lượng anthocyanidin 56

3.3 Đánh giá kết quả phương pháp phân tích 58

3.3.1 Đánh giá độ đặc hiệu/ chọn lọc của phương pháp 58

3.3.2 Khảo sát khoảng tuyến tính lập đường chuẩn 60

3.3.3 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp 61

3.3.4 Độ lặp lại của phương pháp 62

3.3.5 Hiệu suất thu hồi 65

3.3.6 Ứng dụng phân tích mẫu thực tế 67

KẾT LUẬN 70

TÀI LIỆU THAM KHẢO 71

iv

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1 1.Một số điều kiện thủy phân anthocyanin 16

Bảng 2.1 Mức cơ sở các yếu tố ảnh hưởng 24

Bảng 3.1 Chương trình gradient 1 31

Bảng 3.2 Chương trình gradient 2 32

Bảng 3.3 Chương trình gradient 3 33

Bảng 3.4 Chương trình gradient 4 33

Bảng 3 5 Độ phân giải và hệ số đối xứng pic 34

Bảng 3 6 Ảnh hưởng tốc độ dòng đến diện tích pic và độ phân giải các anthocyanidin 36

Bảng 3.7 Mức cơ sở và khoảng biến thiên các yếu tố theo mô hình bậc hai tâm xoay 39

Bảng 3.8 Tổng hàm lượng anthocyanidin và cyanidin theo mô hình bậc hai tâm xoay 40

Bảng 3 9 Kết quả phân tích ảnh hưởng các nhân tố khảo sát đến hàm lượng anthocyanidin 41

Bảng 3 10 Bảng phân tích phương sai của hàm lượng anthocyanidin 42

Bảng 3 11 Bảng phân tích phương sai sau khi bỏ yếu tố không có nghĩa 44

Bảng 3 12 Bảng sai số giữa kết quả thực nghiệm và kết quả theo mô hình 45

Bảng 3.13 Hàm lượng anthocyanidin trong đỗ đen tại điều kiện tối ưu 48

Bảng 3 14 Bảng phân tích phương sai cyanidin sau khi bỏ yếu tố không có nghĩa50 Bảng 3 15 Sai số giữa kết quả thực nghiệm và mô hình hàm lượng cyanidin 51

Bảng 3 16 Hiệu suất thủy phân chuẩn anthocyanin 53

Bảng 3 17 Phương trình hồi quy, khoảng tuyến tính của các anthocyanidin 60

Bảng 3 18 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng các anthocyanidin 60

Bảng 3 19 Độ lặp lại của delphinidin 61

Bảng 3 20 Độ lặp lại petunidin 62

Bảng 3 21 Độ lặp lại pelargonidin 62

Bảng 3 22 Độ lặp lại malvidin 62

Bảng 3.23 Độ lặp lại peonidin 63

Bảng 3 24 Độ lặp lại cyanidin 63

Bảng 3 25 Hiệu suất thu hồi anthocyanidin 65

Bảng 3 26 Kết quả phân tích mẫu thực 68

v

DANH MỤC HÌNH

Hình 1 1 Cấu trúc cơ bản của anthocyanin 3

Hình 1.2 Cấu trúc cơ bản của anthocyanidin 4

Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của 6 anthocyanidin 5

Hình 1.4 Sự thay đổi cấu trúc hóa học của anthocyanidin theo pH 7

Hình 2.1 Sơ đồ xương cá tính độ không đảm bảo đo 28

Hình 3 1 Phổ hấp thụ phân tử của 6 anthocyanidin 31

Hình 3 2 Sắc đồ chuẩn hỗn hợp 6 anthocyanidin khi sử dụng gradient 1 32

Hình 3 3 Sắc đồ chuẩn hỗn hợp 6 anthocyanidin khi sử dụng gradient 2 33

Hình 3 4 Sắc đồ chuẩn hỗn hợp 6 anthocyanidin khi sử dụng gradient 3 34

Hình 3 5 Sắc đồ chuẩn hỗn hợp 6 anthocyanidin khi sử dụng gradient 4 35

Hình 3 6 Ảnh hưởng của nồng độ axit TFA đến tổng diện tích pic anthocyanidin 36 Hình 3 7 Sắc đồ chuẩn hỗn hợp 6 anthocyanidin tốc độ dòng 1 ml/phút 38

Hình 3 8 Ảnh hưởng khối lượng cân đến hàm lượng anthocyanidin 39

Hình 3 9 Mức độ ảnh hưởng các nhân tố khảo sát đến hàm lượng anthocyanidin 43 Hình 3 10 Tương quan giữa thực nghiệm và mô hình của hàm lượng anthocyanidin 47

Hình 3 11 Đồ thị mặt mục tiêu hàm lượng anthocyanidin theo nhiệt độ và nồng độ axit 48

Hình 3 12 Đường đồng mức hàm lượng anthocyanidin theo nhiệt độ và nồng độ axit 48

Hình 3 13 Sắc đồ thủy phân mẫu chuẩn tại điều kiện tối ưu trên LC/MS/MS 55

Hình 3 14 Sắc đồ mẫu trắng không chứa anthocyanidin 58

Hình 3 15 Sắc đồ chất chuẩn hỗn hợp 6 anthocyanidin 58

Hình 3 16 Sắc đồ thêm chuẩn hỗn hợp 6 anthocyanidin 58

Hình 3 17 Phổ tinh khiết 6 anthocyanidin 59

Hình 3 18 Khoảng tuyến tính của delphinidin từ 0,1 – 20ppm 60

Hình 3 19 Khoảng tuyến tính của Petunidin từ 0,1 – 20ppm 60

vi

DANH MỤC BẢNG VIẾT TẮT

AOAC Association of Official

Analytical Community

Hiệp hội các nhà hóa học phân tích

CCD Centre composite design Mô hình bậc hai tâm xoay

CE Cappillary electrophoresis Phương pháp điện di mao

quản CTAB Cetyltrimethylammonium

bromide

Xetyltrimetylammonium bromit

CZE Cappillary zone electrophoresis Điện di mao quản vùng

Ultraviolet -visible

Sắc kí lỏng hiệu năng với detector tử ngoại – khả kiến

HPLC-PDA High-Performance Liquid

Chromatography with Photo Diode Array detecter

Sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector diod quang

LC-MS/MS Liquid chromatography–mass

spectrometry –mass spectrometry

Sắc ký lỏng ghép nối khối phổ

LOD Limit of detection Giới hạn phát hiện

LOQ Limit of quantification Giới hạn định lượng

vii

MEKC Micellar electrokinetic

chromatography

Điện động học mixel

RSD (%) The relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối RSM Response Surface Methodology Phương pháp măt mục tiêu

SDS Sodium dodecyl sulfate Natri dodexyl sunphat TFA Trifluoroaxetic axit Axit Trifluoroaxetic

UPLC Ultra-Performance Liquid

Chromatography

Sắc ký lỏng siêu hiệu năng

UV – VIS Ultraviolet–visible Phương pháp phổ hấp thụ

phân tử

Hiện nay, trên thế giới các nghiên cứu định lượng anthocyanidin đang được quan tâm bởi các công trình công bố trước đây thường chỉ dừng lại ở tìm điều kiện tối ưu để chiết anthocyanin ra khỏi mẫu, khi tách các anthocyanin trên sắc kí gặp nhiều khó khăn, cần thời gian phân tích dài và cũng chỉ giới hạn trong việc định lượng một số anthocyanin phổ biến Số lượng công trình xác định anthocyanidin rất hạn chế, do quá trình thủy phân cắt mạch gốc đường có nhiều yếu tố ảnh hưởng và cần tìm được điều kiện tối ưu quá trình thủy phân để sự chuyển hóa hoàn toàn từ anthocyanin thành anthocyanidin mà không bị phân hủy Để tối ưu điều kiện thủy phân các nghiên cứu thường khảo sát ảnh hưởng đồng thời các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng chiết cho hiệu quả cao[25][28]

Ở Việt Nam, các công trình đã công bố chủ yếu xác định anthocyanin dạng tổng số bằng phương pháp UV-VIS [2],[3] Xác định anthocyanidin bằng phương pháp sắc kí còn hạn chế, các nghiên cứu tìm điều kiện tối ưu cho quá trình thủy phân được tiến hành theo hướng đơn biến [6],[4] Với mục tiêu nghiên cứu của đề tài là tách và xác định đồng thời 6 anthocyanidin trong mẫu rau củ quả Việt Nam, chúng

tôi thực hiện đề tài: “Tối ưu hóa các điều kiện định lượng một số anthocyanidin trong

rau củ quả bằng phương pháp sắc kí” với nội dung nghiên cứu như sau:

- Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách và xác định các anthocyanidin trên HPLC

3

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về anthocyanin và anthocyanidin

1.1.1 Giới thiệu về anthocyanin

Anthocyanin thuộc nhóm chất màu tự nhiên tồn tại trong thực vật bậc cao Anthocyanin được sử dụng làm chất màu tự nhiên trong thực phẩm tạo màu sắc đẹp mắt đồng thời chứa nhiều giá trị quý do có hoạt tính sinh học cao, có khả năng chống oxy hóa mạnh giúp ngăn chặn và tiêu diệt các gốc tự do, giúp con người ngăn chặn các bệnh lý về thần kinh, tim mạch, tiểu đường và đẩy lùi sự phát triển của tế bào ung thư…[9],[23]

Trong tự nhiên, anthocyanin có trong thực vật nhằm tạo những màu sắc đặc trưng từ màu đỏ, hồng, xanh, tím, cam, đen…Do vậy, con người có thể chiết các chất màu từ thực vật để nhuộm màu cho thực phẩm rất an toàn và có giá trị dinh dưỡng cao

Anthocyanin là những glycosides do gốc đường glucose, galactose, rutinose kết hợp với gốc aglycon có màu (anthocyanidin) Các anthocyanin khi mất hết nhóm đường được gọi là anthocyanidin hay aglycon Mỗi anthocyanidin có thể bị glycosyl hóa acylat bởi các loại đường và các axit khác tại các vị trí khác nhau Do đó, số lượng anthocyanin lớn hơn từ 15-20 lần so với anthocyanidin Cấu trúc cơ bản của anthocyanin được mô tả ở hình 1.1 Các gốc đường có thể gắn vào các vị trí 3,5,7 trong đó chủ yếu là vị trí 3 hoặc 5, vị trí 7 rất ít Sự đa dạng của anthocyanin là do sự gắn các nhóm H, OH, OCH3 và các nhóm đường vào các vị trí khác nhau

Hình 1 1 Cấu trúc cơ bản của anthocyanin

4

1.1.2 Cấu trúc hóa học của anthocyanidin

Anthocyanidins (aglycons) có dạng cấu trúc cơ bản của anthocyanin, cấu trúc hóa học chứa vòng thơm A liên kết với dị vòng C chứa oxy và được liên kết bởi liên kết cacbon – cacbon với vòng thơm B [21] Anthocyanidin thuộc nhóm các hợp chất flavonoid có khả năng tan trong dung môi phân cực như nước, metanol, ethanol…là dạng hợp chất polyhidroxyl và polymethoxy của 2 - phenylbenzopyrylium hoặc muối flavylium [19]

Hiện nay, có khoảng 17 anthocyanidin khác nhau đã được xác định nhưng chỉ

có 6 anthocyanidin phổ biến trong tự nhiên là cyanidin (Cya), delphinidin (Del), malvidin (Mal), petunidin (Petu), pelargonidin (Pelar) và peonidin (Peo) Trong tự nhiên, các anthocyanidin thường liên kết với các gốc đường khác nhau như glucose (Glu), galactose (Gal), arabinose (Ara), rutinose (Rut), rhamnose (Rham), xylose (Xyl) dưới dạng mono -, di - hoặc tri - glycoside [29] tạo thành 600 anthocyanin Dạng liên kết với gốc đường phổ biến nhất là 3 - monoside, 3 - bioside, 3,5 - diglucoside và 3,5 - diglucoside Dẫn xuất 3 - glucoside thường lớn hơn 2,5 lần dạng diglucoside, trong đó phổ biến nhất là cyanin - 3 - glucoside [9]

Cấu trúc cơ bản của anthocyanidin được mô tả trong hình 1.2 Sự khác nhau của các anthocyanidin do sự thay đổi nhóm H, OH và OCH3 gắn vào vị trí R1, R2

trong vòng thơm B

Hình 1.2 Cấu trúc cơ bản của anthocyanidin

Trong tự nhiên, các anthocyanidin phổ biến tồn tại trong thực vật là delphinidin, cyanidin, petunidin, pelargonidin, peonidin và malvidin Trong đó sự phân bố trong

6

1.1.3 Tính chất của anthocyanidin

Anthocyanidin là hợp chất có cấu trúc phân cực nên có khả năng tan tốt trong các dung môi phân cực như nước, metanol, etanol, không tan trong các dung môi không phân cực Dung môi chiết anthocyanidin được sử dụng phổ biến là metanol hoặc etanol và để tăng tính bền màu của anthocyanidin, người ta thường bổ sung một lượng nhỏ của axit hydrocloric, axit axetic, axit xitric, axit tartaic, axit trifluoroaxetic vào dung môi chiết [25] Do đó, hệ dung môi chiết thường dùng là CH3OH – HCl;

C2H5OH - HCl… Nhóm nghiên cứu Steven W Lloyd và cộng sự [20] đã so sánh khả năng chiết anthocyanin bằng hỗn hợp hệ dung môi của metanol được thêm các axit axetic, axit focmic, axit chlorhydric, axit photphoric cho thấy khi chiết bằng dung môi CH3OH - HCl có hiệu suất cao nhất

Tại Việt Nam, tác giả Nguyễn Thị Lan [3] cùng cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của dung môi chiết đến hàm lượng và độ màu của anthocyanin Các dung môi nghiên cứu gồm metanol - nước - HCl (tỉ lệ 1: 1,1% HCl), etanol - nước - HCl (tỉ lệ 1:1,1% HCl), nước - axit clorhydric (1%), nước - axit focmic (5%), nước - axit axetic (5%) trên đối tượng mẫu quả dâu Hội An thì hệ dung môi etanol - nước - HCl cho hàm lượng tổng anthocyanin 1,046%, với dung môi chiết metanol - nước - HCl là 0,949% Khả năng chiết bằng dung môi etanol - HCl và metanol - HCl cho hiệu quả chiết là cao nhất

Màu sắc của anthocyanidin thay đổi phụ thuộc vào pH môi trường, nhiệt độ, cấu trúc hóa học, nồng độ, dung môi…Trong đó cấu trúc hóa học bị thay đổi mạnh khi thay đổi pH dẫn tới sự thay đổi màu của anthocyanidin

Tại môi trường pH thấp khoảng pH = 3 anthocyanindin tồn tại dưới dạng cation flavylium có màu đỏ hoặc cam đậm Khi tăng pH cơ chế cạnh tranh xảy ra giữa phản ứng hydrat hóa của cation flavylium và phản ứng chuyển dịch proton trong nhóm hydroxyl, do đó phản ứng tạo carbinol giả làm mất màu của anthocyanindin tại

pH = 4 - 5 Sau đó, phản ứng làm chuyển về dạng quinon có màu tím tại pH = 6 - 7

và dạng cộng hưởng anion quinon có màu xanh tại pH = 7 - 8 Sự thay đổi màu sắc của anthocyanidin theo pH được thể hiện như hình 1.3

7

Hình 1.4 Sự thay đổi cấu trúc hóa học của anthocyanidin theo pH

Theo nghiên cứu A Castaneta – Ovando và cộng sự [9] khi thay đổi các dung dịch (axetonitril : nước, etanol, propilen - glycol, dioxane và 2 - butanone) màu tự nhiên của anthocyanindin bị thay đổi phụ thuộc vào nồng độ dạng muối flavylium Trong dung môi phân cực có màu đỏ nhưng trong dung môi ít phân cực tồn tại dạng màu vàng là do sự mono hóa hoặc dime hóa Do đó, khi nồng độ muối tăng màu đỏ

là màu nổi bật Trạng thái bền của anthocyanidin bị ảnh hưởng bởi sự xuất hiện thêm các nhóm OH hoặc OCH3 gắn vào vòng thơm B làm giảm tính bền của aglycon trong môi trường trung hòa, vì thế Pelargonidin là anthocyanindin bền nhất vì chỉ có 1 nhóm

OH Ngược lại, dạng anthocyanin có gắn các gốc đường monoglycoside và diglycoside là những dẫn xuất bền trong điều kiện trung tính Ngoài ra, mức độ metyl hóa các nhóm – OH của vòng benzen càng cao thì màu càng đỏ

Do khả năng phản ứng mạnh và dễ bị phân hủy, nên để bảo vệ độ bền màu và tính chất của anthocyanidin, chúng phải được bảo quản lạnh ở nhiệt độ 2 - 40C và tránh ánh sáng Sự phân hủy và mất màu tăng nhanh khi đun nóng ở nhiệt độ cao 65

- 900C trong vài giờ làm giảm 50% cường độ màu [35]

Các anthocyanidin có khả năng hấp thụ ánh sáng trong vùng khả kiến, cực đại hấp thụ trong khoảng bước sóng 510nm – 540nm Anthocyanidin được chiết trong môi trường axit mạnh có màu đỏ, cường độ màu phụ thuộc vào nồng độ và pH Nồng

8

độ của anthocyanidin càng lớn độ hấp thụ quang càng cao, dung dịch có màu đỏ sậm

do đó cực đại hấp thụ thường được thiết lập ở bước sóng 520nm

1.1.4 Tác dụng của anthocyanin

Trong thực vật, anthocyanin có tính kháng khuẩn, kháng nấm giúp thực vật tránh được một số bệnh nấm ở cây, do có màu sắc sặc sỡ thu hút động vật, chim và côn trùng nên thúc đẩy quá trình thụ phấn và phát tán phấn hoa Ngoài ra, anthocyanin

có khả năng hấp thụ mạnh tia tử ngoại nên có thể bảo vệ tế bào trong quá trình quang tổng hợp, giúp bảo vệ bộ gen của thực vật

Anthocyanin được chiết xuất từ tự nhiên được sử dụng làm các chất màu bổ sung vào thực phẩm và đồ uống tạo nên màu đẹp mắt cho sản phẩm đồng thời mang lại nhiều giá trị dinh dưỡng và các hoạt tính sinh học có lợi cho sức khỏe

Anthocyanin có nhiều hoạt tính sinh học quý như:

 Khả năng chống oxy hóa cao nên được sử dụng làm chất chống oxy hóa trong thực phẩm Các anthocyanidin được sử dụng để bảo quản thực phẩm làm bền chất béo, chống nấm mốc, kháng khuẩn, chống viêm [35]

 Khả năng chống oxy hóa lớn hơn vitamin E, vitamin C và  - caroten nên được

sử dụng làm chất chống lão hóa, chống lại sự suy giảm miễn dịch, suy giảm sức đề kháng [23]

 Anthocyanin được sử dụng rộng rãi trong y học do có khả năng giảm tính thấm thành mạch và tế bào nên có khả năng chống chảy máu

 Do có khả năng bắt các điện tử tự do nên anthocyanidin có khả năng chống lại

các tia bức xạ và các gốc tự do ·OH, ROO· … nên có khả năng ngăn cản sự

phát triển của một số tế bào ung thư, chống lại sự hủy hoại tế bào khi tiếp xúc với môi trường bức xạ [9]

 Đối với hệ thần kinh: hoạt tính của pelargonidin giúp ngăn chặn quá trình nitro hóa của tyrosin nên bảo vệ hệ thống thần kinh, chống xơ cứng động mạch

 Anthocyanin có thể ngăn cản quá trình xơ vữa động mạch, ngăn cản quá trình oxi hóa của lipoprotein mật độ thấp (low density lipoprotein, LDL, một loại

9

protein chứa cholesterol và chất béo trung tính trong huyết tương), giúp bảo

vệ tim mạch và chống stress oxy hóa

 Ngoài ra, anthocyanin đóng vai trò quan trọng giúp phòng và điều trị các bệnh

về mắt, cải thiện khả năng nhìn trong bóng tối, các bệnh về phổi và tiểu đường

1.1.5 Sự phân bố của anthocyanin trong thực vật

Trong tự nhiên, anthocyanin được tìm thấy chủ yếu trong thực vật bậc cao, tuy nhiên có một lượng nhỏ được tìm thấy trong thực vật bậc thấp trong rêu và dương xỉ Anthocyanin tồn tại trong các bộ phận lá, hoa, quả làm cho thực vật có màu sặc sỡ, trong đó 80% được tìm thấy trong lá có màu, 69% trong quả, 50% trong hoa là dẫn xuất glucoside của cyanidin, delphinidin, pelargonidin [9]

Trong các chất màu được sử dụng trong thực phẩm thì anthocyanin là chất màu được sử dụng phổ biến Chất màu anthocyanin được chiết từ một số rau, củ, quả,

lá, hạt và hoa của một số loài như: quả họ berri, họ cherry, quả nho, quả nhiệt đới, quả mận, đỗ đen, cà chua tím, bắp cải tím, cà tím, dâu tây, lá tía tô, ngô, cà rốt tím, khoai tây, thanh mai…Hàm lượng anthocyanin trong rau, củ, quả từ 0,1% - 1,0% tính theo khối lượng chất khô

1.2.1 Phương pháp điện di mao quản

Nguyên tắc phương pháp điện di mao quản: các chất phân tích được đặt trong ống mao quản hẹp trong điện trường, do sự linh động điện di của các ion khác nhau nên các chất di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau Ưu điểm của phương pháp là độ phân giải cao, lượng mẫu tiêu tốn ít nên lượng dung môi thải ít,

do đó chi phí thấp

10

Để phân tích các anthocyanin, mẫu được đưa vào mao quản phía anot và pha động sẽ làm di chuyển các cấu tử của mẫu hướng về phía catot trong khi các cấu tử khác được giữ lại tại anot

Phương pháp điện di mao quản thường sử dụng để tách anthocyanin, sự di chuyển của các chất phụ thuộc vào tỉ lệ điện tích và kích thước, thời gian di chuyển của các hạt điện tích dương và kích thước nhỏ nhiều hơn phân tử có điện tích nhỏ kích thước lớn

P Bridle [26] đã xác định 6 anthocynin bằng phương pháp điện di mao quản vùng (CZE) là malvidin - 3,5 - diglucoside, pelargonidin - 3 - glucoside, malvidin -

3 - glucoside, cyanidin - 3 - rutinoside, cyanidin - 3 - glucoside, delphinidin - 3 - glucoside Anthocyanin được hòa tan trong hỗn hợp đệm phosphat pH = 2,5 và metanol (3:1) Dung dịch được bơm vào mao quản silica dài 50cm đường kính 75µm tại nhiệt độ 250C môi trường đệm natri tetraborat 150mM có pH = 8 sử dụng detector diode – array tại bước sóng 580nm và áp điện thế cao 25kV các anthocynin được tách trong thời gian 10 phút

Phương pháp điện di mao quản vùng (CZE) được thực hiện trong môi trường bazơ làm cho các anthocyanin kém bền vì vậy để tăng độ bền của chất phân tích cần chuyển sang môi trường axit cho anthocyanin tồn tại dưới dạng cation flavylium Trong môi trường axit anthocyanin sẽ di chuyển về anot ngược với dòng điện di

Caboni và Patrizia Comandini [13] đã xác định ba anthocyanin pelargonidin -

3 - glucoside, pelargonidin - 3 - rutinoside và cyanidin - 3 - glucoside trong dịch chiết quả dâu tây bằng phương pháp điện di mao quản vùng và so sánh kết quả với phương pháp sắc kí lỏng Trong nghiên cứu này tác giả sử dụng dung dịch đệm axit có pH = 1,4 để giữ màu bền của cation flavylium có bước sóng hấp thụ cực đại tại 280nm Điều kiện đo: điện thế 23 kV, nhiệt độ mao quản 250C, chiều dài mao quản 45cm, thời gian phân tích nhanh 22 phút cả ba chất tách nhau hoàn toàn, lượng mẫu tiêu tốn

ít Phương pháp sắc kí lỏng (HPLC) sử dụng detector mảng diod đặt bước sóng đo 520nm có thời gian phân tích 60 phút Tuy nhiên, phương pháp điện di có giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng cao hơn 10 lần so với phương pháp sắc kí Phương

11

pháp điện di mao quản vùng (CZE) có giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của pelargonidin - 3- glucoside lần lượt là 2,06 và 6,87mg/L trong khi phương pháp sắc kí lỏng có LOD và LOQ lần lượt là 0,04 và 0,13mg/L Kết quả phân tích mẫu dâu tây bằng hai phương pháp cho thấy hàm lượng pelargonidin - 3 - glucoside theo phương pháp điện di là 11,41mg/L, phương pháp sắc kí là 11,37mg/L

Một số nghiên cứu khác [35] tác giả sử dụng chất hoạt động bề mặt cation cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) hoặc sodium dodecyl sulfate (SDS) trong môi trường đệm phosphate hoặc đệm phosphate – borate để xác định anthocyanidin theo phương pháp điện di điện động học micel (MEKC) với detector UV - VIS

1.2.2 Phương pháp phổ hấp thụ phân tử UV - VIS

Nguyên lí của phương pháp dựa trên sự thay đổi độ màu của anthocyanin tại các pH khác nhau Tại pH = 1,0 các anthocyanin tồn tại ở trạng thái oxonium hoặc flavylium có màu đỏ và cường độ màu là cực đại, tại pH = 4,5 chúng chuyển cấu trúc

và tồn tại dưới dạng carbinol không màu Từ sự khác nhau về độ hấp thụ quang tại bước sóng 520nm tại pH = 1 và pH = 4,5 tính được nồng độ của anthocyanin trong mẫu

AOAC [8] đã ban hành tiêu chuẩn xác định tổng hàm lượng chất màu anthocyanin trong nước uống, nước hoa quả, rượu và đồ uống theo phương pháp pH

vi sai trong khoảng nồng độ từ 20 – 3000mg/L tính theo cyanidin – 3 – glucoside, các đối tượng mẫu được pha loãng trong các dung dịch đệm và đo quang trực tiếp tại bước sóng 520nm

Nhóm nghiên cứu của Nguyễn Thị Hiển [2] và cộng sự đã nghiên cứu chiết chất màu anthocyanin trong đài bụp giấm bằng phương pháp so màu và phương pháp

pH vi sai, tìm được điều kiện tối ưu quá trình chiết chất màu là dung môi ethanol:nước

tỉ lệ 50:50 được axit hóa HCl 1%, tỉ lệ dung môi/nguyên liệu là 14ml/1g, thời gian chiết 6 ngày, ở nhiệt độ phòng Chất màu thô anthocyanin từ dịch chiết đài bụp giấm

và xác định hàm lượng chất màu trong nguyên liệu khô là 15,2%, trong nguyên liệu tươi là 1,06%

12

Nhóm nghiên cứu Huỳnh Thị Kim Cúc [1] và cộng sự đã xác định hàm lượng anthocyanin tổng trong một số nguyên liệu rau, quả (quả dâu, bắp cải tím, lá tía tô, trà đỏ, vỏ quả nho, vỏ quả cà tím) bằng phương pháp pH vi sai Hàm lượng anthocyanin trong quả dâu là 1,188%, bắp cải tím 0,909%, lá tía tô 0,397%, trà đỏ 0,335%, vỏ quả nho 0,564%,vỏ cà tím 0,441%

Tác giả Nguyễn Thị Lan [3] và cộng sự đã khảo sát hệ dung môi chiết axit formic, axit acetic và axit hydrochloric trong metanol hoặc ethanol và tìm được dung môi tối ưu để chiết là ethanol: nước tỉ lệ 1:1 (với 1% HCl) để tách chất màu anthocyanin từ quả dâu Hội An Hàm lượng anthocyanin thô được xác định bằng phương pháp pH vi sai đo độ hấp thụ quang cực đại của mẫu ở pH = 1 và pH = 4,5 tại bước sóng có độ hấp thụ cực đại 515nm và so với độ hấp thụ tại bước sóng 700nm (độ đục của mẫu) Hàm lượng anthocyanin thu được trong quả dâu là 1,047%

Steven W Lloyd [20] và cộng sự đã cải tiến phương pháp phân tích anthocyanidin trong quả việt quất bằng phương pháp mặt mục tiêu để tìm điều kiện tối ưu của quá trình thủy phân anthocyanin thành anthocyanidin Thí nghiệm được thiết kế theo mô hình bậc hai tâm xoay (central composite design CCD) dựa trên ba yếu tố có ảnh hưởng lớn đến quá trình thủy phân là nhiệt độ thủy phân, thời gian thủy phân và nồng độ axit trong metanol Để tìm được điều kiện biên cho quá trình tối ưu hóa thực nghiệm, nhóm nghiên cứu đã khảo sát đơn biến các yếu tố bao gồm: phương pháp thủy phân, loại axit trong dung môi chiết, thời gian thủy phân Kết quả khảo sát phương pháp thủy phân trong bình kín và phương pháp chưng cất hồi lưu cho hàm lượng anthocyanidin khác nhau không có ý nghĩa Trong 4 axit được khảo sát là axit acetic, axit formic, axit hydrochloric và axit photphoric cho thấy axit hydrochloric cho hiệu suất thủy phân là lớn nhất Khi khảo sát thời gian thủy phân, nếu thủy phân trên 100 phút xuất hiện hiện tượng giảm diện tích pic của Mavidin trong nước ép quả việt quất Qua thống kê kết quả báo cáo của 25 bài báo về điều kiện thủy phân anthocyanidin trong rau, quả và nước uống, từ đó nhóm nghiên cứu đưa ra mô hình thực nghiệm khảo sát đồng thời sự phụ thuộc của nhiệt độ từ 80 – 1200C, thời gian

20 – 60 phút và nồng độ HCl từ 1 – 3M, cánh tay đòn α = 1,68 Với 32 thí nghiệm được thiết kế và thực nghiệm theo mô hình kết quả tối ưu điều kiện chiết mẫu ở nồng

độ axit HCl 3,7M trong metanol, nhiệt độ thủy phân ở 990C trong thời gian 6,4 phút Những yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất thủy phân bao gồm ảnh hưởng bậc nhất của thời gian, nồng độ axit và ảnh hưởng bậc hai của nồng độ axit, nhiệt độ, ảnh hưởng tương hỗ của nhiệt độ với thời gian, nhiệt độ với nồng độ axit Mẫu sau thủy phân

14

được phân tích trên UPLC với detector UV hấp thụ bước sóng cực đại 525nm, pha động axit photphoric 3% và acetonitril có 5 anthocyanidin là delphinidin, cyanidin, petunidin, peonidin và malvidin được phát hiện trong quả berry

N Annika Nyman [25] đã xác định 6 anthocyanidin phổ biến có trong rượu vang đỏ và quả họ berri như dâu tây, quả việt quất rừng, quả lí chua đen Quá trình thủy phân cắt các gốc đường của anthocyanin được thực hiện trong axit HCl 2M trong metanol ở nhiệt độ 900C trong 50 phút, sau đó phân tích trên HPLC/DAD đã xác định được hiệu suất thủy phân dạng aglycon từ 95 -102% và 69 – 104% từ dạng glucoside Hàm lượng anthocyanidin có chứa trong quả dâu tây 23,8 ± 0,4 mg/100g, quả lí chua đen 135,0 ± 3,0 mg/100g, quả việt quất rừng 360,0 ± 3,0 mg/100g, rượu vang cabernet 26,1 ± 0,1 mg/100mL

Carina Pinho [28] và cộng sự đã tối ưu hóa điều kiện thủy phân rượu vang đỏ bằng phương pháp mặt mục tiêu Dạng aglycon của anthocyanins được định lượng bằng HPLC/DAD Ba biến ảnh hưởng là nồng độ HCl, nhiệt độ và thời gian thủy phân được thiết kế thí nghiệm theo mô hình bậc hai tâm xoay gồm 20 thí nghiệm Điều kiện tối ưu quá trình thủy phân tìm được ở nhiệt độ 166,20C, dung môi thủy phân 9,8mL HCl 32% trong metanol với thời gian thủy phân 46,6 phút Ảnh hưởng đáng kể của bậc nhất các yếu tố, ảnh hưởng bậc hai của nhiệt độ, thời gian và ảnh hưởng tương hỗ của nhiệt độ với thời gian đến quá trình thủy phân các anthocyanin thành anthocyanidin Trong mẫu rượu vang đỏ phát hiện 5 anthocyanidin là delphinidin 23,4 ± 0,9mg/L, cyanidin 35,9 ± 2,1mg/L, petunidin 21,8 ± 0,8mg/L, peonidin 29,0 ± 1,1mg/L và malvidin 112,8 ± 2,4mg/L Độ thu hồi của phương pháp

từ 86 – 95%

Jeremy S Barnes [11] và cộng sự đã chiết và định lượng anthocyanin từ quả việt quất bằng phương pháp sắc kí lỏng khối phổ chế độ phun điện tử theo thời gian bay (HPLC – ESI – IT – TOF – MS) và HPLC – UV Mẫu được chiết trong dung môi metanol : nước : Trifluoroaxetic axit (70:30:1, v/v/v) và xác định hàm lượng bằng phương pháp HPLC detector UV tại bước sóng 520nm Anthocyanin được rửa giải theo hai phương pháp, phương pháp 1 dùng dung môi pha động kênh A gồm hỗn hợp

và tỉ lệ chất khô từ 1:15 – 1:35 Khảo sát ảnh hưởng đồng thời các yếu tố theo mô hình Box – Behnken với 17 thí nghiệm đạt hiệu suất cao nhất 158mg/100g tại 800C, thời gian chiết 60 phút tỉ lệ chất khô 1:32 Bằng phương pháp mặt mục tiêu nhận thấy

có sự ảnh hưởng tương hỗ của nhiệt độ chiết và tỉ lệ chất khô

1.3 Qui hoạch hóa thực nghiệm tìm điều kiện tối ưu quá trình thủy phân

Anthocyanin bao gồm một cation flavylium (anthocyanidin) liên kết với một hoặc nhiều phân tử đường khác nhau Gần 600 anthocyanin đã được ghi nhận nên việc phân tích sắc kí tạo ra số lượng lớn các píc và khó để định lượng riêng từng anthocyanin Để đơn giản hóa, người ta thường thủy phân các anthocyanin thành anthocyanidin và phân tích 6 anthocyanidin phổ biến (gồm: cyanidin, delphinidin, petunidin, peonidin, pelargonidin và malvidin)

Hiện nay, ở nước ta các công trình đã công bố thường tìm điều kiện tối ưu để thủy phân anthocyanin thành anthocyanidin theo phương pháp đơn biến Nhược điểm của phương pháp là chỉ biến đổi một biến trong khi giữ cố định giá trị các biến còn lại nên số thí nghiệm cần thực hiện nhiều, trong nhiều trường hợp không phản ánh đúng thực nghiệm khi có sự tương tác giữa các biến

Các công trình nghiên cứu đã công bố về điều kiện thủy phân anthocyanin thành anthocyanidin trong rau, hoa, quả và đồ uống được thực hiện theo hai phương pháp là gia nhiệt hồi lưu hoặc gia nhiệt trong hệ kín Trong đó có ba yếu tố chính ảnh hưởng đến hiệu suất thủy phân là nhiệt độ, thời gian và nồng độ axit Điều kiện tối

16

ưu của quá trình thủy phân được công bố rất khác nhau: nhiệt độ thủy phân trong khoảng 75 – 1660C, thời gian thủy phân từ 30 phút – 5 giờ, nồng độ axit trong khoảng 1,1N – 3N Bảng 1.1 trình bày các điều kiện khác nhau để thủy phân anthocyanin trong một số đối tượng

Bảng 1 1 Một số điều kiện thủy phân anthocyanin

Nguồn tham khảo Nền mẫu

HCl (M)

Nhiệt

độ ( 0 C)

Thời gian (phút)

Nyman [25] Dâu tây, rượu vang, quả

Merken [24] Việt quất, hành, dâu tây 1,8 75 300

Nhằm tránh các hạn chế của phương pháp đơn biến, một số công trình trên thế giới đã sử dụng phương pháp quy hoạch thực nghiệm theo mô hình hồi quy đa biến

để tìm điều kiện tối ưu quá trình thủy phân [28],[22],[14],[17]…Các nghiên cứu chủ yếu sử dụng phương pháp mặt mục tiêu (RSM) để mô hình hóa, tìm điều kiện tối ưu

và đánh giá ảnh hưởng các yếu tố Phương pháp mặt mục tiêu có ưu điểm: đánh giá

độ và nồng độ axit

Trong tự nhiên các anthocyanidin thường liên kết với các gốc đường khác nhau tạo thành hơn 600 anthocyanin, để tách và định lượng được các anthocyanin là rất khó khăn do thiếu chất chuẩn và trùng thời gian lưu Để đơn giản quá trình phân tích, chúng tôi tiến hành thủy phân để cắt toàn bộ gốc đường chuyển thành 6 anthocyanidin

cơ bản bao gồm (delphinidin, cyanidin, petunidin, pelargonidin, peonidin và malvidin) Do vậy, quá trình thủy phân mẫu phải đạt hiệu suất chuyển hóa tối đa, chất phân tích không bị phân hủy hoặc chuyển hóa không hoàn toàn

Nhằm mục đích khảo sát đồng thời ảnh hưởng 3 yếu tố là nhiệt độ, thời gian

và nồng độ axit trong metanol khi tiến hành thủy phân các anthocyanin trong hệ kín, chúng tôi sử dụng phương pháp mặt mục tiêu theo mô hình bậc hai tâm xoay để tìm điều kiện tối ưu và đánh giá ảnh hưởng các yếu tố khảo sát

18

CHƯƠNG 2 – THỰC NGHIỆM 2.1 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất

- Thiết bị quang phổ hấp thụ phân tử UV – VIS Shimadzu

- Cột sắc kí Xbridge® BEH C18 (100 mm x 4,6 mm x 2,6 µm) và tiền cột tương ứng

- Cột sắc kí Sun Fire hãng Waters C18 (250mm × 4,6mm × 5µm) và tiền cột tương ứng

- Cân phân tích Mettler Toledo AL204 có độ chính xác d = ± 0,0001 g

- Máy đo pH: pH Meter 744

- Máy lắc vortex VELP

- Máy xay Philips 600W

- Máy cất quay chân không EYELA, Nhật Bản

- Máy rung siêu âm ELMA

19

Delphinidin chloride ≥ 95%, Cyanidin chloride ≥ 95%, Pelargonidin chloride ≥ 97%, Peonidin chloride ≥ 97%, Malvidin chloride ≥95% được cung cấp bởi hãng Sigma - Aldrich Petunidin chloride ≥ 95% được cung cấp từ Chromadex

 Chất chuẩn anthocyanin

Pelargonidin - 3 - O - glucoside ≥ 95%, Cyanidin - 3 - O - glucoside ≥ 97%, Peonidin - 3 - O - glucoside ≥ 97% và Malvidin - 3 - O - glucoside ≥ 97% được cung cấp từ hãng Sigma - Aldrich

 Cách pha dung dịch chuẩn anthocyanidin

- Dung dịch chất chuẩn gốc delphinidin chloride: 1mg chất chuẩn Delphinidin

chloride được hòa tan trong dung môi HCl 0,1%/ MeOH rồi chuyển toàn bộ vào bình định mức 10,00 ml sau đó thêm dung môi trên tới vạch ở nhiệt độ phòng, lắc kỹ thu được dung dịch chuẩn Delphinidin 100ppm và bảo quản ở điều kiện lạnh (-20oC); trong bóng tối

- Dung dịch chất chuẩn gốc cyanidin chloride: 1mg chất chuẩn Cyanidin

chloride được hòa tan trong dung môi HCl 0,1%/ MeOH rồi chuyển toàn bộ vào bình định mức 10,00 ml sau đó thêm dung môi trên tới vạch ở nhiệt độ phòng, lắc kỹ thu được dung dịch chuẩn Cyanidin 100ppm và bảo quản ở điều kiện lạnh (-20oC); trong bóng tối

- Dung dịch chất chuẩn gốc petunidin chloride: 1mg chất chuẩn petunidin

chloride được hòa tan trong dung môi HCl 0,1%/ MeOH rồi chuyển toàn bộ vào bình định mức 10,00 ml sau đó thêm dung môi trên tới vạch ở nhiệt độ phòng, lắc kỹ thu được dung dịch chuẩn petunidin 100ppm và bảo quản ở điều kiện lạnh (-20oC); trong bóng tối

- Dung dịch chất chuẩn gốc pelargonidin chloride: 5mg chất chuẩn pelargonidin

chloride được hòa tan trong dung môi HCl 0,1%/ MeOH rồi chuyển toàn bộ vào bình định mức 50,00 ml sau đó thêm dung môi trên tới vạch ở nhiệt độ phòng, lắc kỹ thu được dung dịch chuẩn pelargonidin 100ppm và bảo quản ở điều kiện lạnh (-20oC); trong bóng tối

20

- Dung dịch chất chuẩn gốc peonidin chloride: 1mg chất chuẩn peonidin

chloride được hòa tan trong dung môi HCl 0,1%/ MeOH rồi chuyển toàn bộ vào bình định mức 10,00 ml sau đó thêm dung môi trên tới vạch ở nhiệt độ phòng, lắc kỹ thu được dung dịch chuẩn peonidin 100ppm và bảo quản ở điều kiện lạnh (-20oC); trong bóng tối

- Dung dịch chất chuẩn gốc malvidin chloride: 1mg chất chuẩn malvidin

chloride được hòa tan trong dung môi HCl 0,1%/ MeOH rồi chuyển toàn bộ vào bình định mức 10,00 ml sau đó thêm dung môi trên tới vạch ở nhiệt độ phòng, lắc kỹ thu được dung dịch chuẩn malvidin 100ppm và bảo quản ở điều kiện lạnh (-20oC); trong bóng tối

 Pha dung dịch chuẩn anthocyanin

- Mẫu chuẩn cyanidin - 3 - O - glucoside: 1mg chất chuẩn cyanidin - 3 - O -

glucoside được hòa tan trong dung môi MeOH rồi chuyển toàn bộ vào bình định mức 10,00 ml sau đó thêm dung môi trên tới vạch ở nhiệt độ phòng, lắc

kỹ thu được dung dịch chuẩn cyanidin - 3 - O - glucoside 100ppm và bảo quản

ở điều kiện lạnh (-20oC); trong bóng tối

- Mẫu chuẩn pelargonidin - 3 - O - glucoside: 1mg chất chuẩn pelargonidin - 3

- O - glucoside được hòa tan trong dung môi MeOH rồi chuyển toàn bộ vào bình định mức 10,00 ml sau đó thêm dung môi trên tới vạch ở nhiệt độ phòng, lắc kỹ thu được dung dịch chuẩn pelargonidin - 3 - O - glucoside 100ppm và bảo quản ở điều kiện lạnh (-20oC); trong bóng tối

- Mẫu chuẩn peonidin - 3 - O - glucoside: 1mg chất chuẩn peonidin - 3 - O -

glucoside được hòa tan trong dung môi MeOH rồi chuyển toàn bộ vào bình định mức 10,00 ml sau đó thêm dung môi trên tới vạch ở nhiệt độ phòng, lắc

kỹ thu được dung dịch chuẩn peonidin - 3 - O - glucoside 100ppm và bảo quản

ở điều kiện lạnh (-20oC); trong bóng tối

- Mẫu chuẩn malvidin - 3 - O - glucoside: 1mg chất chuẩn malvidin - 3 - O -

glucoside được hòa tan trong dung môi MeOH rồi chuyển toàn bộ vào bình định mức 10,00 ml sau đó thêm dung môi trên tới vạch ở nhiệt độ phòng, lắc

21

kỹ thu được dung dịch chuẩn malvidin - 3 - O - glucoside 100ppm và bảo quản

ở điều kiện lạnh (-20oC); trong bóng tối

 Hóa chất dung môi khác

- Axit clorhidric (HCl) Merck, Đức

- Axit formic (FA) Merck, Đức

- Axit trifluoroaxetic (TFA) Merck, Đức

- Metanol (MeOH) Merck, Đức

- Axetonitril (ACN) Merck, Đức

- Các dung dịch pha động axit formic 0,05%, 0,1%

- Dung dịch pha động axit trifuoroacetic 0,05%, 0,1%, 0,15%

 Cách pha dung dịch pha động

- Axit formic (FA) 0,05%: Hút chính xác 505µL axit formic nồng độ 99% định mức thành 1L bằng nước cất hai lần, đậy nắp và đảo đều dung dịch

- Axit formic (FA) 0,1%: Hút chính xác 505µL axit formic nồng độ 99% định mức thành 500mL bằng nước cất hai lần, đậy nắp và đảo đều dung dịch

- Axit trifluoroaxetic (TFA) 0,05%: Hút chính xác 505µL axit trifuoroacetic nồng

độ 99% định mức thành 1L bằng nước cất hai lần, đậy nắp và đảo đều dung dịch

- Axit trifluoroaxetic (TFA) 0,1%: Hút chính xác 1mL axit trifuoroacetic nồng độ 99% định mức thành 1L bằng nước cất hai lần, đậy nắp và đảo đều dung dịch

- Axit trifluoroaxetic (TFA) 0,15%: Hút chính xác 758µL axit trifuoroacetic nồng

độ 99% định mức thành 500mL bằng nước cất hai lần, đậy nắp và đảo đều dung dịch

- Các dung dịch pha động sau khi pha được lọc qua màng lọc dung môi kích thước 0,2µm và rung siêu âm để loại bọt khí

2.2 Mẫu phân tích

Đối tượng mẫu phân tích là các loại rau, củ, quả được mua trên địa bàn Hà Nội, Đà Lạt, Bắc Giang (bắp cải tím, đỗ đen, đậu bắp tím, ngô tím, bụp giấm, khoai lang tím, hành tây tím, rau chua, nho tím, nho đen…) Mẫu được lấy theo phương pháp ngẫu nhiên khối lượng từ 100 – 500g/ mẫu Mẫu phân tích được đồng nhất bằng

22

cách cắt nhỏ và xay, nghiền mịn bằng máy xay Mẫu sau khi đồng nhất được bảo quản trong túi đựng mẫu ở nhiệt độ - 200C

Mẫu chuẩn: mẫu chuẩn anthocyanin được cung cấp bởi hãng Sigma – Aldrich

Mẫu thêm chuẩn: Để đánh giá hiệu suất thu hồi của phương pháp phân tích, tiến hành thêm chuẩn các anthocyanin vào nền mẫu thực và thủy phân mẫu tại điều kiện tối ưu

2.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Nội dung nghiên cứu

Với mục tiêu tách và xác định đồng thời 6 anthocyanidin trong mẫu rau củ quả ở Việt Nam, chúng tôi thực hiện các nội dung nghiên cứu sau:

- Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách và xác định anthocyanidin trên

hệ thống sắc kí lỏng HPLC với detector PDA

- Nghiên cứu tìm điều kiện tối ưu của quy trình thủy phân anthocyanin thành anthocyanidin từ rau, củ, quả bằng khảo sát ảnh hưởng đồng thời các yếu tố: nhiệt

độ, thời gian và nồng độ axit HCl trong metanol

- Đánh giá hàm lượng anthocyanidin trong một số mẫu rau, củ, quả ở Việt Nam

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu

Để thực hiện nội dung của đề tài, chúng tôi lựa chọn phương pháp sắc kí lỏng HPLC với detector PDA để tách và xác định 6 anthocyanidin

Phương pháp sắc kí lỏng cho phép tách và định lượng riêng từng chất dựa vào thời gian lưu và bước sóng hấp thụ Đây là phương pháp phân tích đồng thời, có độ chọn lọc, độ chính xác cao, chi phí thấp hơn rất nhiều so với phương pháp sắc kí lỏng khối phổ, độ nhạy đáp ứng phân tích các anthocyanidin

 Khảo sát khả năng tách các anthocyanidin bằng phương pháp HPLC Khả năng tách các anthocyanidin bằng HPLC phụ thuộc vào nhiều yếu tố như loại cột tách, chương trình gradient, loại pha động và nồng độ dung môi pha động, tốc độ dòng…Vì vậy chúng tôi lần lượt khảo sát các yếu tố trên khi giữ cố định nhiệt

độ lò cột 400C

- Loại cột tách: do các anthocyanidin là các chất phân cực trung bình do vậy cột tách được lựa chọn là cột ít phân cực C18 Với điều kiện phòng thí nghiệm hiện

23

có hai cột Sun Fire hãng Waters C18 (250mm × 4,6mm × 5µm) và cột tách Xbridge® BEH hãng Waters C18 (100 mm x 4,6 mm × 2,6 µm)

- Thành phần pha động: thành phần pha động là yếu tố quan trọng để rửa giải

và tách các anthocyanidin ra khỏi nhau, đồng thời ảnh hưởng đến độ nhạy của tín hiệu phân tích Dung môi pha động là các chất phân cực, cố định kênh B acetonitril, khảo sát pha động kênh A là axit formic 0,1% hoặc axit trifluoroaxetic 0,1% trong nước Điều kiện sắc kí cố định tốc độ dòng 1ml/phút, cột sắc kí Sun Fire hãng Waters

C18 (250mm × 4,6mm × 5µm)

- Khảo sát chương trình gradient: do các chất trong nhóm anthocyanidin có độ phân cực khác nhau khi rửa giải theo isocractic các chất tách khỏi nhau nhưng các pic bị tù, tín hiệu píc thấp nên để tách riêng các chất và tăng độ nhạy tín hiệu cần thay đổi tỉ lệ hai kênh tại các mốc thời gian theo chương trình gradient

- Khảo sát nồng độ axit trong pha động: giữ tỉ lệ kênh B tại các mốc thời gian theo chương trình gradient từ 0 – 20 phút tăng từ 17 – 20% ACN, từ 20,01 – 30 phút giữ 17% ACN, tốc độ dòng 1ml/ phút, thay đổi nồng độ axit trifluoroaxetic từ 0,05%

- 0,15%

- Khảo sát tốc độ dòng: giữ cố định nồng độ axit trifluoroaxetic 0,1%, theo chương trình gradient từ 0 – 20 phút tăng từ 17 – 20% ACN, từ 20,01 – 30 phút giữ 17% ACN, thay đổi tốc độ dòng từ 0,8 – 1,2 ml/phút

 Tối ưu hóa điều kiện thủy phân anthocyanin thành anthocyanidin theo phương pháp mặt mục tiêu (RSM)

Phương pháp mặt mục tiêu là tập hợp các kĩ thuật toán học và thống kê sử dụng mô hình hóa và phân tích khi hàm mục tiêu chịu ảnh hưởng của nhiều biến độc lập Trong phương pháp này, mối quan hệ giữa hàm mục tiêu và biến độc lập chưa xác định trước, vì vậy bước đầu là xác định mối quan hệ gần đúng giữa hàm mục tiêu

và các biến theo mô hình Từ phương trình hồi quy tìm được sử dụng phương pháp đạo hàm theo từng biến và cho bằng 0 để tìm điều kiện tối ưu

Trên thế giới phương pháp mặt mục tiêu đã được sử dụng để tìm điều kiện tối

ưu cho quá trình chiết anthocyanidin trong quả anh đào dại [30], quả đủng đỉnh [14],

24

khoai tây tím [15] Các điều kiện tối ưu đã được công bố rất khác nhau nhưng có ba yếu tố ảnh hưởng chính là nhiệt độ, thời gian và nồng độ axit HCl dung môi MeOH Qua tham khảo các tài liệu [4], [6], [20], [28], chúng tôi xác định giới hạn và mức cơ

sở các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân như Bảng 2.1

Bảng 2.1 Mức cơ sở các yếu tố ảnh hưởng

Mức dưới (- 1)

Mức trên ( + 1)

Số thí nghiệm của ma trận bậc 2 tâm xoay được tính theo công thức:

25

Sử dụng phần mềm Minitab 17 để xây dựng ma trận thực nghiệm, xác định giá trị hàm mục tiêu (Y1) và (Y2), tìm phương trình hồi qui và đánh giá mức độ ảnh hưởng các yếu tố khảo sát đến hàm lượng anthocyanidin Sau khi có phương trình hồi qui, dựa vào hàm này để tìm điều kiện tối ưu quá trình thủy phân bằng cách lấy đạo hàm theo từng biến và hàm cho bằng 0

 Hiệu suất thủy phân anthocyanin thành anthocyanidin

Hiệu suất thủy phân là thông số để đánh giá mức độ chuyển hóa anthocyanin thành anthocyanidin Quá trình thủy phân cần đạt hiệu suất tối đa, các anthocyanin được chuyển hóa hoàn toàn thành các anthocyanidin tương ứng Bằng cách thủy phân hỗn hợp mẫu chuẩn anthocyanin bao gồm: (cyanidin - 3 - O - glucoside, pelargondin

- 3 - O - glucoside và malvidin - 3 - O - glucoside) nồng độ 3ppm ở điều kiện tối ưu Sau đó xác định các anthocyanidin trên HPLC, hiệu suất thủy phân tính theo công thức (2.1)

.100%

C

CHt

i

 (2.1) Trong đó: H là hiệu suất thủy phân

Ci: nồng độ anthocyanidin thứ i tìm được sau thủy phân

Ct : nồng độ anthocyanidin tính theo lí thuyết từ anthocyanin

2.4 Đánh giá kết quả phương pháp phân tích

2.4.1 Xây dựng khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng

- Chuẩn bị dung dịch chuẩn:

Dung dịch chuẩn gốc: là dung dịch chuẩn của từng anthocyanidin và anthocyanin nồng độ 100ppm

Dung dịch chuẩn làm việc: hút chính xác thể tích dung dịch chuẩn gốc và thêm dung môi axit HCl 0,1% trong MeOH vào vial 2ml để thành dung dịch chuẩn hỗn hợp 6 anthocyanindin có nồng độ 0,1 – 20ppm

- Xây dựng đường chuẩn, khoảng tuyến tính:

Để xây dựng đường chuẩn lần lượt bơm vào hệ thống sắc kí các điểm nồng độ

từ 0,1 – 20(µg/mL) Từ nồng độ và diện tích pic của các chất, xây dựng đường chuẩn

có nồng độ nhỏ dần vào dịch chiết mẫu trắng và phân tích trên HPLC cho đến khi thu được tỉ lệ S/N khoảng 3 là LOD và S/N khoảng 10 là LOQ

2.4.2 Xử lí số liệu thực nghiệm

 Độ lặp lại

Độ lặp lại để chỉ mức độ gần nhau của các giá trị riêng lẻ xi của các lần đo lặp lại Độ chụm của phương pháp được đánh giá bằng cách khảo sát độ lặp lại của hàm lượng các anthocyanidin thông qua độ lệch chuẩn tương đối của thí nghiệm lặp lại từ

3 - 4 lần trên nền mẫu thực: đỗ đen, khoai lang tím, bắp cải tím, ngô tím, dâu tây

Giá trị trung bình của n lần đo

n

x x



 1 (2.2)

Phương sai:

11

n

i i

n

i i

100

x S

27

hồi quy mới có nghĩa Bằng phần mềm MINITAB 17 để xử lí số liệu tìm được mức

độ ảnh hưởng các yếu tố khảo sát đến hàm mục tiêu Những yếu tố có trị số P < 0,05

là yếu tố ảnh hưởng có nghĩa [5]

 Hiệu suất thu hồi

Hiệu suất thu hồi (độ thu hồi) là một trong các thông số để đánh giá độ chính xác của phương pháp được xác định bằng cách thêm chuẩn vào nền mẫu thực Hiệu suất thu hồi được tính theo công thức (2.6)

(2.6) 100m

mm

(%)H

c

pt pt c 1



Trong đó: H1(%) là hiệu suất thu hồi

Cpt: hàm lượng anthocyanidin trong mẫu

Cc: hàm lượng chuẩn anthocyanidin thêm vào mẫu

 Đánh giá tính phù hợp của mô hình qua chuẩn Fisher

2 0

S là phương sai của thí nghiệm lặp lại ở tâm của mô hình

fph bậc tự do của phương sai phù hợp

f0 bậc tự do của thí nghiệm lặp lại ở tâm

 Xác định hàm lượng anthocyanidin

Cân chính xác khoảng 1g mẫu sau khi đồng nhất vào bình thủy tinh chịu nhiệt, thêm 35ml dung môi thủy phân (axit HCl trong MeOH với nồng độ từ 0,32 – 3,68M) Đậy kín nắp và thủy phân mẫu ở điều kiện nhiệt độ ở 33 – 1170C trong thời gian 39 – 140 phút Làm nguội và chuyển định lượng vào bình định mức 50ml, định mức bằng dung môi thủy phân Lọc qua giấy lọc băng xanh và màng lọc 0,2µm trước khi phân tích trên HPLC – PDA

28

Sau khi thu được sắc đồ, tính nồng độ các anthocyanidin theo phương pháp đường chuẩn dựa trên diện tích píc từng chất Từ nồng độ sử dụng công thức sau để tính hàm lượng anthocyanidin:

m

H 0,1 K V a

b A

(2.8) Trong đó

A: Diện tích pic của chất phân tích V : thể tích dung môi định mức (50ml)

a, b là các hệ số trong phương trình hồi quy y = ax + b của đường chuẩn

m: khối lượng mẫu cân (g) K: hệ số pha loãng

H: hệ số hiệu chỉnh nồng độ thực anthocyanidin

 Độ không đảm bảo đo

Các nguồn chính gây ra sai số trong quá trình phân tích: cân phân tích, quá trình chuẩn bị mẫu, bình định mức, độ tính khiết hóa chất, độ tinh khiết chất chuẩn,

độ lặp lại, đường chuẩn…được thể hiện theo sơ đồ xương cá hình 2.1 [33]

Hình 2.1 Sơ đồ xương cá tính độ không đảm bảo đo

29

Cân phân tích có khả năng đọc trong khoảng ± 0,0001g với mức độ tin cậy 95% Từ bảng phân bố Gauss, độ không đảm bảo đo của cân là:

u(ms) =0,0001/1,96 = 5,102.10-5g Bình định mức 10ml loại A có dung sai ± 0,025ml nên độ không đảm bảo đo

chuẩn là u(Vst) = 0,025/ 6

Bình định mức 50ml loại A có dung sai ± 0,06ml nên độ không đảm bảo đo

thể tích mẫu là u(Vs) = 0,06/ 6

Các chuẩn anthocyanidin có độ tinh khiết từ P = 95 – 97%, độ không đảm bảo

đo của dunng dịch chuẩn u(P) =

3

)1.(

5,

0 P

Hiệu suất thủy phân có độ không đảm bảo đo utp

Hiệu suất thu hồi uth

Độ lặp lại có urep = s

2 tp 2 th

2 2

s s 2

st st 2

) u(V V

) u(V m

) u(m

Độ không đảm bảo đo mở rộng U = 2.uc

Giá trị đo hàm lượng anthocyanidin W = W ± U

- Cột tách Sun Fire hãng Waters C18 (250mm × 4,6mm × 5µm) và tiền cột tương ứng

- Cột tách Xbridge® BEH hãng Waters C18 (100 mm x 4,6 mm × 2,6 µm) và tiền cột tương ứng

Do cột tách Xbridge® BEH hãng Waters C18 có chiều dài ngắn và đường kính hạt rất nhỏ có khả năng chịu áp suất cao nhưng tốc độ dòng nhỏ khoảng 0,4ml/ phút nên khả năng tách các chất trên HPLC gặp khó khăn, hai chất peonidin và malvidin

có pic chập hoàn toàn Cột tách này phù hợp với điều kiện sắc kí lỏng khối phổ có khả năng chịu áp suất cao và không cần tách hoàn toàn các chất Do vậy, cột dài Sun Fire C18 (250mm × 4,6mm × 5µm) được lựa chọn để khảo sát tìm điều kiện tối ưu phân tích 6 anthocyanidin băng phương pháp sắc kí lỏng

3.1.2 Chọn bước sóng phát hiện

Để lựa chọn được bước sóng thích hợp, tiến hành quét phổ đối với chất chuẩn của 6 anthocyanidin phổ biến bao gồm delphinidin (Del), cyanidin (Cya), petunidin (Petu), pelargonidin (Pelar), peonidin (Peo) và malvidin (Mal) bằng detector PDA dải phổ từ 190 – 800nm Bước sóng cực đại hấp thụ của mỗi chất thu được như hình 3.1

31

Hình 3 1 Phổ hấp thụ phân tử của 6 anthocyanidin

Phổ hấp thụ của 6 anthocyanidin có một đỉnh hấp thụ cực đại trong khoảng bước sóng từ 509 – 531nm và một đỉnh phụ ở 267 – 275nm Do đó, để đảm bảo độ nhạy của phương pháp khi phân tích đồng thời cả 6 anthocyanidin và hạn chế ảnh hưởng của dung môi, tạp chất, chất đồng màu bước sóng 520nm được lựa chọn để phát hiện và định lượng các anthocyanidin