Nghiên cứu đánh giá thực trạng vi khuẩn Helicobacter pylori ở bệnh nhân viêm dạ dày trên địa bàn tỉnh Hải Dương bằng kỹ thuật sinh học phân tử

Nghiên cứu đánh giá thực trạng vi khuẩn Helicobacter pylori ở bệnh nhân viêm dạ dày trên địa bàn tỉnh Hải Dương bằng kỹ thuật sinh học phân tử Viêm dạ dày là một bệnh lý tƣơng đối rõ ràng, là hậu quả của sự kích thích niêm mạc bởi các yếu tố ngoại sinh hoặc nội sinh. Viêm dạ dày chủ yếu gây ra bởi tác nhân nhiễm khuẩn và các rối loạn miễn dịch, bệnh tự miễn và rất nhiều nguyên nhân khác. Helicobacter pylori đƣợc biết đến nhƣ là một nguyên nhân chính hay thủ phạm của bệnh viêm dạ dày mãn tính, loét dạ dày tá tràng và là yếu tố đƣợc công nhận nhiều nhất gây ung thƣ dạ dày, đặc biệt là ở các nƣớc đang phát triển. Helicobacter pylori đƣợc phát hiện bởi Warren và Marhall (Úc) năm 1982. Nhiều nghiên cứu cũng chỉ ra rằng Helicobacter pylori là một yếu tố quan trọng gây bệnh tiền ung thƣ dạ dày và ung thƣ dạ dày. Ngƣời nhiễm Helicobacter pylori tăng nguy cơ ung thƣ dạ dày gấp 6 lần so với ngƣời bình thƣờng. Helicobacter pylori làm giảm khả năng tiết ra dịch của dạ dày, làm cho dạ dày dễ bị tác động bởi axit và gây loét dạ dày, đồng thời tạo điều kiện cho các vi khuẩn non- Helicobacter pylori ƣa kiềm có khả năng chuyển hóa nitrite thành các chất tiền ung thƣ. Nhiễm Helicobacter pylori - căn nguyên các bệnh dạ dày của hơn 70% ngƣời Việt Nam gây ảnh hƣởng đến khả năng lao động cũng nhƣ chất lƣợng sống của ngƣời lao động. Ngƣời lao động bị nhiễm vi khuẩn Helicobacter pylori vì những lý do nhƣ môi trƣờng sống thiếu vệ sinh, tình trạng vệ sinh an toàn thực phẩm không bảo đảm. Trong những năm gần đây, ở Việt Nam cũng nhƣ ở nhiều nơi trên thế giới, các bệnh dạ dày liên quan đến Helicobacter pylori đã và đang đƣợc điều trị nhờ sử dụng phác đồ chống tiết và kháng sinh. Tuy vậy, trên thực tế các chủng Helicobacter pylori kháng thuốc đã xuất hiện, làm giảm hiệu lực diệt tr của thuốc và do đó nhiều bệnh nhân đƣợc điều trị nhƣng không khỏi hoặc điều trị không triệt để. Theo Nguyễn Văn Thịnh (năm 2007), Amoxicillin và Clarithromycin là những2 kháng sinh đƣợc sử dụng thƣờng xuyên trong điều trị diệt Helicobacter pylori, nhƣng t khoảng năm 2010, tỷ lệ các chủng Helicobacter pylori kháng thuốc đã lên tới 23,7%, cao hơn nhiều lần so với các nƣớc Châu Âu, Mỹ, Tây Á, Hồng Công, Nhật Bản và cao hơn một chút so với Hàn Quốc. Các nghiên cứu nói trên đƣợc tiến hành chủ yếu ở các thành phố công nghiệp lớn nhƣ Hà Nội, thành phố Hồ Chí Minh. Tại Hải Dƣơng, Helicobacter pylori đƣợc chẩn đoán là có trong dạ dày ngƣời bệnh dựa trên hình ảnh nội soi kết hợp nuôi cấy Helicobacter pylori t dịch tiêu hóa, làm test Urease để phát hiện Helicobacter pylori. Nuôi cấy Helicobacter pylori t mẫu bệnh phẩm đòi hỏi thời gian tƣơng đối dài và khi các vi khuẩn bội nhiễm non - Helicobacter pylori đi kèm làm cho việc phân tích trở nên khó khăn hơn. Mặt khác, cho tới nay vẫn chƣa có một nghiên cứu nào về tình trạng nhiễm Helicobacter pylori và khả năng kháng thuốc của Helicobacter pylori trên địa bàn tỉnh Hải Dƣơng. Do đó, ứng dụng các kỹ thuật y sinh học hiện đại nhƣ PCR để phát hiện nhanh và chính xác Helicobacter pylori, đồng thời xác định tính kháng kháng sinh của chủng Helicobacter pylori nhằm hỗ trợ điều trị bệnh viêm dạ dày ở các bệnh viện tuyến tỉnh nói chung và ở một số bệnh viện tuyến huyện tại Hải Dƣơng là rất cần thiết trong việc nâng cao hiệu quả điều trị bệnh, qua đó góp phần giảm tải cho các bệnh viện tuyến trung ƣơng. Xuất phát t ý nghĩa lý luận và thực tiễn đó chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu đánh giá thực trạng vi khuẩn Helicobacter pylori ở bệnh nhân viêm dạ dày trên địa bàn tỉnh Hải Dƣơng bằng kỹ thuật sinh học phân tử”. 2. Mục đích nghiên cứu. 2.1. Mục tiêu chung. Góp phần trong chẩn đoán và điều trị viêm dạ dày ở bệnh nhân nhiễm vi khuẩn Helicobacter pylori đồng thời có giải pháp định hƣớng kiểm soát và điều trị hiệu quả căn bệnh này tại tỉnh Hải Dƣơng.3 2.2. Mục tiêu cụ thể. - Đánh giá đƣợc thực trạng nhiễm Helicobacter pylori và Helicobacter pylori kháng thuốc ở các bệnh nhân viêm dạ dày trên địa bàn tỉnh Hải Dƣơng. - Bƣớc đầu đƣa một số giải pháp kiểm soát và điều trị hiệu quả căn bệnh viêm dạ dày trên địa bàn tỉnh Hải Dƣơng. 3. Nội dung của đề tài - Phân tích dịch tễ học đánh giá thực trạng bệnh nhân viêm dạ dày do đang điều trị tại bệnh viện đa khoa tỉnh Hải Dƣơng. - Phân tích đoạn gen 16S rRNA của Helicobacter pylori trong chuẩn đoán bệnh nhân viêm dạ dày do Helicobacter pylori đang điều trị tại bệnh viện đa khoa Hải Dƣơng. - Nghiên cứu thực trạng vi khuẩn Helicobacter pylori kháng kháng sinh ở bệnh nhân viêm dạ dày do Helicobacter pylori đang điều trị tại bệnh viện đa khoa Hải Dƣơng. - Bƣớc đầu đề xuất một số giải pháp kiểm soát và điều trị hiệu quả căn bệnh viêm dạ dày trên địa bàn tỉnh Hải Dƣơng. 4. Ý nghĩa của đề tài 4.1. Ý nghĩa khoa học Kết quả thực trạng nhiễm vi khuẩn H. pylori và tình trạng kháng kháng sinh là cơ sở khoa học cho việc kiểm soát, đánh giá và điều trị hiệu quả căn bệnh viêm dạ dày trên địa bàn tỉnh Hải Dƣơng. 4.2. Ý nghĩa thực tiễn Kết quả nghiên cứu là cơ sở cho việc ứng dụng quy trình phát hiện nhanh, chính xác H. pylori và H. pylori kháng thuốc trong điều trị viêm dạ dày trên địa bàn tỉnh Hải Dƣơng.4 PHẦN II - NỘI DUNG CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. MỘT SỐ HIỂU BIẾT VỀ H. PYLORI 1.1.1. Lịch sử phát hiện. T hơn 100 năm trƣớc đây, Gulio Bizzozero lần đầu tiên ghi nhận sự hiện diện của một loại vi khuẩn sống ở dạ dày chó. Tiếp theo, nhiều nhà khoa học cũng tìm thấy một loại xoắn khuẩn hiện diện trong lớp nhầy của dạ dày nhƣng lại thất bại trong việc nuôi cấy vi khuẩn. Năm 1970, nhà giải phẫu bệnh Robin Warren nhận xét có mối liên hệ giữa viêm dạ dày mãn tính và một loại xoắn khuẩn trong niêm mạc dạ dày. Mãi đến năm 1982, Robin Warren và ngƣời học trò của mình là Barry Marshall mới thành công nuôi cấy vi khuẩn t 11 bệnh nhân bị viêm dạ dày và Marshall đã chứng minh đƣợc những ảnh hƣởng của vi khuẩn này đối với bệnh lý dạ dày. Họ đã đặt tên cho vi khuẩn này là Campylobacter pylori dựa theo hình dạng và đặc tính tăng trƣởng. Năm 1983, phát hiện vi khuẩn Campylobacter pylori và mối liên quan của nó với bệnh loét dạ dày tá tràng đƣợc công bố trên tạp chí Lancet. Năm 2005, với phát hiện này, hai ông đã đƣợc trao tặng giải thƣởng Nobel về y học [7]. Căn cứ vào hình dạng và đặc tính tăng trƣởng của vi khuẩn mà ngƣời ta đặt tên vi khuẩn là Campylobacter pylori. Tuy nhiên dƣới kính hiển vi điện tử, vi khuẩn không giống Campylobacter vì có cấu trúc tiêm mao khác hẳn. Ngoài ra còn có những khác biệt lớn trong tính Nghiên cứu đánh giá thực trạng vi khuẩn Helicobacter pylori ở bệnh nhân viêm dạ dày trên địa bàn tỉnh Hải Dương bằng kỹ thuật sinh học phân tử Nghiên cứu đánh giá thực trạng vi khuẩn Helicobacter pylori ở bệnh nhân viêm dạ dày trên địa bàn tỉnh Hải Dương bằng kỹ thuật sinh học phân tử Nghiên cứu đánh giá thực trạng vi khuẩn Helicobacter pylori ở bệnh nhân viêm dạ dày trên địa bàn tỉnh Hải Dương bằng kỹ thuật sinh học phân tử Nghiên cứu đánh giá thực trạng vi khuẩn Helicobacter pylori ở bệnh nhân viêm dạ dày trên địa bàn tỉnh Hải Dương bằng kỹ thuật sinh học phân tử Nghiên cứu đánh giá thực trạng vi khuẩn Helicobacter pylori ở bệnh nhân viêm dạ dày trên địa bàn tỉnh Hải Dương bằng kỹ thuật sinh học phân tử Nghiên cứu đánh giá thực trạng vi khuẩn Helicobacter pylori ở bệnh nhân viêm dạ dày trên địa bàn tỉnh Hải Dương bằng kỹ thuật sinh học phân tử Nghiên cứu đánh giá thực trạng vi khuẩn Helicobacter pylori ở bệnh nhân viêm dạ dày trên địa bàn tỉnh Hải Dương bằng kỹ thuật sinh học phân tử Nghiên cứu đánh giá thực trạng vi khuẩn Helicobacter pylori ở bệnh nhân viêm dạ dày trên địa bàn tỉnh Hải Dương bằng kỹ thuật sinh học phân tử Nghiên cứu đánh giá thực trạng vi khuẩn Helicobacter pylori ở bệnh nhân viêm dạ dày trên địa bàn tỉnh Hải Dương bằng kỹ thuật sinh học phân tử Nghiên cứu đánh giá thực trạng vi khuẩn Helicobacter pylori ở bệnh nhân viêm dạ dày trên địa bàn tỉnh Hải Dương bằng kỹ thuật sinh học phân tử Nghiên cứu đánh giá thực trạng vi khuẩn Helicobacter pylori ở bệnh nhân viêm dạ dày trên địa bàn tỉnh Hải Dương bằng kỹ thuật sinh học phân tử Nghiên cứu đánh giá thực trạng vi khuẩn Helicobacter pylori ở bệnh nhân viêm dạ dày trên địa bàn tỉnh Hải Dương bằng kỹ thuật sinh học phân tử Nghiên cứu đánh giá thực trạng vi khuẩn Helicobacter pylori ở bệnh nhân viêm dạ dày trên địa bàn tỉnh Hải Dương bằng kỹ thuật sinh học phân tử Nghiên cứu đánh giá thực trạng vi khuẩn Helicobacter pylori ở bệnh nhân viêm dạ dày trên địa bàn tỉnh Hải Dương bằng kỹ thuật sinh học phân tử Nghiên cứu đánh giá thực trạng vi khuẩn Helicobacter pylori ở bệnh nhân viêm dạ dày trên địa bàn tỉnh Hải Dương bằng kỹ thuật sinh học phân tử Nghiên cứu đánh giá thực trạng vi khuẩn Helicobacter pylori ở bệnh nhân viêm dạ dày trên địa bàn tỉnh Hải Dương bằng kỹ thuật sinh học phân tử Nghiên cứu đánh giá thực trạng vi khuẩn Helicobacter pylori ở bệnh nhân viêm dạ dày trên địa bàn tỉnh Hải Dương bằng kỹ thuật sinh học phân tử

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI

- -

NGUYỄN THỊ THANH NHÀN

NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ THỰC TRẠNG

VI KHUẨN HELICOBACTER PYLORI Ở BỆNH NHÂN

VIÊM DẠ DÀY TRÊN ĐỊA BÀN TỈNH HẢI DƯƠNG

BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 60.42.01.21

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS Lê Thị Phượng

PGS TS Nguyễn Xuân Viết

HÀ NỘI, 2015

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này, trước hết tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành

và sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Xuân Viết và TS Lê Thị Phượng, người đã hướng dẫn tận tình và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến các cán bộ, giảng viên Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội, đặc biệt xin gửi lời cảm ơn chân thành đến tập thể cán bộ, giảng viên Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và Khoa Thăm dò chức năng bệnh viện Đa khoa tỉnh Hải Dương đã chia sẻ khó khăn, giúp tôi triển khai các nội dung của đề tài

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn các bạn bè, đồng nghiệp và gia đình đã động viên và nhiệt tình ủng hộ để tôi hoàn thành khóa học này

Hà Nội, tháng 10 năm 2015

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Thanh Nhàn

EDTA Ethylen diamine tetraacetic acid

PCR Polymerase Chain Reaction

VacA Vacuolating cytotoxin Antigen

16S r RNA 16S ribsomal RNA

23S rRNA 23S ribsomal RNA

MỤC LỤC

PHẦN I - MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục đích nghiên cứu 2

3 Nội dung của đề tài 3

4 Ý nghĩa của đề tài 3

PHẦN II - NỘI DUNG 4

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 MỘT SỐ HIỂU BIẾT VỀ H PYLORI 4

1.1.1 Lịch sử phát hiện 4

1.1.2 Đặc điểm sinh học của Helicobacter pylori 4

1.1.3 Đặc điểm di truyền của H pylori 6

1.1.4 Dịch tễ học về H pylori 8

1.1.5 Cơ chế gây bệnh của H pylori 8

1.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN H PYLORI 10

1.2.2 Nuôi cấy vi khuẩn H pylori 11

1.2.3 Ứng dụng PCR trong chẩn đoán nhiễm H pylori 12

1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ H.PYLORI TRÊN THẾ GIỚI 13

1.3.1 Xác định sự có mặt của H.pylori bằng phân tích trình tự gen đặc hiệu 16S rRNA 13

1.3.1.1 Vị trí, cấu trúc và chức năng của gen 16S rRNA 13

1.3.1.2 Tình hình nghiên cứu về gen 16S rRNA 15

1.3.2 Xác định tính kháng kháng sinh của H.pylori qua phân tích trình tự gen 23S RNA 16

1.3.2.1 Tiêu chuẩn chọn kháng sinh điều trị H pylori 16

1.3.2.2 Dịch tễ học của kháng kháng sinh 16

1.3.2.3 Tình hình nghiên cứu về gen 23S rRNA liên quan đến kháng kháng

sinh ở H pylori 17

1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ H PYLORI TẠI VIỆT NAM 19

1.5 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU H PYLORI TẠI HẢI DƯƠNG 22

CHƯƠNG II- ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 23

2.2 HÓA CHẤT VÀ TRANG THIẾT BỊ 23

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.3.1 Cỡ mẫu 27

2.3.2 Phương pháp lấy mẫu 27

2.3.3 Phương pháp tách chiết DNA t mẫu bệnh phẩm 27

2.3.4 Điện di 28

2.3.5 Định lượng, định tính DNA bằng quang phổ kế 29

2.3.6 Phản ứng PCR khuếch đại gen 16S rRNA xác định sự có mặt của H pylori 30

2.3.7 Phản ứng PCR khuếch đại gen 23S rRNA xác định đột biến kháng thuốc 32

2.3.8 Phân tích và xử lý số liệu: 33

2.3.8.1 Về các yếu tố dịch tễ học 33

2.3.8.2 Về xác định sự có mặt của H pylori dựa trên số liệu gen 16S rRNA và đột biến kháng thuốc trên gen 23S rRNA 34

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35

3.1 PHÂN TÍCH DỊCH TỄ HỌC ĐÁNH GIÁ THỰC TRẠNG BỆNH NHÂN VIÊM DẠ DÀY ĐANG ĐIỀU TRỊ TẠI BỆNH VIỆN ĐA KHOA TỈNH HẢI DƯƠNG 35

3.1.1 Tuổi và giới tính 35

3.1.2 Một số yếu tố dịch tễ khác và tỷ lệ người mắc bệnh dạ dày 37

3.2 PHÂN TÍCH GEN 16S RRNA CỦA H PYLORI TRONG CHUẨN

ĐOÁN BỆNH NHÂN VIÊM DẠ DÀY DO H PYLORI ĐANG ĐIỀU TRỊ

TẠI BỆNH VIỆN ĐA KHOA HẢI DƯƠNG 39

3.2.1 Kết quả tách chiết và tinh sạch DNA 39

3.2.2 Xác định sự có mặt của H pylori trên gen 16S rRNA 43

3.2.2.1 Tối ưu hóa điều kiện PCR và khuếch đại gen 16S rRNA 43

3.2.2.2 Xác định sự có mặt của H pylori bằng chỉ thị phân tử 16S rRNA 44

3.2.2.3 Kết quả đọc trình tự đoạn gen 16S rRNA 45

3.2.3 Kết quả về tỷ lệ nhiễm H pylori 46

3.2.4 Mối tương quan giữa yếu tố nguy cơ với tỷ lệ nhiễm H pylori 48

3.3 NGHIÊN CỨU THỰC TRẠNG VI KHUẨN H PYLORI KHÁNG KHÁNG SINH Ở BỆNH NHÂN VIÊM DẠ DÀY DO H PYLORI ĐANG ĐIỀU TRỊ TẠI BỆNH VIỆN ĐA KHOA HẢI DƯƠNG 51

3.3.1 Xác định tính kháng kháng sinh bằng chỉ thị phân tử 23S rRNA 51

3.3.1.1 Tối ưu hóa điều kiện PCR và khuếch đại gen 23S rARN 51

3.3.1.2 Xác định đột biến kháng Clarithromycin và Amoxicillin trên gen 23S rRNA 51

3.3.1.3 Kết quả đọc trình tự đoạn DNA 23S rRNA 52

3.3.2 Kết quả về tỷ lệ kháng kháng sinh của H Pylori 53

3.3.3 Mối tương quan giữa các yếu tố nguy cơ với đột biến kháng thuốc 55

3.4 Đề xuất giải pháp kiểm soát và điều trị hiệu quả bệnh viêm dạ dày trên địa bàn tỉnh Hải Dương 57

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59

PHỤ LỤC 66

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Vị trí phân loại học của H pylori 5

Bảng 1.2: Độ nhạy của thử nghiệm nuôi cấy 12

Bảng 1.3 : Tỉ lệ đề kháng kháng sinh ở các khu vực khác nhau trên thế giới 18

Bảng 2.1: Danh mục các dung dịch đã sử dụng 24

Bảng 2.2: Danh mục các hoá chất và hãng sản xuất 24

Bảng 2.3: Các thiết bị, dụng cụ phân tích thí nghiệm 25

Bảng 2.4: Trình tự các cặp mồi để xác đinh H.Pylori và H Pylori kháng thuốc 25

Bảng 2.5 Thành phần của phản ứng PCR trong tối ưu hóa điều kiện khuếch đại đoạn gen 16S rRNA 31

Bảng 2.6 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR nhân đoạn gen 16S rRNA 31

Bảng 2.7 Thành phần của phản ứng PCR trong tối ưu hóa điều kiện khuếch đại đoạn gen 23S rRNA 32

Bảng 2.8 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR nhân đoạn gen 23S rRNA 33

Bảng 3.1 Phân bố bệnh nhân viêm dạ dày theo nhóm tuổi và giới 35

Bảng 3.2 Phân bố bệnh nhân viêm dạ dày theo các yếu tố dịch tễ khác 37

Bảng 3.3 Nồng độ và độ tinh sạch DNA của mẫu bệnh nhân 40

Bảng 3.5: Tỷ lệ bệnh nhân mang đoạn gen 16S rRNA (nhiễm H pylori) 46

Bảng 3.6 Mỗi tương quan giữa yếu tố nguy cơ với tỷ lệ H pylori dương tính 48 Bảng 3.7: Tỷ lệ bệnh nhân mang đoạn DNA 23S rRNA (kháng Clarithromycin) 53

Bảng 3.8 Mối tương quan giữa các yếu tố nguy cơ và tỷ lệ H pylori kháng thuốc 55

DANH MỤC HÌNH VẼ

Hình 1.1: Vi khuẩn H pylori 5

Hình 1.2 Bản đồ di truyền của H pylori 6

Hình 1.3: Cấu trúc phân tử gen 16S rRNA và gen 23SrRNA của H pylori 7

Hình 1.4: Cơ chế gây bệnh của H pylori 9

Hình 1.5: Mẫu thử CLO test 10

Hình 1.6 Cấu trúc của gen 16S rARN đặc thù cho các loài vi khuẩn Prokaryote và Archea (Woese et al 1987) 13

Hình 3.1: Kết quả đo OD kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của DNA 42

Hình 3.2 Điện di đồ sản phẩm DNA tổng số được tách chiết t mẫu bệnh phẩm 42

Hình 3.3 Băng điện di sản phẩm PCR xác định gen 16S rRNA 45

Hình 3.4 : Kết quả đọc trình tự đoạn gen 16S rRNA 46

Hình 3.5 Băng điện di sản phẩm PCR xác định gen 23S rRNA 52

Hình 3.6 Kết quả đọc trình tự đoạn DNA 23S rRNA 53

DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1 Phân bố theo các nhóm tuổi ở bệnh nhân viêm dạ dày 36

Biểu đồ 3.2 Phân bố theo các nhóm công việc ở bệnh nhân viêm dạ dày 38

Biểu đồ 3.3 : Tỷ lệ H pylori âm tính và dương tính 47

Biểu đồ 3.4: Tỷ lệ đột biến tại vị trí A2143G và A2142C 54

PHẦN I - MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Viêm dạ dày là một bệnh lý tương đối rõ ràng, là hậu quả của sự kích thích niêm mạc bởi các yếu tố ngoại sinh hoặc nội sinh Viêm dạ dày chủ yếu gây ra bởi tác nhân nhiễm khuẩn và các rối loạn miễn dịch, bệnh tự miễn và

rất nhiều nguyên nhân khác Helicobacter pylori được biết đến như là một

nguyên nhân chính hay thủ phạm của bệnh viêm dạ dày mãn tính, loét dạ dày

tá tràng và là yếu tố được công nhận nhiều nhất gây ung thư dạ dày, đặc biệt

là ở các nước đang phát triển Helicobacter pylori được phát hiện bởi Warren

và Marhall (Úc) năm 1982 Nhiều nghiên cứu cũng chỉ ra rằng Helicobacter

pylori là một yếu tố quan trọng gây bệnh tiền ung thư dạ dày và ung thư dạ

dày Người nhiễm Helicobacter pylori tăng nguy cơ ung thư dạ dày gấp 6 lần

so với người bình thường Helicobacter pylori làm giảm khả năng tiết ra dịch

của dạ dày, làm cho dạ dày dễ bị tác động bởi axit và gây loét dạ dày, đồng

thời tạo điều kiện cho các vi khuẩn non- Helicobacter pylori ưa kiềm có khả

năng chuyển hóa nitrite thành các chất tiền ung thư

Nhiễm Helicobacter pylori - căn nguyên các bệnh dạ dày của hơn 70%

người Việt Nam gây ảnh hưởng đến khả năng lao động cũng như chất lượng

sống của người lao động Người lao động bị nhiễm vi khuẩn Helicobacter

pylori vì những lý do như môi trường sống thiếu vệ sinh, tình trạng vệ sinh an

toàn thực phẩm không bảo đảm

Trong những năm gần đây, ở Việt Nam cũng như ở nhiều nơi trên thế giới,

các bệnh dạ dày liên quan đến Helicobacter pylori đã và đang được điều trị nhờ sử

dụng phác đồ chống tiết và kháng sinh Tuy vậy, trên thực tế các chủng

Helicobacter pylori kháng thuốc đã xuất hiện, làm giảm hiệu lực diệt tr của thuốc

và do đó nhiều bệnh nhân được điều trị nhưng không khỏi hoặc điều trị không triệt

để Theo Nguyễn Văn Thịnh (năm 2007), Amoxicillin và Clarithromycin là những

kháng sinh được sử dụng thường xuyên trong điều trị diệt Helicobacter pylori, nhưng t khoảng năm 2010, tỷ lệ các chủng Helicobacter pylori kháng thuốc đã lên

tới 23,7%, cao hơn nhiều lần so với các nước Châu Âu, Mỹ, Tây Á, Hồng Công, Nhật Bản và cao hơn một chút so với Hàn Quốc

Các nghiên cứu nói trên được tiến hành chủ yếu ở các thành phố công nghiệp lớn như Hà Nội, thành phố Hồ Chí Minh Tại Hải Dương,

Helicobacter pylori được chẩn đoán là có trong dạ dày người bệnh dựa trên

hình ảnh nội soi kết hợp nuôi cấy Helicobacter pylori t dịch tiêu hóa, làm test Urease để phát hiện Helicobacter pylori Nuôi cấy Helicobacter pylori t

mẫu bệnh phẩm đòi hỏi thời gian tương đối dài và khi các vi khuẩn bội nhiễm

non - Helicobacter pylori đi kèm làm cho việc phân tích trở nên khó khăn

hơn Mặt khác, cho tới nay vẫn chưa có một nghiên cứu nào về tình trạng nhiễm

Helicobacter pylori và khả năng kháng thuốc của Helicobacter pylori trên địa

bàn tỉnh Hải Dương Do đó, ứng dụng các kỹ thuật y sinh học hiện đại như

PCR để phát hiện nhanh và chính xác Helicobacter pylori, đồng thời xác định tính kháng kháng sinh của chủng Helicobacter pylori nhằm hỗ trợ điều trị

bệnh viêm dạ dày ở các bệnh viện tuyến tỉnh nói chung và ở một số bệnh viện tuyến huyện tại Hải Dương là rất cần thiết trong việc nâng cao hiệu quả điều trị bệnh, qua đó góp phần giảm tải cho các bệnh viện tuyến trung ương Xuất phát t ý nghĩa lý luận và thực tiễn đó chúng tôi tiến hành đề tài:

“Nghiên cứu đánh giá thực trạng vi khuẩn Helicobacter pylori ở bệnh nhân viêm dạ dày trên địa bàn tỉnh Hải Dương bằng kỹ thuật sinh học phân tử”

2 Mục đích nghiên cứu

2.1 Mục tiêu chung

Góp phần trong chẩn đoán và điều trị viêm dạ dày ở bệnh nhân nhiễm vi

khuẩn Helicobacter pylori đồng thời có giải pháp định hướng kiểm soát và

điều trị hiệu quả căn bệnh này tại tỉnh Hải Dương

2.2 Mục tiêu cụ thể

- Đánh giá được thực trạng nhiễm Helicobacter pylori và Helicobacter

pylori kháng thuốc ở các bệnh nhân viêm dạ dày trên địa bàn tỉnh Hải Dương

- Bước đầu đưa một số giải pháp kiểm soát và điều trị hiệu quả căn bệnh viêm dạ dày trên địa bàn tỉnh Hải Dương

3 Nội dung của đề tài

- Phân tích dịch tễ học đánh giá thực trạng bệnh nhân viêm dạ dày do đang điều trị tại bệnh viện đa khoa tỉnh Hải Dương

- Phân tích đoạn gen 16S rRNA của Helicobacter pylori trong chuẩn đoán bệnh nhân viêm dạ dày do Helicobacter pylori đang điều trị tại bệnh

viện đa khoa Hải Dương

- Nghiên cứu thực trạng vi khuẩn Helicobacter pylori kháng kháng sinh

ở bệnh nhân viêm dạ dày do Helicobacter pylori đang điều trị tại bệnh viện đa

khoa Hải Dương

- Bước đầu đề xuất một số giải pháp kiểm soát và điều trị hiệu quả căn bệnh viêm dạ dày trên địa bàn tỉnh Hải Dương

4 Ý nghĩa của đề tài

4.1 Ý nghĩa khoa học

Kết quả thực trạng nhiễm vi khuẩn H pylori và tình trạng kháng kháng

sinh là cơ sở khoa học cho việc kiểm soát, đánh giá và điều trị hiệu quả căn bệnh viêm dạ dày trên địa bàn tỉnh Hải Dương

4.2 Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả nghiên cứu là cơ sở cho việc ứng dụng quy trình phát hiện

nhanh, chính xác H pylori và H pylori kháng thuốc trong điều trị viêm dạ

dày trên địa bàn tỉnh Hải Dương

PHẦN II - NỘI DUNG CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 MỘT SỐ HIỂU BIẾT VỀ H PYLORI

1.1.1 Lịch sử phát hiện

T hơn 100 năm trước đây, Gulio Bizzozero lần đầu tiên ghi nhận sự hiện diện của một loại vi khuẩn sống ở dạ dày chó Tiếp theo, nhiều nhà khoa học cũng tìm thấy một loại xoắn khuẩn hiện diện trong lớp nhầy của dạ dày nhưng lại thất bại trong việc nuôi cấy vi khuẩn Năm 1970, nhà giải phẫu bệnh Robin Warren nhận xét có mối liên hệ giữa viêm dạ dày mãn tính và một loại xoắn khuẩn trong niêm mạc dạ dày Mãi đến năm 1982, Robin Warren và người học trò của mình là Barry Marshall mới thành công nuôi cấy vi khuẩn t

11 bệnh nhân bị viêm dạ dày và Marshall đã chứng minh được những ảnh hưởng của vi khuẩn này đối với bệnh lý dạ dày Họ đã đặt tên cho vi

khuẩn này là Campylobacter pylori dựa theo hình dạng và đặc tính tăng trưởng Năm 1983, phát hiện vi khuẩn Campylobacter pylori và mối liên quan của nó

với bệnh loét dạ dày tá tràng được công bố trên tạp chí Lancet Năm 2005, với phát hiện này, hai ông đã được trao tặng giải thưởng Nobel về y học [7]

Căn cứ vào hình dạng và đặc tính tăng trưởng của vi khuẩn mà người ta

đặt tên vi khuẩn là Campylobacter pylori Tuy nhiên dưới kính hiển vi điện

tử, vi khuẩn không giống Campylobacter vì có cấu trúc tiêm mao khác hẳn

Ngoài ra còn có những khác biệt lớn trong tính chất sinh hóa và cấu trúc chuỗi

RNA Do đó hiện nay vi khuẩn được đặt lại là Helicobacter pylori [44,45]

1.1.2 Đặc điểm sinh học của Helicobacter pylori

Về mặt sinh học, Helicobacter pylori (H pylori) là vi khuẩn Gram âm

không tạo bào tử, có lông roi, một đầu được cấu tạo t các sợi bao bọc bởi lớp

vỏ bên ngoài có tác dụng bảo vệ khỏi axít dạ dày Dưới kính hiển vi, vi khuẩn

có hình xoắn cong, đường kính khoảng 0,3 - 1 µm, dài 1,5 -10 µm Ngoài ra,

đôi khi cũng gặp H pylori ở dạng hình cầu coccoid Cấu trúc của vi khuẩn

gồm có màng ở bên trong, lớp peptidoglycan ở giữa và lớp lipopolysaccharide

kị nước ở bên ngoài [20]

Hình 1.1: Vi khuẩn H pylori Bảng 1.1: Vị trí phân loại học của H pylori

Giới(regnum): Bacteria Họ (familia): Helicobacteraceae Ngành(phylum): Proteobacteria Chi (genus): Helicobacter

vi hiếu khí Trong dạ dày người, H pylori sống trong phần sâu của lớp màng

nhầy của niêm mạc dạ dày, giữa lớp nhầy với bề mặt của lớp tế bào biểu mô

và ở các vùng nối giữa các tế bào này [21] Vi khuẩn đã thiết lập một loạt các

cơ chế thích nghi để sống sót và tương tác chặt chẽ với vật chủ Vì thế H

pylori có khả năng sống dai dẳng hàng chục năm trong dạ dày của người Sự

tồn tại của nó trong môi trường acid dạ dày còn nhờ tác dụng bảo vệ của enzym urease tạo ra môi trường kiềm xung quanh vi khuẩn Trong điều kiện

không thuận lợi hoặc sau điều trị bằng một số kháng sinh H pylori có thể gặp

ở dạng hình cầu và có thể chuyển thành dạng hoạt động [7] Đây là dạng biến thể kháng lại một phần chu trình sống của vi khuẩn và có vai trò quan trọng

trong việc lây truyền bệnh Goodwin gọi đây là dạng “ngũ” và nhờ nó H

pylori tồn tại lâu hơn ở môi trường bên ngoài trong điều kiện không thuận lợi

Tạ Long và cộng sự nhận xét về đặc điểm siêu cấu trúc của H pylori có thể ở

dạng hình cầu hoặc hình oval, một đầu có chùm lông được quan sát dưới kính hiển vi điện tử [7]

1.1.3 Đặc điểm di truyền của H pylori

H pylori có kích thước genome bằng khoảng 1/3 kích thước genome của

E coli và tương đương với genome của Haemophilus influenza Genome của

H pylori là một nhiễm sắc thể mạch vòng có kích thước khoảng 1,67 Mb,

gồm khoảng 1600 gen tổng hợp các protein tham gia vào quá trình trao đổi chất của vi khuẩn [38,42]

Hình 1.2 Bản đồ di truyền của H pylori

Sau khi giải mã toàn bộ trình tự genome của vi khuẩn, các nhà khoa học

nhận thấy các chủng H pylori có thể mang các kiểu gen và các kiểu hình khác

nhau do đột biến Khoảng 1% genome của chúng mã hoá cho 30 protein màng ngoài, đóng vai trò quan trọng trong mối tương tác giữa vi khuẩn và các tế bào biểu mô dạ dày Các protein màng ngoài có thể sử dụng làm vắc-xin

phòng ng a nhiễm H pylori [26]

Hình 1.3: Cấu trúc phân tử gen 16S rRNA và gen 23SrRNA của H pylori

Hai chủng H pylori là: HP 26695 (phân lập ở Anh vào năm 1987) và

chủng HP 199 (phân lập ở Mỹ vào năm 1994) đã được nghiên cứu cấu trúc bộ gen Cấu trúc bộ gen của chúng bao gồm một nhiễm sắc thể vòng kích thước 1,64 đến 1,67 Mb, trong đó 90,8 - 91% được cấu tạo bởi vùng mã hóa Hai bộ gen của hai chủng khác nhau ở số lượng và bản chất của đoạn chèn cũng như

sự hiện diện hay không của gen mã hóa các enzym hạn chế Nhiễm sắc thể của vi khuẩn chứa các gen tham gia vào sự tổng hợp enzym urease, yếu tố gây độc tế bào như VacA, kháng nguyên CagA và các tiêm mao Đa số các chủng phân lập ở Đông Á có CagA và các allen gây độc tế bào của gen VacA, trong khi đó chỉ có 50% số chủng ở châu Âu và châu Mỹ là có các gen này Sự khác biệt này có thể giải thích bởi nguồn gốc địa lý của các chủng hoặc bởi sự chọn lựa ký chủ của các chủng có sự khác nhau [9] Nhìn chung bộ gen của các

chủng giống nhau t 92-99%, tuy nhiên một số chủng có sự khác biệt nhiều

hơn do H pylori thiếu sửa chữa khi nhân đôi DNA [19,32]

1.1.4 Dịch tễ học về H pylori

Nhiễm H pylori là một trong những nhiễm khuẩn mãn tính thường gặp nhất ở người Tần suất nhiễm H pylori thay đổi tùy theo tuổi, tình trạng kinh

tế, xã hội và chủng tộc Người ta ước tính có hơn 50% dân số đã bị nhiễm H

pylori, chủ yếu ở các nước đang phát triển với tần số nhiễm rất cao t 50

-90% ở lứa tuổi lớn hơn 20 và hầu hết trẻ em bị nhiễm ở độ tuổi t 2 - 8 Việt

Nam cũng là nước có tỉ lệ nhiễm H pylori cao, khoảng hơn 70% ở người lớn

Trong khi đó, ở các nước đã phát triển, tuổi bị nhiễm thường trên 50, chiếm hơn 50% dân số Tần suất này tăng thêm 10% mỗi năm [2]

Đường lây nhiễm chủ yếu gồm 3 nguồn lây chính thức:

- Nguồn lây t động vật: một số loại gia súc, gia cầm và động vật trong

tự nhiên có thể mang H pylori như chó, gà, vịt, chim, c u… và trở thành

nguồn lây cho người

- Nguồn lây t môi trường, trong đó nước được coi là yếu tố quan trọng nhất Các nghiên cứu ở Chilê và Pêru đã chỉ ra nước và thực phẩm là nguyên

nhân chính trong việc lây nhiễm H pylori

- Nguồn lây t người sang người: là đường lây phổ biến, nhất là trẻ em

và đặc biệt tại những nơi có điều kiện vệ sinh kém

Một số yếu tố được coi là nguy cơ làm tăng tỉ lệ nhiễm H pylori như

sống cùng nhau trong gia đình, trong các doanh trại quân đội, và một vài nghề như bác sĩ nội soi [22]

1.1.5 Cơ chế gây bệnh của H pylori

H pylori có khả năng tiết urease mạnh, enzym này có hoạt tính rất mạnh

phân giải urê thành amoniac Urê là sản phẩm chuyển hóa của các mô tế bào, chúng vào máu một phần và được đào thải ra ngoài qua thận Một lượng urê

tương đương t máu qua lớp niêm mạc dạ dày vào dịch dạ dày Amoniac có

phản ứng kiềm, tạo thành một lớp đệm bao quanh H pylori, giúp cho chúng

tránh được môi trường axit cao của dạ dày Mặt khác, amoniac sinh ra cũng gây độc trực tiếp đối với tế bào niêm mạc dạ dày Các enzym catalase, lipase

và glycoproteinase của H pylori phân giải chất nhầy giúp cho chúng xâm

nhập vào niêm mạc sâu hơn và phơi bày các thụ thể tế bào cho các adhesin

của H pylori gắn vào đó và dần dần phá huỷ tế bào H pylori còn tiết ra các

độc tố tế bào, các độc tố này cũng gây độc và phá huỷ tế bào [7]

Gần đây, người ta phát hiện thấy kháng nguyên CagA làm tăng tiết interleukin-8, có giả thuyết cho rằng yếu tố này cũng là một trong các yếu tố làm bệnh tiến triển đến ung thư [12,19]

Hình 1.4: Cơ chế gây bệnh của H pylori

1.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN H PYLORI

Kể t khi H pylori được tìm ra vào năm 1982, đến nay có nhiều phương pháp phát hiện H pylori Hiện nay người ta thường sử dụng một số phương pháp phát hiện H pylori như: thử nghiệm urease; nuôi cấy vi khuẩn;

phản ứng PCR…

1.2.1 Thử nghiệm Urease

Test này xác định hoạt độ enzym urease của H pylori bằng việc đặt

mẫu mô dạ dày vào môi trường lỏng (test maison, CU test) hoặc bán đặc (CLO test, HUT test) hoặc trên một cái màng gọi là Pyloritek có chứa urease

và một chất chỉ thị màu theo pH [22] Nguyên tắc của thử nghiệm là nhằm

phát hiện enzym urease của H pylori H pylori gần như là loại vi khuẩn duy

nhất trong dạ dày tiết enzym urease với khối lượng lớn (ngoại tr một số rất ít

bệnh nhân bị nhiễm Helicobacter helmanii) Enzym urease của H pylori có

trong mẫu mô dạ dày sẽ làm biến đổi urease thành amoniac (NH3), NH3 làm môi trường thuốc thử có pH kiềm, vì vậy làm thay đổi màu của chất chỉ thị theo phản ứng sau:

Urê + H2O CO2 + NH3

Hình 1.5: Mẫu thử CLO test

Độ nhạy thay đổi theo t ng loại test và thời gian đọc kết quả, gia tăng khi được ủ ở 37 - 42oC, các test được đọc trong vòng 4 giờ cho độ nhạy 70-80% Trong điều kiện hiện nay người ta th a nhận ngưỡng phát hiện vi khuẩn

là 104 - 105 vi khuẩn/ml [22,35]

Ở Việt Nam thường sử dụng CLOtest (Campylobacter Like Organism

test) trong chuẩn đoán nhiễm H pylori Chẩn đoán nhiễm H pylori bằng thử

nghiệm CLO test là một thử nghiệm nhanh chóng, rẻ tiền, đơn giản và hữu

hiệu để phát hiện H pylori Độ nhạy và độ đặc hiệu khoảng 70-80 % và nếu

sinh thiết cả hai mẫu ở hang vị và thân vị thì độ nhạy sẽ tăng thêm 4,3% so với chỉ lấy một mẫu ở hang vị [7]

Tại Việt Nam, thử nghiệm urease dương tính trong loét tá tràng là 64,7% đến 87,3% và trong loét dạ dày khoảng 60% [7]

Thực tế cho thấy, sử dụng test urea có thể cho kết quả âm tính do mật độ

vi khuẩn thấp hoặc dương tính giả do men urease của các vi khuẩn như

Enterobacter.sp và Pseudomonas.sp trong dạ dày làm cho thuốc thử chuyển

màu Trong khi đó sử dụng các kỹ thuật phân tử sẽ không bỏ sót bất cứ trường hợp nào bởi tính nhạy và tính đặc hiệu của các kỹ thuật phân tử rất cao

1.2.2 Nuôi cấy vi khuẩn H pylori

Trong chẩn đoán nhiễm H pylori, phương pháp nuôi cấy cho biết mật độ của H pylori Ngoài ra, còn cho biết dạng hình cầu của H pylori là dạng hình thái thoái hóa của vi khuẩn H Pylori phát triển tốt và phân lập được dễ dàng trên môi trường thạch máu Sau khi đã mọc thành khuẩn lạc, H Pylori được

xác định nhờ các tính chất: vi khuẩn Gram âm, có các enzyme urease, oxydase, catalase Dù vậy, về mặt thực tiễn lâm sàng ít khi dùng phương pháp

này H pylori là loài vi khuẩn rất khó nuôi cấy ở điều kiện in vitro, nó cần môi trường và khí trường đặc biệt khi nuôi cấy Hơn nữa khuẩn lạc của H pylori

trên môi trường đặc thường trong hoặc màu xám nhạt thường khó phân biệt,

đôi khi gây tan máu, đường kính của khuẩn lạc rất nhỏ khoảng 1 mm, xuất hiện sau thời gian dài 48-72 giờ [2,29] Do vậy kết quả chẩn đoán dựa trên kết quả nuôi cấy thường không ổn định, kém chính xác và mất nhiều thời gian Tuy nhiên, nuôi cấy làm kháng sinh đồ vẫn là thử nghiệm có ích để hướng dẫn điều trị thích hợp và là một trong các phương pháp để đánh giá tình trạng kháng thuốc của vi khuẩn đối với kháng sinh

Mặc dù độ đặc hiệu của nuôi cấy đạt gần 100% nhưng độ nhạy thì rất khác nhau do ảnh hưởng của các yếu tố đã nêu trên Sau đây là kết quả độ nhạy của một số nghiên cứu:

Bảng 1.2: Độ nhạy của thử nghiệm nuôi cấy

Tại Việt Nam kết quả nuôi cấy chẩn đoán nhiễm H pylori thấp hơn so

với các thử nghiệm khác, nuôi cấy cho kết quả dương tính t 36,8% đến 68,7% [1,7]

1.2.3 Ứng dụng PCR trong chẩn đoán nhiễm H pylori

Hiện nay, PCR là một kỹ thuật chẩn đoán tiên tiến nhưng chưa được phổ

biến rộng rãi ở Việt Nam trong chẩn đoán nhiễm H pylori Theo một số kết

quả nghiên cứu thì PCR có độ nhạy khá cao Mẫu bệnh phẩm có thể lấy t mẫu sinh thiết dạ dày, dịch hút dạ dày, mãng cao răng, nước bọt hay t phân

Ngoài việc chẩn đoán nhiễm H pylori trước điều trị, PCR còn dùng để theo dõi sau điều trị tiệt tr H pylori Hơn nữa, PCR có thể phân biệt được sự khác

nhau giữa tái nhiễm và tái phát, hoặc là một nhiễm khuẩn khác kết hợp Một áp dụng quan trọng khác trong khi nghiên cứu về bệnh viêm dạ dày, PCR tìm ra được các gen có khả năng gây bệnh như CagA và hoặc là S1 VacA có liên quan đến bệnh loét dạ dày tá tràng và ung thư dạ dày [38,42] Liên quan đến kháng thuốc, PCR còn giúp tìm ra gen đột biến tạo ra sự kháng thuốc của vi khuẩn Ví

dụ đề kháng clarithromycin là do hiện tượng đột biến gen 23S RNA [35]

1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ H.PYLORI TRÊN THẾ GIỚI

1.3.1 Xác định sự có mặt của H.pylori bằng phân tích trình tự gen

đặc hiệu 16S rRNA

1.3.1.1 Vị trí, cấu trúc và chức năng của gen 16S rRNA

16S rRNA là gen tổng hợp rRNA 16S cấu tạo nên tiểu phần nhỏ

ribosome của vi khuẩn Ở H pylori gen này có kích thước khoảng 133 bp

Người ta cho rằng rRNA đóng vai trò rất quan trọng trong cấu trúc của ribosome, giúp cho việc gắn kết của các protein ribosome và góp phần quyết định hình dạng của ribosome [19,27]

Hình 1.6 Cấu trúc của gen 16S rARN đặc thù cho các loài vi khuẩn

Prokaryote và Archea (Woese et al 1987)

Woese và các cộng sự (1977) đã xác định 16S rRNA là phân tử rất thích hợp làm thước đo tiến hóa 16S rRNA là thành phần của bộ máy tổng hợp protein có t lâu đời, phân bố ở hầu hết các hệ thống sống và có độ bảo tồn

v a phải cho phép phán đoán sự liên quan tiến hóa giữa các loài sinh vật Cả

3 loại rRNA là thành phần của ribosome đều có một số tính chất để có thể được chọn làm thước đo tiến hóa Tuy nhiên, 5S rRNA có kích thước quá nhỏ (khoảng 120 ribonucleotide), mang ít thông tin của quá trình tiến hóa nên ít được lựa chọn nghiên cứu 23S rRNA là phân tử lớn (có khoảng 2900 ribonucleotide), có đầy đủ các tính chất để có thể làm thước đo tiến hóa Tuy nhiên, kích thước của 23S rRNA lớn nên thao tác nghiên cứu trên phân tử này không thuận lợi Phân tử 16S rRNA có kích thước v a phải, khoảng 1500 ribonucleotide, thuận lợi cho các thao tác nghiên cứu nên hiện nay, phân tử này được coi như là “tiêu chuẩn vàng” cho phân loại học Tuy nhiên, do những đòi hỏi cẩn trọng trong thao tác với rRNA bởi rRNA dễ bị phân hủy nên sử dụng gen mã hóa cho rRNA thường là đối tượng phân tích trong các nghiên cứu [26,34]

Trình tự gen 16S rRNA còn là một công cụ được sử dụng để định danh

vi khuẩn vì nhiều lý do

- Đầu tiên, số liệu DNA của một sinh vật là đáng tin cậy hơn số liệu hình thái trong nghiên cứu phân loại

- Các gen 16S rRNA là tương đối ngắn, làm cho nó nhanh hơn và rẻ hơn, nhưng lại đủ dài để có thể để xác định trình tự gen của vi khuẩn

Gen 16S rRNA của các vi khuẩn có một điểm rất đặc biệt là có những vùng bảo tồn cao ở cấp độ của nhóm xen kẽ những vùng biến động khác nhau giữa các loài trong cùng nhóm Tuy là những vùng biến động, nhưng những vùng này lại là những vùng bảo tồn ở cấp độ loài Sự bảo tồn và biến động ở các cấp độ khác nhau đã giúp cho gen 16S rRNA luôn là sự lựa chọn đầu tiên

của các nhà nghiên cứu khi tiến hành định danh vi khuẩn hay xác định mối quan hệ họ hàng giữa hai hay nhiều loài vi khuẩn Cho đến nay, số lượng các gen 16S rRNA đã được giải trình tự lên đến hơn 10.000 Điều này cho thấy sự

quan tâm đặc biệt của các nhà khoa học đến đối tượng này [30,46]

1.3.1.2 Tình hình nghiên cứu về gen 16S rRNA

Gen 16S rRNA được sử dụng nhiều trong các nghiên cứu để xác định

vi khuẩn gây bệnh Nhiều công trình nghiên cứu trình tự DNA liên quan đến các gen gây bệnh được nhân bằng kỹ thuật PCR như gen protease A

phát hiện N peningitidis (Kuritza & Oehler, 1991), gen autolysin phát hiện các serotype của S pneumoniae (Cherian & cs, 1998) [36,38] Nghiên cứu

tương tự cũng được tiến hành trong phòng thí nghiệm của Blaser, Trường Đại học tổng hợp New York, ông đã phát hiện 128 loài vi khuẩn dạ dày bằng phân tích gen 16S rRNA [33]

Cũng như tất cả các loài vi sinh vật tiền nhân khác, H pylori mang gen

16S rARN có trình tự đặc thù cho mỗi loài vi khuẩn (hình 1.6) Vì vậy, để xác

định tên của H pylori trong mẫu bệnh phẩm, người ta dùng một cặp mồi đặc

thù để nhân vùng bảo thủ trên gen, sau đó giải trình tự và đối chiếu nó với

các đoạn gen đó biết trên các thư viện gen bằng chương trình Blast Các nhà

khoa học quốc tế đã sử dụng đoạn gen đặc hiệu 16S rRNA để phát hiện nhanh vi khuẩn trong các mẫu bệnh phẩm [24]

Năm 2002, các nhà khoa học tại Hà Lan đã phát hiện các đột biến trên

gen 16S rRNA của H pylori và cho thấy sự xuất hiện đột biến thay thế đã làm cho H pylori trở nên kháng với tetracycline [36] Nghiên cứu trong cùng năm

của các nhà khoa học Canada cũng cho kết quả tương tự, đột biến thay thế ở

hai chủng H pylori 26.695 và 11.639 làm H pylori kháng tetracycline [23]

Tại Việt Nam, các nhà nghiên cứu đã ứng dụng các kết quả để phân tích

trình tự 16S rRNA nhằm phát hiện nhanh H pylori trong các bệnh nhân viêm

loét dạ dày tá tràng (Nguyễn Đức Toàn và cs, 2012; Nguyễn Văn Thịnh, 2010) [10,15]

1.3.2 Xác định tính kháng kháng sinh của H.pylori qua phân tích trình tự gen 23S RNA

1.3.2.1 Tiêu chuẩn chọn kháng sinh điều trị H pylori

Kể t khi được phát hiện, đến nay kháng sinh đã được chỉ định trong

điều trị các bệnh của dạ dày tá tràng do H pylori gây ra Hơn 30 năm được sử dụng trong lâm sàng, vấn đề tiệt tr H pylori đã đạt được rất nhiều thành công [39,41] Các kháng sinh được lựa chọn điều trị H pylori phải thỏa mãn

được các yêu cầu sau:

- Nhạy với H pylori

- Nồng độ kháng sinh trong dạ dày phụ thuộc vào pH của dạ dày, nên nồng độ kháng sinh phải cao

- Để tiêu diệt được vi khuẩn H pylori kháng sinh phải vượt qua được hàng rào chất nhày, đến với lớp biểu mô bề mặt nơi H pylori cư trú Hơn nữa,

kháng sinh phải tồn tại được thời gian dài đủ để tiêu diệt vi khuẩn Trên cơ sở này, mà các thuốc ức chế bơm proton, kháng sinh và bismuth là những thuốc được lựa chọn đầu tiên Trong đó, kháng sinh Clarithromycin, Amoxicillin, Metrinidazole là những thuốc được ưu tiên chọn lựa [39,41]

1.3.2.2 Dịch tễ học của kháng kháng sinh

Sự đề kháng kháng sinh của H pylori là yếu tố chính ảnh hưởng đến

hiệu quả của các phác đồ điều trị hiện dùng Tỉ lệ loài vi khuẩn kháng thuốc thay đổi tùy theo t ng vùng địa lý khác nhau, và tương quan với mức sử dụng kháng sinh trong dân số nói chung Ví dụ, việc sử dụng clarithromycin và tỉ lệ

đề kháng kháng sinh này tăng tương tự nhau (gấp 4 lần) ở Nhật Bản trong khoảng thời gian t 1993 đến 2000 ( Perez Aldana Lvà cs, 2002) [40] Trong

các tài liệu hướng dẫn của các nước châu Âu về điều trị H pylori cũng

khuyến cáo phương pháp trị liệu phải được điều chỉnh cho thích hợp với sự đề kháng clarithromycin và metronidazole [42,46,48] Theo đó, một liệu pháp ba thuốc kéo dài 14 ngày được khuyên dùng ở những nơi mà tỉ lệ kháng clarithromycin trên 15-20%, ưu tiên kết hợp với amoxicillin nếu tỉ lệ kháng metronidazole tiên phát >40% (Malfertheiner P và cs, 2007) Do đó, việc theo

dõi tỉ lệ đề kháng kháng sinh tỏ ra có ý nghĩa đối với việc điều trị nhiễm H

pylori trong thực hành lâm sàng

1.3.2.3 Tình hình nghiên cứu về gen 23S rRNA liên quan đến kháng

kháng sinh ở H pylori

Gen 23S rRNA là gen có chức năng cần thiết cho sự sống của vi khuẩn,

v a có vùng bảo tồn và v a có vùng biến động ở các cấp độ khác nhau, giúp cho việc định danh hay xác định mối quan hệ họ hàng giữa hai hay nhiều loài

vi khuẩn [43]

Gần đây, đã có nhiều nghiên cứu được tiến hành trên trình tự của gen 23S rRNA mã hóa 23S rRNA cấu tạo tiểu đơn vị lớn của ribosome ở vi khuẩn Theo Rina Uzuka, vùng 23S rRNA thường liên quan đến việc kháng kháng sinh phân tử vòng lớn Việc thiết kế các mồi mới để khuếch đại vùng 23S rRNA là rất hữu ích trong chẩn đoán các vi khuẩn kháng thuốc

Trong nhiễm H pylori, kháng clarithromycin chủ yếu do hai đột biến

của gen 23S rRNA [37] Tổng cộng có 31 nghiên cứu hội đủ các tiêu chí thu nhận, báo cáo số liệu của bệnh nhân được thu thập t năm 1993 đến 2009 [25,30] Cụ thể, có 17 nghiên cứu ở châu Âu, 10 ở châu Á, 2 ở châu Phi và 2

ở châu Mỹ [28,48] Tỉ lệ kháng kháng sinh tính chung của H pylori là 17,2%

dao động trong khoảng 16,5-17,9% với clarithromycin; 26,7% (25,2-28,1%) với metronidazole; 11,2% (9,6-12,7%) với amoxicillin; 16,2% (14,4-18,0%) với levofloxacin; 5,9% (4,7-7,1%) với tetracyclin; 1,4 (0,8-1,9%) với rifabutin

và 9,6% (8,5-10,7%) với 2 hoặc nhiều loại kháng sinh [44]

Bảng 1.3 : Tỉ lệ đề kháng kháng sinh ở các khu vực khác nhau trên thế giới Khu

vực Amoxicillin

Clari thromycin Tetracylin Levofloxacin Đa kháng Châu

Mỹ

8/352 (2,2%)

118/402 (29,3%)

11/393 (2,7%) KSL

53/352 (15%)

Châu

Phi

113/172 (65,6%) KSL

58/132 (43,9%)

11/456 (2,4%)

106/908 (11,6%)

21/252 (8,3%)

Châu

Âu

3/599 (0,5%)

352/3156 (11,1%)

14/599 (2,1%)

148/614 (24,1%)

204/2272 (8,9%)

Tính

chung

184/1640 (11,2%)

2014/11697 (17,2%)

94/1580 (5,9%)

254/1562 (16,2%)

278/2876 (9,6%)

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng H pylori kháng clarithromycin chủ yếu

do hai đột biến A2143G và A2142C của gen 23S rRNA Tuy nhiên, các đột biến này xuất hiện ngẫu nhiên ngay ở các bệnh nhân chƣa bao giờ dùng kháng

sinh clarithromycin [39] Kháng kháng sinh clarithromycin của H pylori ở một số nơi trên thế giới là rất cao (>70%) [31,33]

Các quốc gia châu Á có tỷ lệ kháng kháng sinh rất khác nhau Tại Trung Quốc t năm 2000 đến năm 2009, tỷ lệ kháng clarithromycin tăng t 12,8% lên 23, 8%, kháng metronodazole t 12% lên 56% Ở Nhật, tỉ lệ kháng clarithromycin tăng t 7,0% lên 15,2% và ở Hàn Quốc tỷ lệ này tăng t 7,6% lên 18,6% [33]

Kết quả nghiên cứu của J Versalovic và cộng sự (2003) trên 59 bệnh

nhân nhiễm H pylori ở Mỹ cho thấy, tỷ lệ gen 23S rRNA kháng

clarithromycin còn lên đến 91,4 %, trong đó phần lớn là đột biến tại A2143G (chiếm 52,5%) [31]

Kim Jung Mogg và cs (2008) nghiên cứu trên đối tượng bệnh nhân

nhiễm H pylori là người Hàn Quốc Kết quả cho thấy tính kháng clarithromycin của H pylori là do 2 đột biến A2143G và T2182C trên gen 23S rRNA Kết quả cũng chỉ ra rằng, tỷ lệ kháng clarithromycin của H pylori

tăng t 7,6% lên 18,6% Tuy nhiên, ở các bệnh nhân sau điều trị nhưng không khỏi bệnh, thì tỉ lệ kháng clarithromycin tăng lên đến 85,1% [33]

Trong suốt 3 năm (2010- 2012), nghiên cứu 4089 mẫu sinh thiết bệnh nhân được thực hiện bởi các nhà khoa học của trường đại học bang Texac,

Mỹ đã phát hiện 7 đột biến thay thế khác nhau trong mẫu H pylori dương

tính: C2131T, A2142G, A2143G, T2182C,A2187G, A2222G, và A2223G Trong số này, chỉ có 2 đột biến A2142G và A2143G là luôn liên quan với kháng clarithromycin có trong các công bố trước đây, chiếm tỉ lệ 50% [35] Gần đây nhất vào năm 2014, các nghiên cứu về đột biến trên gen 23S

rRNA tại Mỹ cho thấy bệnh nhân bị nhiễm H Pylori có đột biến kháng kháng

sinh clarithromycin tại 7 điểm, có đến 50% trong số đó là vi khuẩn đột biến tại 2 điểm A2143G và A2142C Tỷ lệ này là cao hơn so với các nghiên cứu trước đây khoảng 15% [34]

1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ H PYLORI TẠI VIỆT NAM

Nhiễm H pylori - căn nguyên các bệnh dạ dày của hơn 70% người Việt

Nam thường dẫn đến loét hoặc ung thư dạ dày, ảnh hưởng đến khả năng lao động cũng như chất lượng sống của người lao động Do vậy, các nghiên cứu xoay quanh vi khuẩn và các bệnh liên quan đã được tiến hành t những năm

90 của thế kỷ 20 tại Việt Nam, ngay sau công bố phát kiến của Warren &

Marshall vào năm 1982 [12,17] Viêm dạ dày do nhiễm H pylori mãn tính

không được điều trị triệt để dẫn tới giảm tiết axít dạ dày, tạo điều kiện cho các

loại vi sinh khuẩn non- H pylori ưa kiềm có khả năng chuyển hóa Nitrite

thành các chất tiền ung thư N-nitroso Sự phát triển của nhiều loại nấm trong

dạ dày người bệnh thiếu axít dạ dày cũng đã được ghi nhận trong y văn thế

giới Nhiễm H pylori tăng nguy cơ ung thư dạ dày gấp 6 lần, trong khi đó ở

các bệnh nhân bị thiếu axít trong dịch vị dạ dày, nguy cơ ung thư dạ dày tăng thêm 4,7 lần nữa, tức là gấp khoảng 30 lần [33]

Trong các bệnh viện Việt nam, nhiễm H pylori thường được phát hiện

sản phẩm hoạt động men urease của vi khuẩn

Cả hai test phát hiện H pylori đang lưu hành ở Việt Nam đều có độ nhạy không cao, chẳng hạn test thử urease chỉ đạt độ nhạy 70% do H pylori mang các kiểu gen urease đột biến Với một đối tượng dễ thay đổi như H

pylori, một phương pháp phát hiện tốt nhất sẽ là các phương pháp phân tách

DNA của vi khuẩn Vẫn chưa có phòng xét nghiệm nào trong bệnh viện ở

Việt Nam sử dụng đoạn gen 16S rRNA đặc thù của H pylori để phát hiện

chúng trong các mẫu bệnh phẩm

TS Nguyễn Văn Thịnh (2007) tiến hành nghiên cứu tình trạng kháng

thuốc của H pylori với 5 loại kháng sinh đang lưu hành (Tetracyclin,

Clarithromycin, Ampixiciline, Metronidazole và Amoxicillin) trên 135 chủng

vi khuẩn phân lập t các bệnh nhân viêm dạ dày và xác định tính nhạy cảm

của H pylori đối với các loại kháng sinh hiện hành đã sắp xếp theo thứ tự

kháng với các thuốc như sau [11]:

Clarithromycin>Amoxicillin>Tetracyclline> Ampicilline> Metronidazole (53,33%) (48,89%) (44,44%) ( 40,74%) (5,93%)

Nguyễn Thị Hồng Hạnh và cs (2010) đã nghiên cứu sâu hơn về kháng

Clarithromycin và nhận thấy, các dòng vi khuẩn H pylori kháng thuốc đều mang đột biến A2143C trên gen 23S rRNA, giống như ở các chủng vi khuẩn

Trung Quốc Các nghiên cứu về phát hiện đột biến kháng Clarithromycin bằng PCR không cần giải trình tự được tiến hành ở Quân Y viện 108 Nguyễn Thúy Vinh cũng tiến hành các nghiên cứu về phác đồ điều trị kháng sinh và các đột biến gen 23S rRNA cũng đi đến kết luận tương tự rằng loại đột biến A2143G đặc thù cho Trung Quốc và Việt Nam Các bệnh nhân được xét

nghiệm có H pylori mang gen 23S rRNA nhậy với clarithromycin đều được

chữa khỏi bệnh, trong khi đó nếu có vi khuẩn mang gen kháng clarithromycin thì không khỏi bệnh [18]

Trong những năm gần đây, công tác điều trị các bệnh dạ dày kèm nhiễm

H pylori ở Việt Nam có tiến bộ nhờ sử dụng liệu pháp kháng sinh

Clarithromycin vẫn được coi là kháng sinh có hiệu lực nhất để diệt H pylori

và không cần xét nghiệm phân tích liệu vi khuẩn có kháng thuốc hay không

do các kháng sinh khác đã trở nên vô hiệu lực Tuy vậy, ở thời điểm hiện tại,

tỷ lệ chữa khỏi bệnh thấp, bệnh nhân phải điều trị đi điều trị lại, rất tốn kém

do nuôi cấy H pylori t mẫu bệnh phẩm đòi hỏi thời gian tương đối dài và nhiều khi các vi khuẩn bội nhiễm non- H pylori đi kèm đã làm cho việc phân tích trở nên khó khăn và mất thời gian Hơn nữa, H pylori đã trở nên kháng thuốc Nhiễm H pylori lâu ngày sẽ dẫn tới bội nhiễm vi sinh vật dạ dày Theo

số liệu thống kê, số lượng bệnh nhân đau dạ dày cũng như được chẩn đoán ung thư dạ dày ở tất cả các tuyến huyện ngày càng tăng [12]

1.5 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU H PYLORI TẠI HẢI DƯƠNG

Hiện nay, ở tất cả các đơn vị Bệnh viện đa khoa tuyến tỉnh cũng như

tuyến huyện tại Hải Dương, H pylori chưa được xác định bằng các phương

pháp thích hợp mà chỉ được chẩn đoán là có trong dạ dày người bệnh, dựa

trên hình ảnh nội soi kết hợp nuôi cấy H pylori t dịch tiêu hóa, làm test Urease để phát hiện H pylori Tuy nhiên, phương pháp nuôi cấy và test

urease cũng có những nhược điểm nhất định Trong khi đó, phương pháp PCR

dựa trên đoạn gen đặc hiệu của vi khuẩn H pylori cho kết quả với độ chính

xác cao và thời gian ngắn Ở thời điểm hiện tại, các kỹ thuật Y sinh học hiện

đại như PCR phát hiện nhanh và chính xác H pylori cũng như xác định tính kháng kháng sinh của H pylori nhằm hỗ trợ điều trị bệnh còn hầu như chưa

được ứng dụng ở các bệnh viện tuyến huyện cũng như tuyến tỉnh

CHƯƠNG II- ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

100 bệnh nhân đến khám tự nguyện tại Bệnh viện Đa khoa tỉnh Hải Dương

t tháng 1/2015 đến tháng 7/2015 Các câu hỏi và các xét nghiệm phân tích gen chỉ được thực hiện khi có sự đồng ý của bệnh nhân Đối tượng nghiên cứu sẽ được miễn phí cho các xét nghiệm phân tích gen Bệnh nhân có thể rút khỏi chương trình nghiên cứu bất cứ lúc nào Các thông tin về bệnh nhân và kết quả xét nghiệm gen 16S rRNA và 23S rRNA hoàn toàn được giữ bí mật Các bệnh nhân được lấy sinh thiết đều có:

- Tuổi t 18- 80;

- Bị viêm dạ dày mãn tính, loét hoặc ung thư dạ dày;

- Không dùng kháng sinh trong thời gian 1 tháng trước khi nội soi, t tháng 1/2015 đến tháng 7 năm 2015

Các bệnh nhân này được phỏng vấn về tiền sử bệnh, nội soi để sinh thiết mẫu tại các vị trí hang vị, thân vị và rìa các ổ loét, các tổ chức thâm nhiễm nghi ung thư dạ dày

Các mẫu sinh thiết được bảo quản trong nitơ lỏng, lưu giữ ở -200

C hoặc -700 C cho tới khi tách chiết DNA

2.2 HÓA CHẤT VÀ TRANG THIẾT BỊ

Các loại hóa chất và các dung dịch đệm cần pha dùng trong các thí

nghiệm của đề tài được trình bày trong các bảng sau

Bảng 2.1: Danh mục các dung dịch đã sử dụng

1 Ammonium acetate 7,5M Ammonium acetate (CH3COONH4)

2 Đệm TBE 10X 1M Tris - HCl; 830 nM axit boric; 1 nM

Bảng 2.2: Danh mục các hoá chất và hãng sản xuất

1 Hóa chất tách DNA (ProteinaseK,

EDTA, Tris base, SDS, ) Ferenzymtas, Invitrogen

3 Ethanol 700 và 1000 Ferenzymtas

4 Hóa chất điện di DNA Merk,

Bảng 2.3: Các thiết bị, dụng cụ phân tích thí nghiệm

3 Hệ thống điện di DNA Mupid - ex (Nhật)

8 Nồi khử trùng và tủ sấy Nhật Bản

9 Pipettman, đầu côn các cỡ Eppendorf và Sorrenson

10 Tủ lạnh sâu –200

C, tủ lạnh 40C Sanyo (Nhật Bản)

12 Găng tay, khẩu trang, tube các cỡ 1,5

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Quy trình nghiên cứu của đề tài:

trong đó: Z(1-α/2) với mức ý nghĩa p=0,05 là 1,96

p: tỷ lệ nhiễm H pylori trong các nghiên cứu trước đây

d: sai số chấp nhận

Trong nghiên cứu này, chúng tôi lấy tỷ lệ nhiễm H pylori trong các

nghiên cứu trước đây là 60% (p=0,6); Sai số chấp nhận là 10% (d= 0,1) Cỡ

mẫu N = 92

Trong các nghiên cứu thực nghiệm, cần có 10% số lượng mẫu dự phòng

mẫu, vì vậy tổng số mẫu trong nghiên cứu này được xác định là 100 mẫu 2.3.2 Phương pháp lấy mẫu

Thủ thuật nội soi được thực hiện bởi các bác sĩ Khoa Thăm dò Chức năng Bệnh viện đa khoa tỉnh Hải Dương

Sinh thiết qua nội soi lấy 2 mảnh niêm mạc dạ dày tại hang vị và thân vị của mỗi bệnh nhân Mảnh sinh thiết có kích thước 2 - 3 mm, là mô sống, không phải là tổ chức hoại tử, không dính máu và không dính mật

2.3.3 Phương pháp tách chiết DNA t mẫu bệnh phẩm

Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành tách chiết DNA của 100 mẫu bệnh phẩm viêm loét dạ dày Phương pháp tách chiết DNA t mẫu sinh thiết được tiến hành theo phương pháp của Ausubel(1995), bao gồm các bước sau:

- Chuyển dịch chiết DNA vào ống eppendorf, ủ ở 370C, trong thời gian

Bước 3:

- Thêm 500 µl cồn 960, để ở -20o

C trong 2 - 3 giờ, DNA kết tủa Ly tâm

12000 vòng/phút, ở 4oC, trong 30 phút Đổ phần dịch trong và thu tủa DNA

- Thêm 500 µl cồn 70o để rửa sạch DNA Ly tâm 12000 vòng/phút, ở

4oC, trong 20 phút Đổ bỏ phần dịch, thu tủa DNA

- Để khô DNA và bay hết cồn ở nhiệt độ phòng

- Hoà tan DNA trong 30µl dung dịch đệm TE và bảo quản DNA ở 4oC

để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo

2.3.4 Điện di

DNA sau khi tách chiết, được phân tích định tính bằng phương pháp điện

di trên gel agarose

Nguyên tắc của phương pháp điện di là dựa vào đặc tính của cấu trúc axit nucleic mang điện tích DNA là các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt, nên khi chịu tác động của một điện trường có điện thế và cường độ thích hợp, chúng sẽ di chuyển về cực dương của điện trường (DNA

di chuyển t cực âm sang cực dương) Các phân tử DNA khác nhau về kích

thước đồng thời khác nhau về điện tích nên chúng di chuyển cũng với tốc độ khác nhau, do đó có thể phân biệt được trên gel agarose Mặt khác DNA trong gel agarose sẽ hiện hình dưới tia tử ngoại (UV) nhờ ethidium bromide Chất này có khả năng gắn xen vào giữa các base của DNA và dưới tác dụng của tia

tử ngoại có bước sóng 300 nm sẽ phát huỳnh quang và hiện hình dưới dạng những vạch sáng [2]

Cách tiến hành:

 Chuẩn bị gel agarose 1% để kiểm tra định tính kết quả tách chiết DNA:

Cân 1g agarose hoà tan hoàn toàn trong 100 ml đệm TBE 1X, đun nóng

ở 100oC trong thời gian 5 phút để agarose hoà tan hoàn toàn trong đệm Rót nhẹ nhàng dung dịch gel vào khay điện di với độ dày khoảng 5-6 mm, tránh xuất hiện bọt khí, nhẹ nhàng cài lược vào bản điện di

 Tra mẫu: Khi bản điện di nguội hoàn toàn, nhẹ nhàng chuyển vào

buồng điện di, nhấc lược ra khỏi khay Lấy 5µl mẫu DNA được trộn với 1µl đệm tra mẫu (loading buffer), sau đó hỗn hợp này được nhỏ vào các giếng trên gel Tiến hành điện di các mẫu DNA cùng với các thang DNA chuẩn để ước lượng kích thước phân tử DNA

 Chạy điện di: Sử dụng hiệu điện thế: U = 100V; dung dịch đệm TBE

1X Sau đó nhuộm gel trong dung dịch Ethidium Bromide và soi bản điện di

dưới ánh sáng tử ngoại 254 - 300 nm

2.3.5 Định lượng, định tính DNA bằng quang phổ kế

Sau khi thu nhận DNA, tiến hành xác định nồng độ và độ tinh sạch của DNA bằng phương pháp quang phổ kế

Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào sự hấp thu mạnh ánh sáng

tử ngoại ở bước sóng 260 nm của các base purin và pirimidin Giá trị mật độ quang ở bước sóng 260 nm của các mẫu đo cho phép xác định nồng độ DNA trong mẫu dựa vào tương quan sau: