Tổng quan phương pháp phân tích Afletoxin trong bắp

Tổng quan phương pháp phân tích Afletoxin trong bắp

Phan tong quan

! Đại cương về các Aflatoxin

È.1 Lịch sử phái hiện:

%

Từ rất lâu, người ta đã nhận thấy rằng các loại khô dẫu có trong thành phần thức ăn gia súc có thể trở nên độc hại cho chính gia súc Tuy nhiên đây chỉ là những hiện tượng lẻ tế không được chú ý nhiều

Đến năm 1960, ở Anh , một vụ địch bệnh đã xảy ra làm chết 100.000 gả By

con, khi mổ xác thấy có xuất huyết và hoại tử ở gan kèm theo tổn thương ở th Nguyên nhần bệnh không được biết rõ vì vậy người ta gọi là bệnh “X” của gà tâ Sau đó, những vụ tương tự cũng được quan sát thấy trên vịt con ở Áo, gà giồ Ở Tây

an Nha, cá hồi ở Mỹ, trĩ con ở Uganởa Các nhà bác học đã nhanh chóng fìm ra

mối liên hệ giữa các vụ nhiễm độc đó với việc cho ăn khô dâu đậu phông và họ cũng thấy rằng bệnh này không những xây ra đối với gia cầm (gà tây, vịt con, gà giò.)

mà còn với cả gia súc đặc biệt là heo, bê, cờu,

Với những cố gắng phát hiện nguồn độc tố trên các thực phẩm có liên quan,

các nhà bác học đã quan sát và phân lập được loài nấm Aspergillus flavus trên các hạt đậu phộng mốc và trên lúa mì mốc Việc tinh chế chất độc từ các loại hột bị nhiễm nấm Asperglius flavus cho ra một loại hợp chất mà trong bản báo cáo của Forgacs và Carl xuất bản năm 1962 tại Interdepart mental Working Party người ta goi tén 14 Aflatoxin [3]

Việc khám phá ra Aflatoxin đã Kích thích các nhà khoa học nhiều ngành tập trung nghiên cứu về tất cả các mặt của Aflatoxin và ảnh hưởng của nó tới sức khóe của con người và động vật, Họ đã đánh giá rằng mỗi năm Aflatoxin đã gây tổn thất rất nhiều triệu đollar lương thực thực phẩm trên toàn thế giới [2]

Phân tổng quan

ra bằng hệ thống cloroform-tetra clorur carbon-nước -methanol (2:2,5:1:3) đã phát

hiện 2 vết huỳnh quang đưới ánh sáng tử ngoại

_ Ì vết huỳnh quang xanh tím (Blue) gọi là Aflatoxin B

¡1 vết khác có R¿ thấp hơn có huỳnh quang xanh lục (Green) gọi là

Aflatoxin G

Sau khi hai chất đó được kết tỉnh người ta qui cho chất đầu công thức nguyên

CuH‹¿0¿ với trọng lượng phân tử 312, chất thứ 2 công thức Cy;H:;Ö; với trọng lượng

phân tử 328

Năm 1964, Asao và các cộng sự đã phát hiện thấy chất Aflatoxin B va G 1a những hợp chất không no nên đã thực hiên phan ứng khử có xúc tác và nghiên cứu

phổ cộng hưởng từ hạt nhân của chúng Từ đó ông đã để xuất cấu trúc cho Aflatoxin

B, và Aflatoxin G¡ Chất Aflatoxin G¡ có cấu trúc rất gần với cấu trúc Aflatoxin B;: nó

có hai chức lacton, còn Aflatoxin Bị chỉ có một,

Các kết quá của nhiều phòng thí nghiệm khác nữa cũng công nhận cấu trúc này, Kết quả phân tích X quang còn phát hiện thêm sự kết hợp kiểu cis- của 2 nhân Dihydro furanic

Phân tổng quan

Tên hóa học :3,4,7aœ 10aœ -tetrahydro-5-methoxy-1H,12H-

furo[3’,2”,:4,5]furo[2,3-hjpyrano[3,4-c]-[ 1 ]benzopyran-1,12-dione

Sau đó, hai độc chất gần tương tự khác cũng được phân lập từ nấm

Aspergilius là Aflatoxin Bạ và Aflatoxin Ga, Đây là những dẫn xuất Dehydro hóa từ

1.2.2 Cac Hydroxy Aflatoxin

Năm 1963, trong khi nghiên cứu chất độc ở sữa và thịt bò đã ăn phải thực phẩm

có Aflatoxin, AHcroft và Carnaghan đã chiết tách được những chất có khổ năng gây

ra ở vịt con những rối loạn tương tự do Aflatoxin gây ra Những chất này được gọi là

“Độc tố sữa” Về sau phát hiện có hai chất

e 1 chất có huỳnh quang xanh tím gọi là Aflatoxin M;

ø 1 chất có huỳnh quang tín gọi là Aflatoxin Mạ

Cấu trúc của chúng cũng được xác định : Aflatoxin Mị là 4-Hydroxy Aflatoxin

B, va Mp 1a 4-Hydroxy Aflatoxin By

Phân tổng quan

OMe Aflatoxin MỊ: C¡;H¡¿O;

Tên hod hoc : 2,3,6a,9a-tetrahydro-9a-hydroxy-4-

methoxycyclopenta[c]furo[3’,2’:4,5]furo{Z,3-h]{1]benzopyran-1,11-dione;4- hydroxy Aflatoxin B,

methoxycyciopenta[c|furo[3’,2’:4,5]furo[2,3-hj{ i }benzopyran-1, 1 i-dione:4-

hydroxy Aflatoxin Bo

Năm 1966, Dutto va Heathcote phat hién trong binh nudi c4y Aspergillus flavus

có 2 Aflatoxin mới Việc nghiên cứu phổ tử ngoại và phổ hồng ngoại, khối phổ và phổ cộng hướng từ hạt nhân của chúng cũng như các phần ứng hóa học khác nhau cho phép xác định chúng là những dẫn xuất 2-Hydroxy của các Aflatoxin B¿ và G; nên

người ta gọi chúng là Aflatoxin Bz, va Go,

9 9

ok A

yo

Phân tổng quan

Aflatoxin Bạ,

a k

“Ns HO“ `Of“ "QZ Z~ome

Aflatoxin G,,

Một tiền tố của các Aflatoxin mà Heathcote và Dutto gọi là Aflatoxin Bạ cũng

đã được StubbleBeld và đồng tác giả phân lập và gọi là Parasiticol Trong công thức

của chất này nhân Cyclo-penten tận cùng của Aflatoxin Bị được thay thế bằng một

chuối bên etanol

Aflatoxm Ba( Parasiticol)

Tên hóa học: 6-metoxi-7-(2’-hydroxy etyl) difuro Cumarin

Dalezios,Wogan và Weinreb khi phân tích nước tiểu của khỉ có ăn Aflatoxin Bị

đã xác định được 1 sản phẩm trao đối chất, Aflatoxin P¡ là dẫn xuất phenolic của

Aflatoxin Bị Phân lập trên cột Ambeclit XAD-2 rồi dùng các phương pháp phân tích

hóa lý người ta xác định đây chính là sản phẩm của sự khử Metyl trên Aflatoxin Bị,

Aflatoxin P,

Trong tat ca céc Aflatoxin nêu trên Thường gap nhat 1A cdc Afitatoxin B,, Ba,

G,, G) Nhung Aflatoxin B, cé nhiều nhất, với độc tính cao nhất nên được xem là đối

Phân tổng quan

tượng chính trong việc xác định Aflatoxin Aflatoxin M, cling được quan tâm tới gần

đây, do nó cũng độc gần bằng Bị lại hay xuất hiện trong sản phẩm sữa, một loại thực

phẩm rất thông dụng được sử dụng nhiều cho trẻ em, đối tượng để bị ánh hưởng nhất

Ở trạng thái tự do các Aflatoxin phát quang khi chiếu tia tử ngoại, bị phá hủy

trong các dụng địch kiểm và để đàng bị oxy hoá

Bảng 1: Điểm nóng chảy của các Aflatoxin chính

Theo Headthcote Theo Subblefield Theo Townsend

Tất cả các Aflatoxin déu tan trong cdc dung méi hifu co nhy : methanol,

ethanol, aceton, cloroform, benzen Ít tan hoặc không tan trong các hydrocarbon no như n-hexan, eter ethylic, eter dau hoa

Phan téng quan

13.4 Tính chất quang hoc

Tất cả các Aflatoxin đều ở đạng tả triển,

Độ quay cực cho 6 bang sau :

Aflatoxin Mau huynh quang dudi dén UV Ag, nm

Phần tổng quan

I.3.5.2 Phổ hấp thu UV

Các Aflatoxin Bị, Bạ, Gì, G2, Mj, Mz déu cd kha nang hap thu rất tốt

trong vàng UV Tùy theo từng loại dung môi mà các Aflatoxin có thể xuất hiện một

hay nhiều cực đại hấp thu khác nhau

Bảng 4 : Cực đại hấp thu UV của các Aflatoxin trong metanol

Phần tổng quan

L4 Tổng hợp [3,4]

1.4.1 Sinh tổng hợp

Aflatoxin là sắn phẩm biến dưỡng thứ cấp, nó không phải là một chất dự trữ

trong tế bào và cũng không phải là một chất cặn bã Bởi vì nó không hiện điện trong

giai đoạn tăng trưởng của tế bào mà là sau đó Nhiễu giả thuyết cho ring Aflatoxin

giữ vai trò như là “một cái khóa an toàn” của tế bào sợi nấm Giai đoạn cuối của thời

kỳ tăng trưởng của tế bào sợi nấm một số chất biến dưỡng như: acetat, pyvurate

không được sử dụng, tích tụ lại làm ngưng sự tăng trưởng Cũng giả thuyết này khi đó

sự biến đưỡng của tế bào đi lệch hưỡng ban đầu để tạo ra 1 chất biến dưỡng thứ cấp

là Aflatoxin nhằm làm giảm độc tính cho tế bào sợi nấm

Có rất nhiều giả thuyết đã được đưa ra cho quá trình sinh tổng hợp các aflatoxin, việc dùng các nguyên tố đánh dấu đã cho phép kiểm chứng và chọn lựa lại -những giả thiết này Kỹ thuật đánh dấu Aflatoxin bằng ''C và ?H đã xác định được nguồn gốc của các nguyên tử carbon trong Aflatoxin Bị Khi đồng thời cho cả acetat

và glucoza vào các bình nuôi cấy song song Aspergillus flavus chttng td rang cdc Aflatoxin là những sản phẩm dẫn xuất của acetat và có lẽ chúng được tổng hợp bên ngoài các ty lạp thể Như vậy, các công trình của nhiều nhà khoa học đều nhất trí để

nghị một sơ đổ, theo đó thì, đi từ các acetat, qua trung gian một sắc tố antraquinonic là

averufine người ta sẽ đạt tới sự biến đổi sterimatocystin thành Aflatoxin Bị

1.4.2 Hod tổng hợp

Bũchi và các cộng tác viên đã lấy Floro Acetophenon () điều chế ra chất 5-

benziloxi-7-metoxi-4-methy] Cumarin (IJ) rồi thành một hợp chất của benzofuran (II)

và chất acetat của nó (IV); chất này được thủy phân thành một lacton tetracyclic của

acid carboxylic (V) rồi thanh mét lacton pentacyclic Aflatoxin Bz (VI), va cuéi cing

chuyển thành Aflatoxin Bị

Với Robert và nhóm cộng tác viên, họ đã thực hiện việc tổng hợp từ tetrahydro-4-hydroxy-6-metoxyfuro(2,3-b)benzofuran(J), chất này ngưng tụ với etylcyclo pentanon —2-carboxilat (II) cho chat tetrahydrodeoxo Aflatoxin B, (IID), chat nay dé dang chuyén thanh Aflatoxin B, va chuyển thành Aflatoxin B; một cách

LS Độc tính [1,3,4,5,6,7,8,9,10]

1.5.1 Tính chất gây déc cita cdc Aflatoxin

Các thí nghiệm của Asao, Bũchi và các cộng tác viên đã tiến hành trên vịt con một ngày tuổi (cân nặng 51g+4g), mỗi ngày nhận những liều lượng aflatoxin khác nhau hoà tan trong propilen glieol hoặc đimethyl formamid nhỏ vào cổ họng mỗi con 0,1ml Sau 48 giờ nhận xét số con chết,

Bảng 5 : Ngưỡng từ vong của Aflatoxin trên vịt con 1 ngày tuổi

Tỷ lệ về độc tố của 6 Aflatoxin chính được cho trong bang 8

1.5.2 Triệu chứng nhiễm độc Các triệu chứng nhiễm độc Aflatoxin đã được nghiên cứu hoặc qua các vụ nhiễm độc tự nhiên hoặc trong các thử nghiệm tại phòng thí nghiệm, với thức ăn đã

£2

Phân tổng quan

được nhiễm Aspergillus flavus , hay với thức ăn trong đó đã cho Aflatoxin VÀO, ngƯời

ta nhận thấy một loạt các triệu chứng gắn liên với sự nhiễm độc cấp tính và những biến đổi liên quan đến sự nhiễm độc mãn tính Loại sau này cóbản chất di truyền và tương ứng với 3 kiểu gây ung thư, gầy quái thai và gây đột biến

Sự nhiễm độc cấp tính thể hiện bằng cái chết của các con vật trong những thời hạn thay đổi tùy theo sự mẫn cảm đặc trưng của từng loài Thông thường gan trông nhợt nhạt mất mầu, tăng thể tích hay thấy hoại tử ở nhu mô gan và chảy máu 6 vit con, lợn con và ga tây,

Những rối loạn do nhiễm độc mãn tính thuộc một loại khác Các triệu chứng đầu tiên có thể thấy được là ăn kém ngon và chậm lớn, có khi còn xuống cân Khi sự nhiễm độc kéo đài thấy xuất hiện ung thư gan

15.3 Tinh chat gay ung thu Tất cả mọi chất gây ung thư đều sản ra các đạng khối u có nhiều dạng khác nhau tùy từng loại tế bào Với Aflatoxin chủ yếu là loại tế bào gan, thỉnh thoảng có

ung thư túi mật, Aflatoxin là một trong những chất gây ung thư mạnh nhất tác động qua đường miệng mà người ta đã biết Chỉ hấp thụ một tổng lượng 2.5mg trong thời

gian 89 ngày mà đưa đến ung thư gan sau hơn một năm,Nếu so sánh các liễu lượng có thể đưa đến hình thành ung thư trong những điều kiện giống nhau, một liéu Aflatoxin

ít hơn 1000 lần so với chất nhuộm màu azoic ở bơ, đã đủ để gây ung thư

1.5.4 Anh hudng vê mat hod sinh hoc-

Nhiều công trình nghiên cứu đã được tiến hành nhằm làm sáng tổ phương thức

tác động hoá sinh của Aflatoxin, nhất là các nghiên cứu về sự tác động lên các thành phần cấu tạo của tế bào, lên các acid nucleic và lên sự chuyển hoá các protein Người

ta đã nhấn mạnh ve Aflatoxin có thể coi là một chất ức chế các quá trình tổng hợp, liễu lượng cao có thể ức chế hoàn toàn, Có thể sơ đổ hoá các giai đoạn kết tiếp nhau của tác động hoá sinh học của các Aflatoxin, trong đó mỗi giai đoạn là kết quả của giai đoạn trước

1 Tác động qua lại với ADN và ức chế các polimeraza chịu trách nhiệm tổng hợp ADN và các ARN,

2 Đình chỉ sự tổng hợp ADN

13

Phần tổng quan

fad Tiéu giadm sự tổng hợp ARN và ức chế ARN truyền tin

4, Xuất hiện những biến đối hình thái hạt nhân

5 Giảm bớt sự tổng hợp protein

1.5.5 Sự biến đổi ca Aflatoxin trong su biến dưỡng của cơ thể sống [4] Chat Aflatoxin trong cơ thể phần lớn là những chất ngoại tiết (exogen), được biến dưỡng bởi một số phản ứng nối tiếp nhau do enzym xúc tác, làm gia tăng tính wa nước của các Aflatoxin và sau cùng là loại bỏ chúng Những nghiên cứu về sự biến dưỡng của Aflatoxin trong cơ thể sống đã thưc hiện nhưng vẫn còn nhiều nghi vấn chưa biết được hết,

Một trong những cách tạo cho Aflatoxin B, có hoạt tính sinh học là epoxid hóa

nó Từ epoxid này, với hoạt tính mạnh hơn các Aflatoxin ban đâu, sẽ tham gia rất nhiều các phần ứng hóa học khác nhau (Theo sơ đồ hình 1)

Người ta cũng đã xác định rằng Aflatoxin Bị trong cơ thể sống đã bị hydroxyl héa tao ra Aflatoxin M; Dau tiên Aflatoxin M, d4 được tìm thấy trong sữa ba, dé, cừu, sữa phụ nữ cho con bú, Petterson đã thiếtlập được mối quan bệ tuyến tính giữa hàm lượng Aflatoxin Bị gia súc đã ăn và hàm lượng Aflatoxin MỊụ tiết ra trong sữa hàng ngày Tuy nhiên, sự tiết ra Aflatoxin M: rất thay đổi theo từng loài và tùy thuộc

vào yếu tố bản thân nó, Ở bò cái, có thể thấy ngay sau khi cho ăn Aflatoxin B, 2 ngày nhưng ở đê cái thời hạn này có thể dài hơn 7-15 ngày Aflatoxin M; còn có thể tim thấy trong nước tiểu, trong các chất cặn bã boặc trong mật gan, thận của một số động vật Aflatoxin MỊ có tính độc tương đương Aflatoxin Bị nhưng nó rất nguy hiểm ở chễ

nó xuất hiện ở sữa, một loại thực phẩm chính cho các sinh vật còn non rất nhạy cảm với Aflatoxm

Một con đường biến đưỡng khác tương đương là sự hydroxyl hoá với sự thành

lập dẫn xuất hemiacetal của Bị và G¡ được gọi là B;y và G;¿ Hai chất này được tìm thấy trong gan của một số động vật Các thí nghiệm cho thấy khi sử dụng tiền chất đánh dấu phóng xạ cho những dẫn xuất hemiacetal được cố định thành protein theo nguyên tắc thành lập của Shữf Sự cố định này là nguồn gốc sự hoại tử của tế bào gan viêm Độc tính của Aflatoxin Bạ„ và G¿; rất yếu và những protein được cố định từ những dẫn xuất này không được hấp thu bởi ruội và bao tử,

14

Phân tổng quan Mới đây, một dẫn xuất hydroxyl của Aflatoxin Bị đã phát hiện trong gan của

khí và người, Chất nầy được gọi là Aflatoxin \, được tạo ra cùng lúc với Aflatoxin M; bởi sự hydroxyl hóa của Aflatoxin B,, phan ting nay xy ra trong những thể nhỏ của tế bào gan dưới hoạt động thủy giải của hệ thống enzim NADP

Nếu sự hydroxyl hóa là một phần ứng biến đưỡng chính của Aflatoxin Bị và G¡ trong cơ thể Người ta cũng đã quan sát đựoc sự khử methyl của Aflatoxin Bị dẫn đến

sự thành lập Aflatoxin P,, m6t din xudt phenolic cla Aflatoxin B, ầm thấy trong nước tiểu của một số loài động vật, Có thể nói con đường biến dưỡng chính của Aflatoxin

B; trong cơ thể là sự hydroxyl hóa Một con đường khác nữa là sự methoxyl hóa

Sơ đỗ sự biến dưỡng của các Aflatoxin trong cơ thể sống theo hình 1

15.6 Bénh độc tố Aflaloxin và con người

Đối với con người sự nguy hiểm của các độc tố Aflatoxin được nhận thức khi nhìn vào cơ chế tác động của chúng Trên cấu trúc hoá học, chúng ta nhận thấy có nhiều nhóm có khả năng phản ứng hoá học cao như cyclopenienon và địhydro furan Afiatoxin có thể lập cầu nối đồng hóa trị vào các protein và acid nhân, ADN và ARN

Gắn vào enzym, Aflatoxin gây độc ngắn hạn nhưng gắn vào acid nhân gây hậu quá

rất trầm trọng : cần trở sao chép và gây đột biến Cầu nối đôi trong vòng đihiđro furan đã được chứng mình là nguyên nhân gây đột biến Động vật đang ở thời kỳ phát triển càng nhạy cảm với Aflatoxin Bị và G¡ Nếu nhiễm Aflatoxin trong thời ky mang

thai, thai sẽ bị dị tật, chết hay sinh quái thai Khi ăn phải thực phẩm có Aflatoxin, chúng sẽ tích lũy tạo thành các khối u Phải chăng đây cũng là một trong những nguyên nhân làm gia tăng bệnh nhân ung thư trên thế giới hiện nay

Theo Codex Alimentarius, ngũ cốc đùng trong thực phẩm cho người phải có hàm lượng Aflatoxin Bị <5ppb, thức ăn cho gia súc <20ppb

15