sinh học phân tử công thức tính

- Các phản ứng biến đổi: • Aminoacyl hóa • Formyl hóa tARN mở đầu tế bào nhân nguyên thủy • Gắn những yếu tố nối dài • Gắn ribosom • Nhận diện codon-anticodon - Các gen của tARN thường đ

SINH HOC PHÂN TỬ

LƯƠNG PHẠM NGỌC LÂM

Bài 1 SAO CHÉP DNA

1 Phân biệt sao chép, phiên mã và giải mã.

Truyền thông tin di truyền từ ADN đến ARN

Truyền thông tin di truyền từ mARN đến polypeptide

Kích thước sản

Polypeptide ngắn hơn mARN

Số lượng phân tử

con tạo ra sau một

lần sao chép, phiên

mã, giải mã

Tạo 2 phân tử ADN

Số polypeptide bằng

số ribosom trượt trên 1 sợi

+ Trong tự nhiên, phân tử ADN được đóng gói rất chặt ở dạng siêu xoắn

+ ADN vòng vẫn ở dạng siêu xoắn khi được chiết tách và tinh sạch -> hiện tượng siêu xoắn là trạng thái tự nhiên của ADN

+ Nghiên cứu hiện tượng siêu xoắn nhờ topology (ngành khoa học nghiên cứu tính chất ổn định của đối tượng luôn biến đổi hình dạng) cho phép hiểu biết sâu hơn về cấu trúc và chức năng ADN.+ ADN vòng thay đổi tính chất topology khi có sự đứt hoặc nối 1 hoặc cả 2 sợi ADN

• dễ dàng cho sự đóng gói ở dạng siêu xoắn

• tách sợi phục vụ quá trình phiên mã

+ Chỉ ổn định ở dạng ADN vòng hay được gắn với protein giữ cho các sợi không tự do xoay quanh nhau

+ Xác định bằng chỉ số liên kết (Lk): là số lần một sợi ADN nào đó xuyên qua mặt phẳng của sợi kia, là số nguyên

+ Xoắn hình thành ở dạng quay phải thì chỉ số liên kết là dương (+), ngược lại là âm (-) Chỉ số xoắn âm không phổ biến

+ Hai dạng ADN vòng khác nhau chỉ số Lk được gọi là topoisomer.+ Dạng ADN gỡ xoắn giúp tách sợi và hình thành những đoạn ngắn ADN dạng Z quay trái (dạng B quay phải)

3 Chức năng sinh học và điều trị của Topoisomerase.

- Chức năng sinh học:

+ Duy trì và ổn định trạng thái siêu xoắn

+ Đa số cơ thể sống (trừ vi khuẩn chịu nhiệt và Archaea), ADN ở dạng siêu xoắn âm

+ Ở vi sinh vật, mức độ siêu xoắn âm được điều hòa bù trừ bởi ADN gyrase và topoisomerase I.+ Ở vi khuẩn chịu nhiệt và Archaea, reverse gyrase tạo siêu xoắn dương bảo vệ ADN không bị biến tính ở nhiệt độ cao

- Phục vụ điều trị:

+ Topoisomerase là đối tượng tác động của thuốc chữa bệnh

+ ADN gyrase và topoisomerase IV là đối tượng tác động của 2 nhóm thuốc kháng vi khuẩn + Topoisomerase I và II là đối tượng tác động của nhiều loại thuốc chữa ung thư

+ Thuốc coumarin là sản phẩm tự nhiên của nấm Streptomyces ức chế cạnh tranh với ATP gắn lên

gyrase và topoisomerase IV

+ Thuốc quinolone là thuốc tổng hợp có tác động bao vây phức enzyme với ADN ngăn không cho enzyme gỡ xoắn và phức sao chép di chuyển trên ADN, gây đứt sợi đôi ADN và gây chết tế bào.+ Thuốc chống ung thư: Thuốc tác động lên topoisomerase ức chế phát triển tế bào nên có thể sử dụng cho mục đích điều trị bệnh ung thư Quinolone tạo liên kết hóa trị hoặc nằm xen các gốc của AND

4 Vì sao các base ATGC có kích thước khác nhau nhưng phân tử ADN vẫn có thể tự điều chỉnh cấu hình đối xứng qua trục.

- Hai mạch đơn kết hợp với nhau nhờ các liên kết hydro hình thành giữa các base bổ sung nằm trên hai mạch: A bổ sung với T và C bổ sung với G

- Kích thước phân tử của A > T và G> C nên bù trừ cho nhau

5 Nhờ vào đâu khi sao chép ADN tạo ra hai mạch mới giống mạch gốc.

- Khi sao chép, hai mạch của phân tử ADN được tách ra do các liên kết hydro giữa các cặp base bị đứt, mỗi mạch làm khuôn cần thiết cho việc tổng hợp mạch cặp mới tương tự với mạch cặp trước đó

- Vì A phải bắt cặp với T và G phải luôn bắt cặp với C nên trình tự các nucleotide trên một mạch sẽ xác định chính xác trình tự đặc hiệu các nucleotide trên mạch bổ sung với nó Sau đó nối các

nucleotide mới lại thành mạch mới bổ sung

- Do đó, một phân tử ADN ban đầu tạo ra hai phân tử con giống hệt nhau

6 Tính trạng di truyền được qua ADN, ARN hay protein? Giải thích

Tính trạng di truyền được qua ADN hay ARN (đối với virus) vì:

- Theo học thuyết trung tâm ta biết “Thông tin khi đã chuyển sang protein thì không thể lấy ra lại được nữa” Nghĩa là thông tin không thể chuyển ngược từ protein đến acid nucleic Thông tin ở đây là trình tự chính xác các nucleotide của acid nucleic qui định trình tự acid amin của protein

Do đó, protein không giúp tính trạng di truyền được

- Thông tin có thể chuyển giữa các phân tử ADN thông qua sự sao chép, hoặc giữa phân tử ADN và ARN thông qua sự phiên mã, hoặc từ acid nucleic đến protein nhờ sự dịch mã

- Ngoài ra thông tin còn có thể di chuyển giữa ARN đến ARN trong quá trình sinh sản của các ARN virus hay quá trình xử lý cắt nối của ARN hoặc ngược lại từ ARN đến ADN trong quá trình phiên

mã ngược của retrovirus

7 Chứng minh cơ chế minh họa sao chép ADN qua thí nghiệm Meselson và Stahl là cơ chế bán bảo thủ.

- Vi khuẩn được cho phát triển vài thế hệ trong môi trường đồng vị nitơ nặng (N15) để đảm bảo cho tất cả ADN vi khuển đều là loại nặng

- Sau đó, chuyển tế bào vào môi trường chứa nitơ nhẹ N14, như là nguồn cung cấp nitơ duy nhất và

để cho phân chia trong môi trường N14

- Khi khối lượng ADN tăng lên gấp đôi, ADN được chiết ra khỏi tế bào và được ly tâm trên thang nồng độ cesium clorid:+ Nếu cơ chế bảo tồn được thực hiện, 2 băng ADN phải được thấy rõ sau khi ly tâm: một băng nguyên thủy (N15) và một băng chứa N14

+ Nhưng kết quả thu được chỉ có một băng có tỷ trọng trung gian chứa N14,5 xuất hiện Tiếp tục, đem ADN lai đun nóng rồi làm nguội nhanh để tách 2 mạch, ly tâm sẽ thấy 2 băng tương ứng với ADN N15 và N14 Do đó cơ chế sao chép ADN theo cơ chế bán bảo tồn: 2 mạch của phân tử AND mẹ làm khuôn để tổng hợp nên mạch con bổ sung, phân tử AND con có 1 sợi N15 và 1 sợi N14

8 Các yếu tố cần thiết cho sao chép ADN ở E.coli

- Khuôn mẫu (phân tử ban đầu): Các sợi AND tách ra:

+ Sợi AND có hướng 3’->5’ sẽ được sao chép trực tiếp bởi ADN-polymerase III tạo ra sợi con bổ sung gọi là sợi sớm

+ Sợi AND có hướng 5’->3’ không được sao chép liên tục tạo ra bản sao gọi là sợi muộn

- Enzyme ADN-polymerase: đều có hoạt tính polymer hóa 5’->3’, gồm 3 loại:

# ADN-polymerase III là enzyme sao chép chính của của E.coli:

+ gồm 7 đơn vị nhỏ: α, β, γ, δ, ε, θ và τ, cần cho sự sao chép ADN+ ưa nhiệt nên không sao chép được ở nhiệt độ 420C

# Primase: Tổng hợp mồi ARN

# Helicase: Tham gia tách mạch tạo chạc ba sao chép Helicase sử dụng năng lượng từ thủy phân ATP để cắt đứt liên kết hydro Gồm có 2 loại:

@ Rep protein: Gắn vào AND gốc tổng hợp sợi sớm và di chuyển theo hướng 3’-5’ để tháo xoắn

@ Helicase thứ hai: Gắn vào AND gốc tổng hợp sợi muộn và tháo xoắn

# Topoisomerase: xúc tác tháo xoắn AND gồm 2 loại:

@ Topoisomerase I: tháo dạng siêu xoắn bằng cách gắn vào phân tử AND và cắt 1 trong 2 mạch để tháo xoắn sau đó nối lại

@ Topoisomerase II: Tại vị trí đánh dấu bởi protein B, gyrase sẽ tác động, cắt AND làm

tháo xoắn ra 2 phía protein B Gyrase cắt tạm thời 2 chuỗi của AND tạo ra các dạng siêu xoắn âm # Lygase: Nối các đoạn Okazaki sau khi thay thế các đoạn mồi ARN bằng cách xúc tác hình

thành liên kết phosphodiester giữa các polynucleotide

Các protein khác tham gia sao chép:

# Protein B: Nhận biết điểm khởi sự sao chép Ori

# N-protein: Tạo phức hợp với primase để tạo thành primosome chức năng N-protein nhận diện điểm Ori và cho phép primase hoạt động

# SSB-protein: Gắn vào AND sợi đơn để giữ cho các sợi AND không chập lại với nhau để việc sao chép diễn ra dễ dàng

- 4 loại deoxyribonucleotide triphosphat (dNTP):ATP, GTP, CTP và TTP Deoxyribonucleotide triphosphat gắn vào đầu 3’-OH của chuỗi AND đang sao chép và giải phóng pyrophosphat Pyrophosphat thủy phân thành phosphat vô cơ

- Mg2+ cần thiết cho hoạt động của ADN-polymerase

9 Đặc điểm của ADN-polymerase ở E.coli về hoạt tính polymer hóa 5’->3’ và hoạt tính

exonuclease?

- E.coli có 3 loại ADN-polymerase I, II và III.

Hoạt tính exonuclease 5’->3’

Sửa chữa Sao chép

ADN ty thể Sao chép ADN nhiễm

sắc thể (sợi sớm)

Sao chép ADN nhiễm sắc thể

* So sánh ADN-polymarese của tế bào nhân thật và nhân nguyên thủy:

- Giống nhau: +có cấu trúc đa phân tử

- Khác nhau

có 3 loại ADN-polymerase: I, II và III:

- AND-polymerase I: hoạt tính polymer

trong tế bào chất trong nhân và ty thể

11 Điểm khởi đầu sao chép ADN.

- Sự tổng hợp ADN của NST vi khuẩn luôn luôn bắt đầu ở cùng một điểm được gọi là vị trí Origin

hay Ori, gồm 254 cặp base

- Ví dụ: ở E.coli, quá trình sao chép bắt đầu khi protein B nhận biết được điểm khởi sự sao chép

OriC

12 Sự sao chép ADN ở E.coli

Gồm 6 bước:

- Protein B nhận biết được điểm khởi sự sao chép OriC

- Enzyme gyrase (một loại enzyme topoisomerase) cắt ADN làm tháo xoắn cả 2 phía của protein B

để 2 phân tử Helicase tham gia tách mạch tạo chạc ba sao chép Helicase sử dụng năng lượng ATP để cắt các liên kết hydro.Protein làm căng mạch SSB gắn vào mạch đơn ADN để ổn định 2 mạch

- Tổng hợp mồi ARN từ 5-10 nu bằng cách: protein N (Dna C) gắn primase tạo ra mồi các đoạn mồi ARN bị ADN-polymerase I cắt bỏ, lắp các nu của ADN vào chỗ trống và thực hiện polymer hóa hướng 5’->3’

- Tạo mạch ADN liên tục và các đoạn okazaki:

+ADN-polymerase III gắn vào mạch khuôn có đầu 3’ và tổng hợp mạch liên tục gọi là sợi sớm (leading strADN)

+ ADN-polymerase III gắn vào mồi ARN và tổng hợp các đoạn ngắn 1000-2000 nu gọi là đoạn Okazaki

- Tách mồi bởi ADN-polymerase I, sau đó lắp các nu của ADN vào chỗ trống và thực hiện polymer hóa hướng 5’->3’

- Nối liền các đoạn Okazaki bằng ezyme ligase để tạo ra sợi ADN liên tục gọi là sợi muộn

13 Phân biệt sợi sớm và sợi muộn.

Giống nhau:

- Được tổng hợp từ 2 mạch của cùng 1 phân tử ADN

- Mạch liên tục sau khi kết thúc quá trình sao chép

- Được tổng hợp bởi ADN-polymerase III

Khác nhau:

Mạch khuôn - Mạch khuôn có đầu 3’ - Mạch khuôn có đầu 5’

Hướng tổng hợp - Mạch 5’->3’ hướng vào

chạc ba sao chép - Mạch 3’->5’ hướng ra ngoài chạc ba sao chép

Quá trình tổng hợp - Tổng hợp ngay mạch liên

tục từ mạch khuôn

- Đầu tiên tổng hợp các đoạn Okazaki sau đó cắt nối để trở thành mạch liên tục

Thời gian tổng hợp - Được tổng hợp trước - Được tổng hợp chậm hơn

14 Cơ chế để sợi dẫn và sợi muộn được tổng hợp cùng chiều

- Các sợi ADN được tách ra và một sợi ADN có hướng 3’->5’ được sao chép trực tiếp bởi polymerase Sợi con bổ sung vừa tạo được gọi là sợi dẫn Sợi gốc còn lại có hướng 5’->3’, không được sao chép cho đến khi một phần của sợi gốc được tháo xoắn Bản sao này được gọi là sợi muộn Sợi muộn được tổng hợp bằng một quá trình sao chép không liên tục

ADN Sự sinh tổng hợp sợi muộn và sợi dẫn được điều hòa bởi sự tạo nút thắt (loop) của sợi muộn, nhờ đó sợi muộn cũng được tổng hợp cùng hướng với sợi sớm

15 Kích thước đoạn Okazaki ở tế bào nhân nguyên thủy và tế bào nhân thật.

- Nhân thật: 40-300 nu

- Nhân nguyên thủy: 1000-2000 nu

16 Vai trò của các enzyme trong sao chép.

2 Rep protein Tháo xoắn sợi sớm

4 AND polymerase III Tổng hợp AND

5 AND polymerase I Xóa mồi và lắp kín đoạn mồi bị cắt

6 AND topoisomerase I Cắt khía một sợi đơn AND

7 AND topoisomerase II Cắt khía cả hai sợi đơn AND

8 AND ligase Nối các đầu của polynucleotide đã hoàn

thành

17 Mồi xuất phát khi nào? Nhờ vào đâu? Xuất xứ?

Khi N-protein nhận biết vị trí cần tổng hợp sợi sớm hay sợi muộn Primosome giải phóng primase để tổng hợp mồi

18 Protein nhận diện vị trí ADN cho primase hoạt động.

Protein nhận diện là N-protein, chọn các điểm (origin) trên ADN, tại đó primase có thể hoạt động

19 Bản chất và kích thước của đoạn mồi.

- Mồi ARN được tổng hợp bởi 1 enzyme đặc hiệu gọi là primase

- Có thể kéo dài sự khởi động chuỗi de novo

- Kích thước: khoảng 5-10 base

20 Tốc độ di chuyển của chạc ba sao chép ở E.coli và tốc độ tháo xoắn của ADN gốc.

- Tốc độ di chuyển của chạc ba sao chép ở E.coli: 800 base/giây

- Tốc độ tháo xoắn của ADN gốc: 80 vòng/giây

21 Phân biệt siêu xoắn dương và siêu xoắn âm.

Sự tháo xoắn ADN gây ra hiện tượng siêu xoắn:

+ Tháo xoắn sợi kép dẫn đến siêu xoắn âm (xoắn ngược chiều và làm giảm số vòng)

+ Xoắn thêm sẽ dẫn đến siêu xoắn dương (xoắn kép cùng chiều và số vòng tăng)

22 Vai trò của topoisomerase I và II

- Topoisomerase xúc tác gỡ xoắn và tạo xoắn AND làm thay đổi chỉ số Lk

- Topoisomerase có vai trò quan trọng trong sao chép và đóng gói AND

+ Cơ chế sao chép bán bảo tồn cần của AND đòi hỏi các điểm cắt ở 1 sợi hoặc ở cả 2 sợi AND để tách chuỗi

+ Sự đóng gói AND cần dạng siêu xoắn đặc hiệu

+ Ở E.coli: có 4 loại topoisomerase (I đến IV): Loại I và III thuộc nhóm topoisomerase I xúc tác

tạo thêm xoắn bằng cách gỡ siêu xoắn âm làm tăng Lk Topoisomerase II hay ADN gyrase xúc tác

gỡ xoắn làm giảm Lk, sử dụng năng lượng do ATP cung cấp và cắt đồng thời 2 sợi AND và cho phép 2 sợi còn lại di chuyển qua khe hở vừa tạo ra

+ Tế bào eukaryote: cũng có 2 loại topoisomerase I và II

23 Vai trò của các ADN polymerase ở tế bào nhân thật.

Ở tế bào nhân thật có 5 loại ADN-polymerase: α, β, γ, δ và ε

Sửa chữa Sao chép

ADN ty thể

Sao chép ADN nhiễm sắc thể (sợi sớm)

Sao chép ADN nhiễm sắc thể

24 Vai trò của Helicase.

- Hỗ trợ cho sự tháo xoắn ADN gốc vì hai sợi đơn ADN không thể tự nhiên tách ra được

- Cần ATP như một cofactor để đi dọc theo sợi ADN làm tăng tốc độ tách hai sợi ADN

- Có 2 loại:

+ Rep-protein gắn với ADN gốc, trực tiếp tổng hợp sợi sớm và di chuyển theo hướng 3’->5’.+ Helicase thứ hai: gắn với sợi khuôn kia để tổng hợp sợi chậm, tạo phức hợp với primase để tạo mồi ARN

Bài 2 CÁC LOẠI ARN

1 Vì sao ADN mang thông tin di truyền, nhưng bản thân nó lại không trực tiếp chỉ huy quá trình sinh tổng hợp protein?

 ADN nhiễm sắc thể chỉ mang một bản sao duy nhất cho mỗi gen, trong khi tế bào có hàng nghìn phân tử protein cùng loại tồn tại

 Không phải tất cả các gen đều biểu hiện thành protein cùng lúc mà các gen khác nhau sẽ biểu hiện khác nhau tại mỗi thời điểm trong vòng đời của tế bào và tùy theo điều kiện môi trường

→ Do vậy cần có cơ chế trung gian để khuếch đại thông tin di truyền từ ADN đến protein, đồng

thời kiểm soát sự biểu hiện của gen theo nhu cầu của tế bào

2 Các vai trò chủ yếu của ARN?

- ARN tạo nên bộ máy sinh tổng hợp protein:

 Trung gian truyền thông tin di truyền đến bộ máy sinh tổng hợp protein Từ mỗi gen có thể có nhiều bản sao ARN để chỉ huy quá trình tổng hợp protein, đồng thời vòng đời của ARN ngắn nên sự biểu hiện của gen qua trung gian ARN dễ dàng được kiểm soát bởi nhu cầu của tế bào và điều kiện môi trường

 Tham gia cấu tạo ribosom

 Vận chuyển acid amin đến ribosom trong quá trình sinh tổng hợp protein

- ARN có thể ở dạng tự do hoặc gắn với protein thành các phức hợp nucleoprotein giữ nhiều vai trò quan trọng trong hoạt động sống của tế bào

- Có tới 7 loại ARN nhỏ khác nhau, trong đó có một số snARN có liên quan đến việc xử lý hnARN thành mARN chức năng

- Một vài loại ARN có cả ở tế bào nhân nguyên thủy và tế bào nhân thật là thành phần của enzyme có chức năng xúc tác trực tiếp

3 Các loại ARN trong tế bào?

- mARN – ARN thông tin

- rARN – ARN ribosom

- tARN – ARN vận chuyển

- pre-rARN (tiền rARN) là ARN được tổng hợp từ ADN, sau khi chúng được cắt nối sẽ trở thành rARN

- pre- tARN (tiền tARN) là ARN được tổng hợp từ ADN, sau khi chúng được cắt nối sẽ trở thành tARN

- hnARN – ARN nhân không đồng nhất, sẽ tạo mARN sau khi được cắt nối

- snARN – ARN nhân nhỏ

- scARN – ARN tế bào chất nhỏ

4 ARN ribosom: cấu trúc, vai trò

- rARN là thành phần cấu tạo ribosom, chiếm phân nửa khối lượng của ribosom

- Mỗi một ribosom có Mr = 2.5 - 4.5 x 106

- Có 3 loại ribosom khác nhau phân biệt dựa vào hệ số lắng khi siêu ly tâm:

+ ribosom của tế bào nhân nguyên thủy và lục lạp = 70S + tế bào nhân thật = 80S

+ ty thể động vật có vú = 50S

- Tất cả ribosom đều được cấu tạo bởi 2 tiểu đơn vị có chức năng và cấu trúc riêng biệt, các tiểu đơn

vị này có thể tách ra và gắn lại với nhau một cách thuận nghịch tùy theo nồng độ của Mg2+

- Ribosom của tế bào nhân nguyên thủy = 70S gồm:

+ đơn vị lớn 50S chứa 1rARN 23S và 1rARN 5S, và 34 protein

+ đơn vị nhỏ 30S: 1rARN 16S và 21-23 protein

- Ribosom của tế bào nhân thật = 80S gồm:

+ đơn vị lớn 60S: 1rARN 28S, 1rARN 5.8 và 1rARN 5S và 45 protein

+ đơn vị nhỏ 40S: 1rARN 18S và 33 protein

5 ARN ribosom của E.coli?

- Có 7 vùng mã hóa cho rARN trên NST: rrn

- Mỗi rrn mang các gen theo thứ tự 16S-23S-5S

- 1 sợi pre-rARN được phiên mã từ rrn

- Pre-rARN được cắt để tạo thành các rARN tương ứng

- Cấu tạo ribosom: 50S+30S:

21 protein được đặt tên từ S1-S21

- Các protein ribosom có khối lượng tương đối nhỏ và chứa nhiều acid amin base

- Các protein của ribosom có các trình tự bậc 1 khác nhau, ngoại trừ L7, L12 và L8

+ L7 là một dạng aminoacetyl hóa L12

+ L8 là phức hợp của một phân tử L10 liên kết với L7 và L12

6 Sự methyl hóa nucleotide ở rARN của E.coli

- Methyl hóa nucleotide là một đặc tính cấu trúc bậc 1 của rARN

- Xảy ra sau khi phiên mã

- Xúc tác bởi ARN-methylase

- Cơ chất cung cấp methyl là S-Adenosyl Methionin (SAM)

- rARN của tế bào nhân nguyên thủy và bào quan: methyl hóa base khởi đầu (5-methylcytosin)

- rARN của tế bào nhân thật: methyl hóa ở vị trí 2’ của đường ribose (2’-O-methyladenosyl)

- Sự methyl hóa đóng vai trò biến đổi bản sao sơ cấp của rARN

- Vị trí methyl hóa được bảo tồn

7 Sự biến đổi của rARN ở tế bào nhân thật Thí dụ sự biến đổi của rARN ở tế bào Hela

- Pre-rARN 45S là bản sao của các gen ARN-ribosom

- rARN 45s được biến đổi do đưa vào khoảng 110 nhóm methyl ở các nucleotide đặc hiệu Những phần methyl hóa đều được bảo tồn ở rARN trưởng thành

- Hàng loạt diễn biến trong và ngoài nhân đã tạo ra được các tiền thể trung gian 32S và 20S từ rARN 45S

pre-+ pre-rARN 32S cắt nối thành 28S và 5.8S

+ pre- rARN 20S thành 18S

- Gen mã hóa cho 5S nằm riêng

8 Sự biến đổi của rARN ở tế bào nhân nguyên thủy

- pre-rARN gồm rARN 16S–23S-5S

- Gen rARN chứa 2 chuỗi tARN hay nhiều hơn

- Sự phân cắt đầu tiên của pre-rARN được xúc tác bởi ARNse III đặc hiệu cho ARN mạch kép

9 Cấu trúc và vai trò của ARN vận chuyển

a Cấu trúc:

- Dài 73-93 nucleotid

- Cấu trúc gồm một mạch cuộn lại như hình là chẻ ba:

+ Đầu tận cùng 5’ phosphate

+ Nhánh gắn acid amin: gồm 7 cặp base

# Các nucleotide đầu tận cùng 3’ có –OH tự do để gắn acid amin

# Các cặp base có thể không theo trình tự bổ sung

+ Đuôi CCA: trình tự CCA tại 3’ giúp enzyme nhận biết tARN khi dịch mã

+ Vòng D: gồm 4 cặp base, chứa dihydrouridine

+ Vòng đối mã: gồm 5 cặp base đối mã Mỗi tARN mang 1 bộ ba đối mã đặc hiệu của 1 hay nhiều codon mã hóa cho 1 aa

10 Sự biến đổi của tARN ở E.coli Vai trò của RNase P.

- tARN được cắt ra từ phân tử dài hơn nhờ RNase P

- Các phản ứng biến đổi:

• Aminoacyl hóa

• Formyl hóa tARN mở đầu (tế bào nhân nguyên thủy)

• Gắn những yếu tố nối dài

• Gắn ribosom

• Nhận diện codon-anticodon

- Các gen của tARN thường được phát hiện trong các operon hỗn hợp cùng lúc mã hóa cho 4 tARN

(tARNTỷ, tARNThr, tARNGly, tARNThr) và mARN cho sự tổng hợp protein – yếu tố nối dài Tu

- Thủy giải đầu tiên của bản sao sơ cấp được xúc tác bởi ARNse tạo các đầu tận cùng 5’ của phân tử tARN

- tARN có trình tự cuối là CCA – OH phiên mã từ các base bổ sung có trong ADN của NST

- RNase P:

+ Là một enzyme, gồm 1 ARN có 375 nucleotide và 1 protein có trọng lượng phân tử 20000

+ Trong các điều kiện dinh lý, cả 2 thành phần protein và ARN đều cần những yếu tố để hoạt động, nhưng khi nồng độ Mg2+ cao thì chỉ có thành phần ARN có hoạt tính xúc tác

+ Theo sau hoạt động của ARNse P, một số phản ứng trong nhân và biến đổi base sẽ tạo nên tARN hoàn chỉnh

11 Các phản ứng xử lý tARN.

- Aminoacyl hóa

- Formyl hóa tARN mở đầu (tế bào nhân nguyên thủy)

- Gắn những yếu tố nối dài

+ Đoạn 3’ không mã hóa (5’ UTR)

- Đoạn 5’ và 3’ là trình tự khởi đầu và kết thúc không được dịch mã, do đó mARN chứa trình tự

nucleotide nhiều hơn số được dùng để mã hóa protein

- 5’UTR và 3’UTR có tác dụng:

+ Làm gia tăng hay giảm độ ổn định của phân tử ARN

+ Giúp phân tử ARN tồn tại lâu hơn trong tế bào chất, do vậy sẽ tổng hợp được nhiều protein hơn.+ Thúc đẩy quá trình dịch mã hiệu quả hơn

Khác nhau:

- mARN là polycistron

- Dịch mã xảy ra ngay khi đang phiên mã

- Thời gian bán hủy ngắn trung bình 2 phút

- Hầu như không bị biến đổi

- mARN là monocistron

- Dịch mã xảy ra sau khi phiên mã hoàn tất

- Thời gian bán hủy dài hơn từ 30 phút đến

- Enzyme phosphohydrolase cắt liên kết γ – phosphodiester, loại bỏ α và β phosphat

- Tiếp theo, enzym guanylyltransferase gắn guanine và α phosphate vào β phosphate của đầu 5’ bằng liên kết 5’-5’ triphosphat

- Sau đó, vị trí N-7 của guanine sẽ bị methyl hóa do enzyme guanin-7-methyltranferase.(Chóp 0)

- Cuối cùng, enzym 2’-O-methyltransferase sẽ methyl hóa vị trí 2’ của đường ribose.( Chóp 1)

- Phản ứng methyl hóa chóp có thể xảy ra theo 1 trong 3 cách:

+Chóp 0: nhóm methyl gắn vào vị trí G7 di enzyme guanine-7-methyl transferase xúc tác Phản ứng này xảy ra ở tất cả mARN tế bào nhân thật

+Chóp 1: nhóm methyl gắn vào vị trí 2’-OH đường ribose của nucleotide đầu tiên Phản ứng do enzyme 2’-O-methyl transferase xúc tác, xảy ra hầu hết mARN tế bào nhân thật

+Chóp 2: phản ứng methyl hóa xảy ra ở nucleotide thứ 2 với tỉ lệ 10-15%

+Ngoài ra còn có quá trình methyl hóa nội phân tử xảy ra tại vị trí N6 của adenine với tần suất 0,1%

- Chức năng:

+ Bảo vệ phân tử ARN không bị cắt liên kết phosphoester do các phân tử hydro lân cận

+ Dấu hiệu nhận biết vị trí gắn của mARN trên ribosom khi dịch mã

b Gắn đuôi poly A vào đầu 3’:

- Đuôi poly A gắn vào đầu 3’ ở động vật có vú: khoảng 50-250, nấm men khoảng 100 Adenin

- Đuôi poly A gắn vào pre-mARN có trình tự nhận diện AAUAAA

- Quá trình này do enzyme poly A polymerase xúc tác

16 Cấu trúc và vai trò của ARN nhân nhỏ, ARN tế bào chất nhỏ.

- snARN và scARN phức hợp với các protein đặc hiệu tạo các hạt ribonucleoprotein (RNP) được gọi là snRNP hay scRNP

- snRNP tạo thành spliceosom xúc tác việc cắt nối pre-mARN thành mARN

- Có 7 loại snRNP từ U1 đến U7:

+ U1 và U2: sửa đổi hnARN thành mARN hoàn chỉnh

+ U3: sửa đổi pre-rARN thành rARN tế bào chất

ARN có khả năng xúc tác được gọi là rybozyme

- scARN có vai trò biết rõ nhất là 7SL ARN:

+ một thành phần của phức hợp nhận diện tín hiệu xuất SRP

+ SRP gồm: 1 scARN có chứa 294 nucleotide và 6 polypeptide có Mr = 9000-72000 + Khi mARN của protein xuất bắt đầu được dịch mã, SRP tương tác đặc hiệu với đoạn peptid tín hiệu xuất của protein mới sinh và với ribosom, ngăn chặn sự dịch mã đến khi ribosom tiếp xúc với lưới nội chất, khi đó

nó rời khỏi ribosom và tín hiệu xuất của protein mới sinh gắn vào bộ máy chuyển vị protein trên màng lưới nội chất và sự tổng hợp protein được tiếp tục, protein sinh ra được chuyển vào trong lưới nội chất

22 Vai trò xúc tác của snRNP trong quá trình cắt nối mARN.

+ snRNP U1 gắn vào vị trí cho

+ snRNP U2 tạo liên kết hydro với vị trí nhánh của intron Giai đoạn này sử dụng ATP thủy phân

và “yếu tố trợ giúp” snRNP ( U2AF)

+ snRNP U1 tương tác với snRNP U2 giúp vị trí cho và ví trí nhận tiến lại gần nhau

+ Phức hợp U5/U4/U6 gắn với U1 và U2 sử dụng ATP thủy phân; U5 gắn với vị trí cho của intron; U6 gắn với U2; đây là spliceosom hoàn chỉnh ATP cung cấp năng lượng cho mỗi giai đoạn U4 tương tác với U6 bằng liên kết hydro

+ U5 di chuyển từ phần intron sang phần exon của vị trí cho, U2 thay thế U4 liên kết với U6 nhờ liên kết hydro

+ snRNP U5 tương tác với phần intron của vị trí nhận và U2, xúc tác phản ứng cắt liên kết exon và nối 2 exon Phản ứng chuyển ester thứ 2 xảy ra

intron-+ Spliceosom được tháo rời, giải phóng U1, U2, U4, U5, U6

+ Sợi đôi intron được tháo xoắn và thoái hóa

Bài 3 SỰ PHIÊN MÃ VÀ MÃ DI TRUYỀN

1 Vai trò dị xúc tác của ADN.

ADN thể hiện khả năng dị xúc tác tức là làm khuôn để tổng hợp nên một phân tử khác.

2 Nguyên tắc của phiên mã.

- Chỉ 1 trong 2 mạch của phân tử ADN dùng làm khuôn để tổng hợp ARN

- ARN polymerase bám vào ADN làm tách mạch và di chuyển theo hướng 3’-> 5’ trên ADN để cho

“ARN” được tổng hợp theo hướng 5’->3’

- ARN polymerase gắn vào ADN gây ra hiện tượng “chảy” tại chỗ bên trong chuỗi xoắn kép ADN Kết quả làm đứt các liên kết hydro giữa các đôi base bổ sung

- Cơ chất cho ARN polymerase là các ribonucleotid 5’-triphosphat ATP, GTP, CTP và UTP

- Một ion kim loại hóa trị 2 hoặc là Mg2+ hoặc là Mn2+ đóng vai trò co-factor

3 Tiến trình phiên mã Khi nào đầu 5’ của chuỗi mARN mới sinh tách khỏi tổ hợp lai đầu tiên.

- Tiến trình phiên mã:

+ ARN polymerase nhận diện “promoter”

+ ADN được tháo xoắn cục bộ (tạm thời)

+ Polymerase bắt đầu đọc ADN và tổng hợp ARN

+ Polymerase di chuyển đến vị trí kết thúc

+ ARN tách ra khỏi polymerase

- Đầu 5’ của chuỗi mARN mới sinh tách khỏi tổ hợp lai đầu tiên khi:

+ Chuỗi ARN kéo dài theo hướng 5’-3’ và ARN polymerase cùng với vùng sợi kép ADN duỗi xoắn ( còn gọi là bong bóng phiên mã) chuyển động dọc theo sợi khuôn mẫu theo hướng 3’-5’

+ Khi tổ hợp lai ADN-ARN đạt được chiều dài 12 base, đầu tận cùng 5’ của chuỗi ARN mới hình thành được tách ra từ mạch ADN bổ sung với nó và 2 mạch kép của ADN ban đầu phục hồi lại

4 Mồi (primer) có cần thiết cho quá trình phiên mã hay không? Vì sao ADN có tính chất dị xúc tác.

- Mồi không cần cho quá trình phiên mã vì ARN polymerase có khả năng kéo dài chuỗi de novo.

- ADN thể hiện khả năng dị xúc tác tức là làm khuôn để tổng hợp nên một phân tử khác

6 Vì sao ARN-polymerase không có tính sửa sai?

- Những nucleotide nào kết hợp không chính xác thường được thay thế ngay bằng những nucleotide phù hợp

- Nếu có lỗi hiếm hoi nào xảy ra thì cũng không di truyền được vì ARN có vòng đời ngắn và không phải là nơi lưu trữ thông tin di truyền

7 Đặc điểm phiên mã ở tế bào nhân nguyên thủy.

- Chỉ một loại ARN polymerase chịu trách nhiệm tổng hợp tất cả các loại ARN

- mARN thường chứa thông tin nhiều gen nối tiếp nhau (polycistron mARN)

- Quá trình tổng hợp mARN được tiến hành khi ARN polymerase bám vào vùng khởi động

(promoter) Khi gắn vào, polymerase không tổng hợp mARN ngay Sự tổng hợp chỉ bắt đầu từ dấu xuất phát thường là TAC nằm cách 7-8 base phía sau chỗ bám về phía đầu 5’ của mạch khuôn

- Ở phần lớn tế bào nhân nguyên thủy, quá trình tổng hợp tiếp tục đến khi đọc qua dấu kết thúc Kết thúc phiên mã, ARN polymerase và mARN tách rời khỏi ADN

- Quá trình phiên mã và dịch mã xảy ra đồng thời với nhau

8 Cấu tạo của ARN-polymerase ở E.coli

- Là một protein phức hợp chứa 5 tiểu đơn vị gồm 4 loại, trọng lượng phân tử 45kDa

- Toàn bộ enzyme gọi là holoenzyme

- Một enzyme duy nhất ở prokaryote

- Lõi enzyme có chức năng xúc tác gồm 4 tiểu đơn vị α2ββ’

- Yếu tố sigma (σ) nhận diện promoter

- Các tiểu đơn vị của ARN polymerase của E.coli:

Tiểu đơn vị Gen mã hóa Số lượng Chức năng

9 Cấu tạo promoter ở E.coli

- 2 trình tự này chịu trách nhiệm cho phép ARN polymerase gắn vào vùng khởi động phiên mã

- Không phải promoter nào cũng có cấu tạo giống hệt các trình tự này, mà có một ít sai lệch nhỏ, do

đó người ta gọi trình tự này là trình tự chung

- Promoter kiểm soát tần suất khởi đầu hiệu quả:

+ Khởi đầu nhanh do promoter “mạnh”

+ Là yếu tố điều hòa phiên mã chính ở vi khuẩn

- Promoter có trình tự càng gần với trình tự chung thì càng hoạt động mạnh

10 Cấu tạo promoter ở tế bào nhân thật

- Promoter nằm phía trước điểm xuất phát của mARN

- Có những trình tự chung trong tiến hóa:

+ Trình tự ở vùng -30 là TATA (hộp TATA) có base trung tâm -25 hay -30 ở động vật có

vú và từ -60 đến -120 ở nấm men, định hướng cho ARN polymerase bắt đầu phiên mã + Trình tự ở vùng -40 bp là CCAAT (hộp CAT)

+ Trình tự ở vùng -110 bp là trình tự giàu GC (hộp GC)

- Ở tế bào nhân thật, polymerase không gắn promoter mà là các protein điều hòa

- Hộp CAT và GC có thể kiểm soát việc gắn khởi đầu, có chức năng liên kết với các yếu tố phiên

mã (TF)

- Hộp TATA có thể kiểm soát việc chọn điểm khởi đầu phiên mã

* So sánh promoter của tế bào nhân thật và tế bào nhân nguyên thủy:

- Trình tự TATAAT (hộp TATA hay

Pribnow), cách điểm xuất phát 6-8 base, có

base trung tâm -10

Promoter gồm 3 trình tự:

- Trình tự ở vùng -30 là TATA (hộp TATA)

có base trung tâm -25 hay -30 ở động vật có

vú và từ -60 đến -120 ở nấm men, định hướng cho ARN polymerase bắt đầu phiên mã

- Trình tự TTGACA có base trung tâm -35

Vùng này tham gia vào việc gắn trực tiếp

ARN polymerase

- Hộp TATA hoạt động có hiệu quả cùng với

2 trình tự tương ứng phía trước khoảng -40 là CCAAT (hộp CAT) và -110 giàu GC có chức

năng liên kết với các yếu tố phiên mã (TF)

11 Chức năng của vùng -10 và -35 ở E.coli

- Hai vùng này tạo thành promoter là trình tự khởi đầu cho sự phiên mã

- Vùng -10 là nới gắn của yếu tố sigma

- Vùng -35 tham gia vào việc gắn khởi đầu ARN polymerase

12 Vùng khởi động quyết định tốc độ phiên mã Thí dụ.

- Vùng khởi động quyết định tốc độ phiên mã

- Càng gần trình tự chung càng mạnh

- Ví du: lac repressor chỉ phiên mã 30 phút/lần; gen rADN phiên mã 2 giây/lần

13 Gen hptR và ARN-polymerase ở E.coli

- Gen này đáp ứng với shock nhiệt và mã hóa cho chuỗi polypeptide có Mr 32 000

- Đóng vai trò như một yếu tố σ biến đổi Yếu tố này (được gọi σ32) kết hợp với phần lõi bình thường của ARN polymerase để tạo nên holoenzyme α2ββ’σ32

- Enzyme này chỉ bám vào những promoter của gen shock nhiệt, chứ không bám vào promoter của các gen bình thường và có trình tự vùng -35 dài hơn với một số khác biệt nhỏ

14 Pomoter SP 6 : Nguồn gốc và ứng dụng.

- SP6 là một thực khuẩn thể của Salmonella typhimurium, mã hóa được một ARN-

polymerase virus đặc hiệu

- Các promoter của tế bào chủ và các promoter có trong plasmid ly trích từ E.coli đều không

được SP6 polymerase nhận biết

- Ứng dụng để nhân bản sao mã cần thiết:

+ Promoter SP6 được chèn vào vector plasmid phía trước polylinker Đoạn ADN cần sao chép

được chèn vào polylinker và plasmid tái tổ hợp được biến nạp vào E.coli.

+ Plasmid chứa ADN lạ được “làm duỗi thẳng” bởi một enzyme cắt hạn chế

+ Plasmid duỗi thẳng này được ủ với SP6 polymerase và các NTP

+ Các plasmid-ADN được loại khỏi các bản sao mARN bằng cách ủ với DNase

15 Quá trình khởi đầu và nối dài chuỗi ARN.

- Việc gắn của holoenzyme ARN polymerase vào promoter tạo ra phức hợp khởi động đóng có cấu hình ADN xoắn kép Các điểm tiếp xúc chủ yếu giữa promoter và ARN polymerase nằm ở các vùng -10 và -35

- Phức hợp đóng nhanh chóng biến thành phức hợp mở do các liên kết hydro bị enzyme cắt trên một vùng bao gồm 17 bp Sợi ADN được tách ta nhờ sự tháo xoắn 1,6 vòng của xoắn kép B-ADN

- Nucleotide triphosphat đầu tiên (thường là ATP hoặc GTP) gắn vào tiểu đơn vị β của polymerase, hướng đúng vào base bổ sung ở vị trí +1 của sợi khuôn mẫu

- Một nucleotide triphosphat thứ 2 tiếp theo được kết nối và hình thành liên kết phosphodiester đầu tiên Như vậy, chuỗi ARN phát triển mang triphosphat ở đầu 5’ và theo hướng 5’->3’

16 Kết thúc quá trình tổng hợp ARN độc lập với yếu tố Rho.

- ARN được phiên mã từ trình tự giàu GC trên AND tạo nút “kẹp tóc” vì trình tự này đối xứng 2 bên

- 4 U sau nút liên kết yếu với ADN nên ARN có thể tách khỏi AND

- Sau đó sợi kép AND được hình thành trong “bong bóng phiên mã” và phần lõi của enzyme

polymerase có ái lực thấp với AND nên được phóng thích ra

17 Kết thúc quá trình tổng hợp ARN lệ thuộc yếu tố Rho.

- Cần sự có mặt của nút và vòng ngay trước đầu kéo dài của ARN, nhưng không có trình tự oligo (U)

- Yếu tố Rho là protein gắn ARN:

+ Nhận diện các trình tự giàu C và nghèo G+ Có kênh để ARN chạy qua

+ Hoạt động như Helicase để kéo ARN khỏi ADN

18 Đặc điểm phiên mã ở tế bào nhân thật.

- ARN polymerase II chịu trách nhiệm tổng hợp mARN, ARN polymerase I tổng hợp rARN, ARN polymerase III phiên mã cho ra các ARN có kích thước nhỏ, tARN, ARN 5S

- mARN chứa thông tin của một gen (monocistron mARN)

- Quá trình phiên mã phức tạp hơn Ở đầu 5’ mARN có gắn thêm “chóp” (CAP) là 7-methylguanosine, còn cuối mARN phía 3’ có thêm “đuôi” polyadenin dài 100-200 nucleotid

- Bản phiên mã đầu tiên còn gọi là tiền mARN không được sử dụng trực tiếp mà phải qua biến đổi.

19 Cấu trúc gián đoạn của các gen ở tế bào nhân thật.

- Nhiều gen của tế bào nhân thật có tính gián đoạn

- Các đoạn mã hóa cho protein được gọi là exon xen kẽ với đoạn không mã hóa được gọi là intron

- Bản phiên mã đầu tiên tức là tiền mARN chứa cả trình tự phiên mã của exon và intron

- Các intron không mã hóa protein được cắt rời ra, còn các exon mã hóa protein được nối lại với nhau để tạo ARN trưởng thành Quá trình này được gọi là cắt nối

20 Đặc điểm phiên mã các rARN do ARN-polymerase I.

- rARN được phiên mã rất mạnh

- Promoter thực gồm 150 bp giữa các vị trí -146 và +6

- Promoter vệ tinh nằm ở -1200 và -2300 là nơi xếp hàng của polymerase trước khi chuyển động đến promoter thực

- Trong vùng vệ tinh có nhiều bản sao 60 hoặc 81 bp của promoter thực

- Sản phẩm phiên mã đầu tiên là tiền rARN 45S (pre-rARN) sau đó được cắt thành 28, 18 và 5,8S

21 Sự phiên mã bởi ARN-polymerase II

- Phiên mã các ARN thông tin (mARN)

- Promoter gồm hộp TATA, CAT và GC để gắn yếu tố phiên mã chuyên biệt hơn là gắn trực tiếp với ARN-polymerase II

- Trình tự tăng cường kích thích phiên mã mạnh, có tính chuyên biệt và tác động từ xa

- Bản sao là hnARN được gắn CAP và có trình tự AAUAAA ở đầu 3’ để cắt khỏi polymerase và tổng hợp đuôi polyA

22 Vị trí và trình tự chung của các hộp TATA, CAAT và GC ở tế bào nhân thật

- TATA: -25 hay -30 ở động vật có vú và -60 đến -120 bp ở ADN nấm men

- CAAT: -40 bp hay -80

- GC:-110 bp hoặc thay đổi trước và sau hộp CAT

23 Vai trò của trình tự tăng cường (enhancer).

24 Sự phiên mã bởi ARN-polymerase III.

- Phiên mã rARN 5S, tARN và một số ARN nhỏ của nhân và của tế bào chất (thường < 300 nucleotid)

- Có sự tham gia của yếu tố phiên mã khác là TFIIIA, TFIIIB và TFIIIC TFIIIA chuyên biệt cho noãn bào

25 Vai trò của TFIIIA trong quá trình tổng hợp 5S r ARN.

- TFIIIA có Mr= 40kDa, chuyên biệt cho noãn bào

- Gắn với vùng nội kiểm soát của gen rARN 5S

- TFIII gắn rARN 5S tự do thành 7S RNP không tham gia phiên mã được, sự tổng hợp rARN 5S bị giảm xuống cho đến khi TFIIIA được giải phóng trở lại

26 Phiên mã ngược.

- Retrovirus là các virus mà vật liệu di truyền của chúng là ARN, ví dụ virus làm suy giảm miễn dịch (HIV)

- Sự tổng hợp ADN từ khuôn mẫu ARN được xúc tác bởi các enzyme phiên mã ngược (reverse

transcriptase: gồm 2 tiểu đơn vị 560 aa)

- Enzyme này cần mồi là một tARN vủa tế bào chủ, gắn kết vào đầu 3’ của retrovirus

- Chuỗi kép đầu tiên là chuỗi lai ARN-ADN ARN virus trong chuỗi lai bị hủy bởi RNaseH

- Sau đó, một mạch ADN được tổng hợp để tạo ra chuỗi kép ADN Chuỗi kép tích hợp với ADN ký chủ

27 Đặc điểm của mã di truyền.

- Đơn vị mã hóa hay còn gọi là codon gồm có 3 nucleotid kế tiếp nhau

- 64 codon

- 3 codon không mã hóa cho aa (UAA, UAG, UGA) được gọi là codon vô nghĩa hay codon kết thúc (stop codon)

- Mã di truyền có tính “suy thoái”: một aa có nhiều codon mã hóa chỉ trừ methionin và tryptophan chỉ

có một codon

- Codon đồng nghĩa mã hóa cho cùng một aa thường có 2 base đầu tiên giống nhau, nhưng khác nhau ở nucleotide thứ 3

- Trừ một số ngoại lệ, mã di truyền có tính phổ biến cho tất cả sinh vật

- Một codon chỉ mã hóa cho một loại aa, trường hợp ngoại lệ là AUG vừa mã hóa cho Met nội, vừa mã hóa cho aa mở đầu N-formyl Methionin trong tế bào nhân nguyên thủy hoặc methionin trong tế bào nhân thật

Sự khác biệt trong phiên mã ở tế bào nhân nguyên thủy và tế bào nhân thật

Chỉ có 1 loại ARN polymerase chịu trách

nhiệm tổng hợp tất cả các loại ARN Có 3 loại ARN polymerase:- ARN polymerase I tổng hợp rARN

- ARN polymerase II tổng hợp mARN

- ARN polymerase III tổng hợp các loại ARN kích thước nhỏ, tARN, ARN 5S mARN thường chứa thông tin nhiều gen

nối tiếp nhau (polycistron)

mARN chứa thông tin của một gen (monocistron)

Promoter gồm 2 trình tự:

- TATAAT (hộp TATA hay Pribnow),

cách điểm xuất phát 6-8 base, có base trung

tâm -10

- Hộp TATA có base trung tâm -25 hay -30

ở động vật có vú và từ -60 đến -120 ở nấm men

- Trình tự TTGACA có base trung tâm -35

Vùng này tham gia vào việc gắn trực tiếp

ARN polymerase

- Hộp TÂT hoạt động có hiệu quả cùng với

2 trình tự tương ứng phía trước khoảng -40

là CCAAT (hộp CAT) và -110 giàu GC có chức năng liên kết với các yếu tố phiên mã (TF)

Phiên mã và dịch mã diễn ra đồng thời Dịch mã bắt đầu khi phiên mã kết thúc

Bản phiên mã được sử dụng ngay vào dịch

mã, không qua biến đổi

Bản phiên mã đầu tiên (pre-ARN) phải qua cắt nối (splicing) mới đưa vào dịch mãQuá trình hậu phiên mã không gắn chóp

(CAP) ở đầu 5’ và đuôi polyA ở đầu 3’

Gắn thêm chóp (CAP) 7-methylguanosine

ở đầu 5’ và cuối mARN phía 3’ thêm đuôi polyA (100-200A)

So sánh ARN-polymerase của tế bào nhân nguyên thủy và nhân thật:

- Giống nhau: + Cấu trúc đa phân tử

- Khác nhau:

Chỉ có 1 loại ARN polymerase chịu trách

nhiệm tổng hợp tất cả các loại ARN Có 3 loại ARN polymerase:- ARN polymerase I tổng hợp rARN

- ARN polymerase II tổng hợp mARN

- ARN polymerase III tổng hợp các loại ARN kích thước nhỏ, tARN, ARN 5S

Bài 4 SINH TỔNG HỢP PROTEIN

1 Cấu tạo của các tiểu đơn vị ribosom ở tế bào nhân nguyên thủy và tế bào nhân thật.

- Ribosom ở tế bào nhân nguyên thủy: gồm 2 tiểu đơn vị:

+ Tiểu đơn vị lớn: gồm 2 phân tử rARN (23S và 5S) và 34 phân tử protein

+ Tiểu đơn vị nhỏ: có 1 rARN 16S và 21 phân tử protein

+ rARN có cấu trúc không gian phức tạp do nhiều đoạn bắt cặp với nhau nhờ có trình tự

nucleotide bổ sung

- Ribosom ở tế bào nhân thật: gồm 2 tiểu đơn vị, cấu tạo bởi rARN và protein:

+ Tiểu đơn vị lớn: gồm 3 phân tử rARN (28S, 5.8S và 5S) và 45 phân tử protein

+ Tiểu đơn vị nhỏ: có 1 rARN 18S và 33 phân tử protein

2 Quá trình phiên mã và dịch mã diễn ra như thế nào ở E.coli

- Khi ribosom đầu tiên dịch mã mARN được một đoạn, các ribosom khác có thể tiếp tục gắn vào phía trước để dịch mã

- Khoảng 15-20 ribosome có thể gắn cùng lúc trên mARN

- Các ribosome xếp thành chuỗi trên mARN tạo nên cấu trúc polyribosome hay còn gọi là polysome

3 Cấu trúc của mARN hoàn chỉnh ở tế bào nhân nguyên thủy và tế bào nhân thật.

Thông tin di truyền là một trình tự thẳng của của các base nu tạo thành các codon trên mARN trong

đó lần lượt chứa các vùng sau:

+ Vùng không mã ở đầu 5’ được gọi là trình tự dẫn bao gồm một trình tự bổ sung với rARN của

ribosom để gắn ribosom vào mARN Các trình tự dẫn đầu 5’ rất khác nhau về độ dài ở các loại mARN khác nhau, nhìn chung, ở các tế bào nhân thật đều dài hơn ở tế bào nhân nguyên thủy

+ Chóp (CAP): Ngoài trình tự không mã hóa ở đầu 5’ và 3’, các mARN tế bào chất nhân thật có gắn

thêm “chóp” (CAP) 7-methyl guanosine triphosphate ở đầu 5’ Đặc điểm này liên quan đến sự tượng tác giữa mARN và ribosom

+ Phần mở đầu: chứa một bộ ba mở đầu (thường là AUG)

+ Vùng mã hóa (coding region) của mARN chứa các codon qui định trình tự acid amin của protein

Trình tự codon được đọc theo hướng 5’ đến 3’ trên mARN

+ Phần kết thúc: là một trong các bộ ba kết thúc (codon stop: UAA, UGA hay UAG)

+ Trình tự không mã hóa nằm tại phần chấm dứt của phân tử mARN Các trình tự 3’ và 5’ không

mã còn được gọi là các vùng không phiên dịch, viết tắt là UTR (untranslated regions) Các vùng không phiên dịch ở đầu tận cùng 3’ có chiều dài rất khác nhau

+ Đuôi poly(A): Hầu hết các phân tử mARN tế bào nhân thật ở đầu 3’ có thêm đuôi 100-200 Adenin

(polyA) Chức năng của đuôi poly(A) chưa rõ ràng Chúng đóng vai trò quan tọng trong việc bảo vệ mARN khỏi bị thủy giải của exonuclease, nhưng không cần thiết cho sự dịch mã Một vài loại mARN như histon-mARN và mARN vi khuẩn không có đuôi poly(A)

4 ARN vận chuyển và các enzyme tổng hợp tARN-aminoacyl synthetase (tARN duy nhất, tARN đông nhận)

- tARN:

+ Các tARN có 1 anticodon tương ứng với acid amin mà nó vận chuyển

+ Mỗi tARN đặc hiệu cho một loại acid amin riêng biệt

+ Có thể có vài tARN giải mã cho cùng một acid amim Các loại tARN chuyên chở cùng một acid amin thì được gọi là tARN đồng nhận

+ Có vài bộ ba trong mã di truyền cùng giải mã cho một loại acid amin, ngoại trừ methionine và tryptophan Những bộ ba đồng loại này được gọi là codon chéo, đây là điểm khác nhau quan trọng nhất giữa loài này và loài khác

+ Số lượng các tARN biến động theo loài: nhân nguyên thủy 30-40, nhân thật 50

+ Các tARN phải được nhận biết chuyên biệt đồng thời bởi mARN và bởi enzyme gắn acid amin vào tARN tương ứng (enzyme tARN-aminoacyl synthetase) Điều này giúp giải quyết trở ngại không gian trong quá trình dịch mã

+ Kích thước của codon lớn hơn so với acid amin, nên nếu một acid amin nhận biết và gắn trực tiếp lên một codon trên mARN thì nó sẽ cách với acid amin tương ứng với codon kế cận để hình thành liên kết peptid

+ Bước đọc sửa sai chỉ được thực hiện ở giai đoạn aminoacyl hóa bởi chính enzyme

tARN-aminoacyl synthetase

5 Hai bước aminoacyl hóa

Bước 1: Hình thành aminoacyl-adenylate hoạt hóa:

- Acid amin phản ứng với ATP có enzyme xúc tác để tạo thành aminoacyl adenylate hoạt hóa

- Pyrophosphat tạo ra bị thủy giải thành 2 phân tử phosphat vô cơ Phản ứng này tạo ra một năng lượng thủy giải tự do tương đối cao, đẩy phản ứng theo chiều tạo aminoacyl-AMP trung gian

Bước 2: Hình thành aminoacyl-tARN: Aminoacyl-AMP được chuyển tới phân tử tARN tương ứng

bằng synthase

6 Các tARN và các codon khởi đầu.

- Trình tự mã của phân tử mARN được khởi đầu với bộ ba AUG, rất hiếm hoi các bộ ba khác (AUU, UUG) hoạt động như bộ ba khởi đầu

- Chỉ có một codon mã hóa cho Met nhưng trong tế bào chất lại hiện diện 2 loại tARN có khả năng mang Met đến kết hợp với codon đó ở nhân nguyên thủy:

+ tARNmMet kết hợp với codon AUG nằm giữa phân tử mARN, có nhiệm vụ gắn Met vào chuỗi polypeptide

+ tARNiMet kết hợp với codon AUG khởi động, gắn Met mở đầu vào chuỗi polypeptide

Ở vi khuẩn, tARNiMet khởi động không chỉ vận chuyển Met mà còn vận chuyển formyl-methionin: tARN này gọi là tARNfMet (hay fMet)

Bộ ba khởi đầu AUG (GUG) AUG

tARN khởi đầu tARNfMet tARNiMet

tARN mang aa Formyl-methionin Methionin

7 Đặc điểm của sự khởi đầu tổng hợp chuỗi peptide ở vi khuẩn

- Nhận diện trình tự Shine-Dalgarno, nằm gần điểm xuất phát

- Không yêu cầu đặc biệt cho sự khởi đầu phải nằm gần với điểm khởi đầu 5’ của mARN Sự phiên dịch

có thể bắt đầu ở bất cứ điểm nào trên phân tử mARN, chứng tỏ trước bộ ba khởi đầu đã có một trình tự Shine-Dalgarno

- Các mARN tế bào nhân nguyên thủy có chứa tới vài vùng mã hóa, đúng hơn là vi khuẩn thường có polycistron mARN Đặc biệt, rõ nhất là mARN chứa operon mã hóa cho 3 loại protein khác nhau ở lac operon

- Các phân tử tARN luôn luôn gắn với ribosom như những phức base có chứa GTP và yếu tố protein

- mARN và phức hợp tARN gắn trước tiên vào bán đơn vị 30S, cả 2 bước này đều xảy ra trước khi 50S gắn vào để tạo ra phứ hợp 70S cho việc nối dài

- Diễn biến của sự khởi đầu dịch mã:

+ 30S gắn với IF3 tạo thành phức [30S-IF1-IF3] sau đó gắn vào trình tự SD

+ IF2 tạo phức 3 yếu tố với GTP và tARN khởi đầu là [IF2-GTP-fMet-tARNifMet], phức này sau

đó gắn vào phức [30S-IF3-mARN-IF1]

+ 50S gắn vào 30S để bắt đầu quá trình dịch mã

8 Đặc điểm của sự khởi đầu tổng hợp chuỗi peptide ở tế bào nhân thật.

- Trình tự dẫn mARN nhân thật không được xem như trình tự Shine-Dalgarno ở nhân nguyên thủy

- Đầu tận cùng 3’ của rARN 18S (tương đương với rARN 16S ở vi khuẩn) không có trình tự CCUCC

- Bộ ba AUG có thể chỉ là bộ ba mã hóa bình thường nhưng cũng có thể là bộ ba khởi đầu

- ARN ở nhân thật là monocistron, chúng chỉ chứa một trình tự mã hóa và khởi đầu, thường xảy ra ở bộ

ba khởi đầu AUG trong mARN

- Ở nhân thật Met-tARNiMet phải được gắn kết trước vào tiểu đơn vị 40S Điều đó cho thấy rằng đối mã (CAU) trên tARN-khởi đầu đã nhận ra AUG trong khi 40S đang quét trên mARN

- Kozak xây dựng mô hình khởi đầu sinh tổng hợp protein ở tế bào nhân thật:

+ Trước tiên đơn vị 40S của ribosom gắn vào đầu tận cùng của mARN, sau đó di chuyển dọc theo mARN tới khi gặp bộ ba khởi đầu AUG

+ Năng lượng cho sự di chuyển lấy từ sự thủy phân ATP và sự tương tác khởi đầu với mARN có thể liên quan tới cấu trúc chóp 5’ (CAP)

+ 95% các trường hợp khởi đầu nhân thật xảy ra tại bộ ba khởi đầu AUG, hầu như không dùng tới GUG

9 Diến biến quá trình khởi đầu dịch mã ở tế bào nhân thật.

Kozak xây dựng mô hình khởi đầu sinh tổng hợp protein ở tế bào nhân thật:

- 40S gắn với CAP và gắn tiếp với các yếu tố khởi đầu eIF2 và eIF3

- 40S gắn với Met-tARNi

- 40S quét dọc theo mARN dò tìm AUG và cần năng lượng ATP để tháo xoắn nút kẹp tóc

- 40S-eIF2-GTP-Met-tARNiMet-eIF3 tương tác với 60S để bắt đầu dịch mã

10 Sự nối dài của quá trình dịch mã ở tế bào nhân thật và nhân nguyên thủy

11 Diến biến kéo dài chuỗi peptide ở tế bào nhân thật và nhân nguyên thủy.

- Quá trình phiên mã trên mARN được nối dài theo hướng 5’->3’, chuỗi polypeptide được bắt đầu tổng hợp ở đầu tận cùng –N Quá trình này giống nhau ở tế bào nhân và nhân nguyên thủy

- Sự nối dài có nhiều chu kì

- Sự nối dài cần đến các yếu tố nối dài

+ Ở vi khuẩn, các yếu tố này là EF-Tu, EF-Ts, EF-G

+ Ở tế bào nhân thật: EF-1α (tương ứng với EF-Tu), EF-2 (tương ứng với EF-G)

- Trên ribosom có 2 vị trí A và P:

+ Vị trí A: là vị trí aminoacyl (hay acceptor)

+ Vị trí P: là vị trí peptidyl, nối giữa phức hợp peptidyl-tARN

- Diễn biến của quá trình kéo dài dịch mã:

+ Ở điểm khởi đầu mỗi chu kì, chỉ có vị trí P bị chiếm chỗ bằng một peptidyl-tARN chứa chuỗi polypeptide mới sinh gắn với tARN mang aa vừa được thêm vào

+ Vị trí P được going hàng với codon kế sau đã được dịch mã, trong khi đó vị trí A going hàng với codon kế tiếp của mARN Lúc này, vị trí A trống Bất kì aminoacyl-tARN (ngoại trừ tARN-khởi đầu) đều vào vị trí A, chúng lưu lại đây nếu anticodon khớp mã với codon tại A Bằng cách này, aminoacyl-tARN chính xác được lựa chọn và chọn được đúng acid amin cho sự hình thành chuỗi polypeptide mới sinh Việc gắn này là gắn phức hợp giữa EF-Tu hoặc EF-1 với GTP giống như tARN-khởi đầu gắn kết trong suốt giai đoạn khởi đầu

+ Tiếp theo là quá trình thủy phân GTP giải phóng GDP và Pi:

 GDP được phóng thích khỏi ribosom sẽ gắn kết với nhân tố nối dài tạo phức hợp GDP] hay [EF-1-GDP]

[EF-Tu- Để nhân tố nối dài lại có thể tham gia vào quá trình gắn kết aminoacyl-tARN tiếp theo vào ribosom thì GDP phải được thay bởi GTP

 Ở vi khuẩn, nhân tố EF-Ts đóng vai trò trung gian cho việc chuyển đổi GDP/GTP, tương tự các nhân tố của protein-G liên quan tới sự tải nạp tín hiệu hormone + Giữa acid amin sau cùng của chuỗi mới sinh với acid amin trên tARN ở vị trí A, hình thành liên kết peptid Phản ứng này được xúc tác bởi enzyme peptidyl-transferase Kết quả là tARN ở vị trí P lúc bấy giờ không còn mang acid amin hoặc là tách khỏi chuỗi polypeptide

+ Bước chuyển vị cuối cùng của giai đoạn nối dài cần một yếu tố nối dài khác là EF-G hoặc EF-2

và GTP GTP thủy phân thành GDP và Pi Sự chuyển vị có 3 hiện tượng xảy ra đồng thời:

• tARN vận chuyển xong được tách khỏi vị trí P

• Peptidyl-tARN di chuyển từ vị trí A sang vị trí P

• Ribosom chuyển dịch theo từng bộ ba trên mARN, do đó bộ ba tiếp theo được đưa vào gióng hàng với vị trí A

- Quá trình chuyển vị nối dài sẽ được lặp lại cho đến khi có một bộ ba kết thúc xuất hiện tại vị trí A

- Vai trò của GTP trong quá trình nối dài chưa rõ ràng Sự thủy phân GTP cung cấp năng lượng cho việc tạo nên liên kết peptid và cho bước chuyển vị, nhưng nó có thể liên quan một cách không ổn định đến mức độ chính xác của sự chuyển vị

Đặc điểm chuyển vị trong quá trình nối dài dịch mã.

- Bước chuyển vị cuối cùng của giai đoạn nối dài cần một yếu tố nối dài khác là EF-G hoặc EF-2 và GTP GTP thủy phân thành GDP và Pi

- Sự chuyển vị có 3 hiện tượng xảy ra đồng thời:

+ tARN vận chuyển xong được tách khỏi vị trí P

+ Peptidyl-tARN di chuyển từ vị trí A sang vị trí P

+ Ribosom chuyển dịch theo từng bộ ba trên mARN, do đó bộ ba tiếp theo được đưa vào gióng hàng với vị trí A

- Quá trình chuyển vị nối dài sẽ được lặp lại cho đến khi có một bộ ba kết thúc xuất hiện tại vị trí A

- Vai trò của GTP trong quá trình nối dài chưa rõ ràng Sự thủy phân GTP cung cấp năng lượng cho việc tạo nên liên kết peptid và cho bước chuyển vị, nhưng nó có thể liên quan một cách không ổn định đến mức độ chính xác của sự chuyển vị

- Ở tế bào nhân thật chỉ có một yếu tố phóng thích eRF

Vi khuẩn E.coli Tế bào nhân thật

RF-1 (cho UAA hoặc UAG) eRF (phù hợp với cả 3 stop

codon)RF-2 (cho UAA hoặc UGA)

RF-3 (Kích thích RF-2 và RF1)

- Sự kết thúc liên quan đến việc phân giải liên kết giữa acid amin cuối cùng của chuỗi peptid mới sinh và tARN cuối cùng Phản này được xúc tác bởi enzyme peptidyl transferase của ribosom và đòi hỏi GTP Nhờ đó polypeptide hoàn chỉnh được phóng thích

- Sau đó, 2 tiểu đơn vị ribosom và mARN được phóng thích Tất cả các thành phần tham gia chu trình đều được sử dụng lại

13 Cơ chế chính xác hóa quá trình dịch mã (aminoacyl hóa tARN).

- Một tARN có thể nhận thêm một acid amin không đúng hoặc enzyme aminoacyl-tARN synthetase dùng tARN có anticodon không chuyên biệt cho các acid amin được gắn vào nó

- Một số acid amin có cấu trúc tương tự với acid amin cần được đưa vào cho nên các enzyme

aminoacyl-tARN synthetase phải có cách thức chọn đúng

- Ví dụ: Enzyme isoleucyl-tARN synthetase phân biệt được các acid amin nhỏ hơn isoleucin và các acid amin kỵ nước, cồng kềnh hơn Cơ chế điều chỉnh như sau:

- Enzyme isoleucyl-tARN synthetase có 2 vị trí tác động:

+ Vị trí A: xúc tác thành lập aminoacyl-tARN

+ Vị trí H: ở sát ngay vị trí A, thủy phân aminoacyl-tARN để co ra acid amin tự do và tARN

- Các bước sửa sai aminoacyl hóa tARN của enzyme isoleucyl-tARN synthetase:

+ Các acid amin lớn hơn isoleucin không vào được vị trí A Kết quả: phản ứng không xảy ra

+ Các acid amin nhỏ hơn isoleucin vào vị trí A và tạo aminoacyl-tARN, nhưng cũng đi vào được

vị trí H nên bị thủy phân thành 2 phần tARN và acid amin Kết quả: phản ứng không xảy ra

+Chỉ có isoleucin gắn vào vị trí A tạo isoleucyl-tARN nhưng không thể gắn vào vị trí H và do đó không bị thủy phân Kết quả: Acyl hóa chính xác isoleucin

14 Nguyên nhân kết thúc sớm, kết thúc muộn của quá trình dịch mã

- Các sai sót của giai đoạn kết thúc có thể xảy ra do kết thúc sớm hoặc kết thúc muộn do đọc quá

- Sự đọc quá do:

+ Lỗi của bộ máy dịch mã không nhận ra codon dừng, acid amin được đưa vào và dịch mã liên tục qua

cả vùng không mã hóa 3’mARN

+ Một đột biến ở codon đối mã nào đó làm cho codon đối mã này giải mã được codon kết thúc

- Sai sót ước tính ở tỉ lệ 1/3000 gốc acid amin được kết hợp và thường những lỗi này được định vị mà không quan trọng đối với cấu trúc hoặc chức năng của protein

* So sánh sự dịch mã ở tế bào nhân nguyên thủy và tế bào nhân thật:

Ribosom: gồm 2 tiểu đơn vị

+ Tiểu đơn vị lớn: gồm 2 phân tử rARN (23S

tốc độ tổng hợp protein nhanh Dịch mã xảy ra khi phiên mã hoàn tất nên tốc độ tổng hợp protein chậm, dịch mã xảy ra

trong tế bào chất còn phiên mã diễn ra trong nhân

mARN:

+ không có chóp ở đầu 5’

+ trình tự dẫn đầu 5’(5’UTR) ngắn hơn

+ có nhiều vùng mã hóa (polycistron)

+ trình tự không dịch mã ở đầu tận cùng

3’(3’UTR) không có đuôi poly(A)

+ có chóp ở đầu 5’ là 7-methyl Guanosine triphosphat

+ trình tự dẫn đầu 5’(5’UTR) dài hơn+ có 1 vùng mã hóa (monocistron)+ trình tự không dịch mã ở đầu tận cùng 3’(3’UTR) có đuôi poly(A)

tARN:

+ Số lượng: 30-40

+ Codon khởi đầu: AUG (GUG)

+ Acid amin mở đầu: Formyl-methionin

+ tARN khởi đầu: tARNfMet

+ Số lượng: 50+ Codon khởi đầu: AUG+ Acid amin mở đầu: Formyl-methionin + tARN khởi đầu: tARNiMet

Yếu tố khởi đầu:

Có 3 yếu tố khởi đầu:

+ IF-1: Vai trò chưa rõ

+ IF-2: Gắn Met-tARN (hoặc fMet-tARN)

vào ribosom thành phức hợp với GTP

+ IF-3: Ngăn cản sự kết nối của các tiểu

đơn vị

Có 10 yếu tố khởi đầu:

+ eIF-1: Vai trò chưa rõ+ eIF-2: Gắn Met-tARN (hoặc fMet-tARN) vào ribosom thành phức hợp với GTP+ eIF-3: Ngăn cản sự kết nối của các tiểu đơn vị

+ eIF-4A, eIF-4B, eIF-4E, eIF-4F: Nhóm yếu

tố liên quan đáp ứng cho việc gắn chóp 5’ vào đầu mARN và tháo xoắn cấu trúc bậc 2 tạo điều kiện cho ribosom đậu vào codon khởi đầu

+ eIF-5: Giải phóng eIF-2 và eIF-3 khỏi ribosom và giúp cho tiểu đơn vị 60S kết nối+ eIF-6: Tham gia vào việc tách ribosom thành các tiểu đơn vị

+ GEF: Yếu tố biến đổi nu Guanin: tái sinh

eIF-2 bởi sự biến đổi trung gian GDP thành GTP trong quá trình tương tự để tái sinh EF-

Tu bởi EF-Ts

Khởi đầu chuỗi peptide:

+ 30S nhận diện được đúng codon khởi đầu

của mARN nhờ trình tự Shine-Dalgarno là

trình tự polypurin ngắn ở đầu 5’ của mARN

bổ sung với trình tự giàu pyrimidin ở đầu 3’

của rARN 16S

+ Diễn biến của quá trình khởi đầu dịch mã:

• 30S gắn với IF1và IF3 tạo thành

phức [30S-IF1-IF3] sau đó gắn vào trình

tự SD

• IF2 tạo phức 3 yếu tố với GTP và

tARN khởi đầu là

[IF2-GTP-fMet-tARNifMet], phức này sau đó gắn vào

• 40S gắn với CAP và gắn tiếp với các yếu tố khởi đầu eIF2 và eIF3

• 40S gắn với Met-tARNi

• 40S quét dọc theo mARN dò tìm AUG và cần năng lượng ATP để tháo xoắn nút kẹp tóc

• Phức tARNiMet-eIF3] tương tác với 60S để bắt đầu dịch mã

[40S-eIF2-GTP-Met-Nối dài: Các yếu tố nối dài:

+ EF-Tu: Mang các aminoacyl-tARN tới vị trí

A của ribosom

+ EF-Ts: Tái hồi EF-Tu

+ EF-G: Tham gia vào bước chuyển vị của

chu kì nối dài

+ EF-1α: Mang các aminoacyl-tARN tới vị trí

A của ribosom+ EF-1βγ-Tu: Tái hồi EF-1α+ EF-2: Tham gia vào bước chuyển vị của chu

kì nối dài

Kết thúc: Các yếu tố kết thúc:

+ RF-1: cho UAA hoặc UAG

+ RF-2: cho UAA hoặc UGA

+ RF-3: kích thích RF-1 và RF-2

eRF: phù hợp với cả 3 stop codon

Nhu cầu năng lượng:

+ Aminoacyl hóa tARN:

ATP -> AMP + PPi

+ Khởi đầu:

GTP -> GDP + Pi, kết hợp với IF-2

+ Nối dài:

GTP -> GDP + Pi, kết hợp với EF-Tu

GTP -> GDP + Pi, kết hợp với EF-G

+ Kết thúc:

Không cần năng lượng

ATP -> AMP + PPiGTP -> GDP + Pi, kết hợp với eIF-2ATP -> ADP + Pi, kết hợp với việc gắn chóp

và tháo xoắn mARN (chưa rõ có bao nhiêu phân tử ATP được sử dụng)

GTP -> GDP + Pi, kết hợp với EF-1GTP -> GDP + Pi, kết hợp với EF-2 GTP -> GDP + Pi