CHƯƠNG VII. CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN THỰC pps

Các vector tạo dòng  Cosmid: • Là vector plasmid chứa gene cos của phage λ Tái bản giống plasmid • Chèn được đoạn DNA lớn 35-45 kb Các vector tạo dòng  Phagemid: • Là sự kết hợp giữa

Trang 1

CHƯƠNG VII

CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN

THỰC VẬT

Quá trình chọn lọc tự nhiên

• Trao đổi vật liệu di truyền  tạo ra những tính trạng mong muốn  gia tăng sản lượng cây trồng

• Tính trạng chỉ được tạo ra từ những dòng hữu thụ

• Không loại trừ được những tính trạng không mong muốn

Kỹ thuật tái tổ hợp DNA

• Giải quyết được những vấn đề trong

chương trình tạo giống cổ điển

• Nhờ xác định và dòng hóa những gene

chuyên biệt cho tính trạng mong muốn

VD: tính trạng chịu rét, chịu mặn, kháng

thuốc diệt cỏ, chín chậm, …

Overview genetic engineering

• Mục đích thay đổi di truyền

• Nguồn, chức năng và khả năng tiếp hợp bền vững của gene chuyển

• Phân tích thành phần thực phẩm (hàm lượng dinh dưỡng, độc tố tích lũy,…)

• Cây trồng chuyển gene thương mại đầu

tiên: FLAVRSAVR tomato (Calgene

Inc )

• Ức chế gene tạo enzyme

polygalactu-ronase (PG) phân hủy pectin nhờ

chuyển antisense gene

Dòng hóa gene đích

• Nguồn gene đích có thể là DNA nhiễm sắc thể hay cDNA từ mRNA

• Enzyme công cụ

• Vector tạo dòng

Trang 2

Các enzyme công cụ

• Restriction

enzymes

(Enzyme cắt

giới hạn)

• Ligase

(Enzyme nối)

Cho trình tự DNA:

3’…GGATCTAGAAATTGG…ATCTAGATT…5’

A) Xử lý DNA trên với enzyme giới hạn

BgIII (A/GATCT) Sẽ thu được mấy đoạn

DNA trong 2 trường hợp DNA đã cho là

mạch thẳng và mạch vòng Vẽ các đoạn

DNA được phóng thích (nếu có)

B) Có thể xen đoạn DNA được phóng thích

vào vector được cắt bởi enzyme BamHI

(G/GATCC) hay không? Vẽ hình minh họa

Các vector tạo dòng

 Phage λ:

• DNA sợi đôi thẳng

• Kích thước: 48,5 kb

• Chèn DNA có kích thước 18-25 kb

Electron micrograph of bacterial phage from the host E coli

 Phage M13:

• DNA sợi đơn vòng

• Kích thước: 6,4 kb

• Nhiều dạng biến đổi của M13 có mang

các polylinker (hay MCS)

 Plasmid:

• DNA vòng sợi kép, nằm ngoài NST VK

• Chèn DNA có kích thước 18-25 kb

pBR322

4361 bp pBR322

4361 bp

Trang 3

 Cosmid:

• Là vector plasmid chứa gene cos của

phage λ Tái bản giống plasmid

• Chèn được đoạn DNA lớn (35-45 kb)

 Phagemid:

• Là sự kết hợp giữa phage M13 với plasmid

Tạo plasmid tái tổ hợp

Xây dựng DNA library

• Việc lựa chọn DNA hay cDNA phụ

thuộc vào tính trạng mong muốn

chuyên biệt và vào hệ phương pháp

• Tập hợp những đoạn DNA hay cDNA

được gắn vào vector thích hợp

(plasmid hay phage)

• Chuyển vector vào vi khuẩn để nhân số

lượng và chọn lọc  DNA library

Sàng lọc gene mục tiêu

1 Chọn lọc:

• Vector mang gene kháng kháng sinh

(tetracyclin, penicillin hay ampicillin)

• Chỉ có dòng nào chứa vector mới sống

được trên môi trường chọn lọc có chứa

chất kháng sinh

2 Sàng lọc:

• Gene lacZ’ sản xuất β-galactosidase thủy giải X-gal tạo sản phẩm có màu xanh lam

• Nếu có DNA gắn xen vào lacZ’  mất khả năng thủy phân X-gal  khuẩn lạc không có màu xanh

Trang 4

3 Xác định gene đích:

• Chuyển vi khuẩn lên giấy lọc

• Rửa giấy lọc với dung dịch làm biến tính DNA có chứa các probe đánh dấu phóng xạ

• Tìm vết phóng xạ

• So sánh với đĩa Petri ban đầu

Screening DNA library

Các phương pháp

chuyển gene:

• Gián tiếp qua

Agrobacterium

• Trực tiếp: PEG,

xung điện, bắn

gene

Chuyển gene gián tiếp nhờ

Agrobacterium

• Agrobacterium sống lân cận hay ngay trên bộ rễ  xuyên qua các vết thương

 tổ chức tế bào thực vật phát sinh bướu

Trang 5

Agrobacterium

• Tác nhân gây tạo bướu là Plasmid Ti của

vi khuẩn

Agrobacterium

• Gene tạo bướu nằm trên đoạn T-DNA

• Sự di chuyển của T-DNA vào tế bào thực vật chịu sự quy định của gene vir

Agrobacterium

• Loại bỏ các gen gây khối u và gen mã hoá opine

của T-DNA và thay thế vào đó là các marker

chọn lọc Gen chuyển được xen vào giữa các

vùng bờ của T-DNA

Agrobacterium

• Khi DNA vi khuẩn được hợp nhất với nhiễm sắc thể thực vật, nó sẽ tấn công vào hệ thống tổ chức của tế bào một cách có hiệu quả và sử dụng nó để đảm bảo cho sự sinh sôi của quần thể vi khuẩn

Chuẩn bị Agrobacterium mang plasmid Ti chứa gene đích:

• Sàng lọc E.coli chứa gene đích

• Tiếp hợp giữa E.coli và Agrobacterium

• Tái tổ hợp tương đồng giữa 2 plasmid

Trang 6

Quy trình chuyển gene

• Chuẩn bị mô cấy và dịch huyền phù VK

• Ngâm chung mô với vi khuẩn

• Nuôi chung mô với vi khuẩn (2 ngày)

• Rửa mô bằng dung dịch kháng sinh

• Cấy chuyền mô sang môi trường có tác

nhân chọn lọc

• Tái sinh cây chuyển gene

Một vài yếu tố ảnh hưởng

đến hiệu quả biến nạp

• Loại mô được biến nạp

• Giai đoạn phát triển của mô

tumefaciens sử dụng

• Môi trường để nuôi cấy mô sau khi biến nạp

• Marker được sử dụng để chọn lọc thể biến

nạp

• Loại vector sử dụng

• Kiểu gen của thực vật

Agrobacterium

• Hệ thống chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium là có hiệu quả đối với một số loài nhưng không phải tất cả thực vật có thể được biến nạp bằng con đường này

• Ðặc biệt, lớp một lá mầm bao gồm các cây ngũ cốc chính trên thế giới như lúa, lúa mì

và ngô là không được biến nạp dễ dàng nhờ

A tumefaciens

Các phương pháp

chuyển gene:

Agrobacterium

gene

• Để DNA dễ xâm nhập được vào tế bào thực vật, phải loại bỏ vách tế bào tạo protoplast  Chuyển gene trực tiếp bằng cơ chế vật lý đơn giản, không cần

có vector

• Để nâng cao hiệu quả biến nạp, xử lý protoplast với PEG hoặc dùng xung điện

Trang 7

Chuyển gene bằng xung

điện

• Là một phương pháp cơ học

• Màng tế bào không cho các phân tử

phân cực như DNA tự do đi qua

• Kỹ thuật xung điện dựa trên trạng thái tương đối yếu của các tương tác kỵ nước của phospholipid kép và khả năng tập hợp lại một cách tự động của nó sau khi bị rối loạn  Xung điện chớp nhoáng có thể gây rối loạn ở các vị trí của màng một cách nhất thời, làm cho các phân tử phân cực

có thể đi qua nhưng sau đó màng có thể đóng kín lại nhanh chóng và tế bào không

bị ảnh hưởng gì cả

điện

• B1: Các tế bào chủ và DNA ngoại lai

được tạo thành dịch huyền phù và cho

vào trong một cuvette nhựa có điện

cực

điện

• B2: Tạo xung điện bằng máy xung gene (gene pulser)

• CT1 đóng: tụ điện nạp điện

và tích một điện áp cao

• CT2 đóng: điện

áp phóng qua dịch huyền phù

tế bào

điện

• Xung điện cần thiết: 200 - 600 v/cm 2 (thay đổi tùy theo kích thước của tế bào) trong vài phần triệu giây đến một phần ngàn giây

 tạo ra các lỗ tạm thời

• Các phân tử đã được nạp điện đi qua màng tế bào thông qua các lỗ bằng cách thức tương

tự như điện di

Trang 8

Ưu điểm

• Với một số cây một lá mầm quan trọng (loài lúa phụ Japonica, ngô, lúa mì) mà không thể thể thực hiện được bằng phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium thì người ta đã thành công với phương pháp này Hiệu quả biến nạp cao

• Ðoạn DNA ngoại lai được biến nạp có kích thước lớn

• Nếu các xung điện có cường độ và

chiều dài không đúng thì một số lỗ của

tế bào sẽ trở nên quá lớn hoặc bị hỏng

không thể đóng lại sau khi tế bào

phóng điện, làm cho tế bào bị tổn

thương hoặc bị thủng

Nhược điểm

• Một hạn chế nữa là sự vận chuyển DNA ngoại lai vào và ra khỏi tế bào trong suốt thời gian điện biến nạp là tương đối không đặc hiệu Điều này dẫn đến kết quả là không cân bằng ion mà sau

đó sẽ làm rối loạn chức năng của tế bào và tế bào chết

Nhược điểm

• Phải tạo protoplast, tái sinh

protoplast không đơn giản, tốn nhiều

công sức, bị ảnh hưởng của nhiều yếu

tố môi trường

• PEG tạo ra các lỗ tạm thời trên màng

tế bào  giúp DNA thấm vào trong tế bào

• Tần số chuyển gene bằng phương pháp này không cao

• PEG còn gây kết dính tế bào trần  ảnh hưởng đến tỉ lệ sống của tế bào

Trang 9

Các phương pháp

chuyển gene:

Agrobacterium

gene

Chuyển gene bằng súng

bắn gene

• Tên chính xác: hệ thống phân phối hạt biolistic (biolistic particle delivery system; biolistics = biology + ballistics)

• Là một thiết bị sử dụng để đưa thông tin di truyền vào tế bào, được thiết kế đầu tiên cho biến nạp DNA ngoại lai vào tế bào thực vật

bắn gene

• Gồm 2 buồng bằng thép không gỉ nối

với 2 bơm chân không

bắn gene

• Nguyên lý chung của phương pháp này

là sử dụng áp lực xung của khí helium

để gia tốc các hạt

• Ðạn sử dụng cho loại súng này là các hạt kim loại nặng cơ bản được bao bọc DNA

bắn gene

• DNA được gắn vào các hạt tungsten (vàng,

bạc) có đường kính khoảng 1μm

• Các hạt này được đặt bên trên một cái đĩa ở

mặt bên trong của súng

• Sự bùng nổ khí ở 1000psi làm cho đĩa bắn về

phía trước

• Một tấm chắn làm dừng đĩa lại và các hạt

tungsten được phóng về các tế bào đích

Trang 10

bắn gene

• Mục tiêu của súng bắn gene thường là

callus nuôi trên đĩa petri

• Khi hạt tungsten va chạm vào đĩa, gel

và callus bị phá hủy nhiều nhưng cũng

có một số tế bào tiếp nhận hạt

tungsten được bao bọc DNA  DNA

xâm nhập và hợp nhất vào NST

Ưu điểm

• Thao tác dễ dàng

• Có thể chuyển gene vào nhiều loại tế

bào, mô

• Các tế bào được biến nạp có tỉ lệ sống

sót cao

• Cho phép đưa các gene vào tế bào ở vị

trí mong muốn

Xác nhận gene chuyển (nhờ reporter gene)

• Gene mã hóa β-glucuronidase (GUS) phân giải X-glucuronide (X-gluc) là một reporter gene hữu hiệu

• Mô thực vật được chuyển gene có màu xanh

Trang 11

Phương pháp phát hiện

• Khi gene đã được dòng hóa và chuyển

và tế bào chủ, cần phải xác nhận xem gene lạ có được sát nhập vào NST vật chủ hay không

• Có thể sử dụng 2 phương pháp Southern blot hay Northern blot

Phương pháp Southern blot

• DNA được cắt bởi một hay vài

restriction enzyme  tạo ra các phân

đoạn DNA

• Tách các phân đoạn DNA nhờ điện di

trên gel agarose

• DNA trên gel được biến tính tạo mạch

đơn

• Chuyển lên màng nitrocellulose nhờ lực

mao dẫn

Phương pháp Southern blot

• DNA được gắn lên màng là bản sao của DNA trên gel

• Lai với probe có đánh dấu phóng xạ và

có trình tự bổ sung với DNA ngoại lai

• Loại bỏ probe không gắn lên màng

• Xác nhận sự hiện diện của DNA ngoại lai trong cây được chuyển gene

Phương pháp Northern blot

• Tương tự như Southern blot

• Sử dụng mRNA thay vì DNA

• mRNA mạch đơn  không cắt bằng

restriction enzyme

• Probe là các cDNA bổ sung với mRNA

của gene được chèn

• Điểm bất lợi lớn nhất của tất cả các phương pháp chuyển gene trực tiếp là các DNA ngoại lai có xu hướng tái sắp xếp, tái tổ hợp dẫn tới hiện tượng sát nhập nhiều đoạn DNA và tái sắp xếp các đoạn gene chuyển

• Những cụm gene này dễ dẫn đến hiện tượng tái tổ hợp nội tại  transgene silencing

 Sử dụng vật liệu chuyển gene trực

Trang 12

Nghiên cứu chuyển gene trên thế giới

• Chuyển gene chịu mặn từ các loài cây Đước (Rhizophoraceae) vào cây lúa

• Chuyển gene Bt vào nhiều loại cây trồng như lúa, bông, ngô, đậu tương,…

• Chuyển các gene tham gia vào quá trình quang hợp của cây C4 vào cây C3

để tăng hiệu suất quang hợp

• Chuyển gene cố định đạm (nif gene) vào cây lúa

Nghiên cứu chuyển gene

trên thế giới

• Chuyển gene kháng thuốc diệt cỏ vào

cây lúa

• Chuyển gene chín chậm (ripening delay

gene) vào cây cà chua

• Chuyển gene mang nhiều đặc tính chữa

bệnh và có tác dụng làm dược phẩm:

gene tổng hợp insulin, gene tổng hợp

vitamin A,…

 Tăng năng suất cây trồng, tăng chất

lượng sản phẩm, không gây ô nhiễm môi

trường

Một số nghiên cứu chuyển gene ở Việt Nam

Chuyển gene kháng sâu đục

thân vào cây lúa

Nguyễn Hữu Hổ, Nguyễn Văn Uyển, Karabi Datta,

Swapan Kumar Datta (Viện sinh học nhiệt đới,

Viện lúa Quốc tế)

• Vật liệu: giống lúa Nàng Hương Chợ Đào

• Môi trường nuôi cấy mô lúa: MS có bổ sung 2,4-D (tạo mô sẹo) hoặc NAA, Kinetin (tái sinh cây)

• Chủng VK Agrobacterium tumerfasiens:

LBA4404 mang plasmid pBIN-BAR-UBI-IB-AB mang gene Bt tổng hợp giữa cryIA và cryIB, gene Bar

Trang 13

• Chuẩn bị dịch vi khuẩn: duy trì vi khuẩn

trên môi trường thạch LB có chứa 50

mg/l Kanamycin và 50 mg/l Rifampicin

Tăng sinh trên môi trường AB lỏng lắc

có chất kháng sinh trước khi gây nhiễm

cho tế bào lúa

• Chuẩn bị vật liệu chuyển gene: hạt lúa đã

khử trùng được nuôi cấy trên môi

trường MS có bổ sung 2 mg/l 2,4-D 

mô sẹo có khả năng phát sinh phôi

• Gây nhiễm: mô sẹo có khả năng phát sinh phôi được gây nhiễm với dịch vi khuẩn (OD=2) có chứa Acetosyringone

• Chọn lọc: cụm mô được rửa lại bằng nước cất vô trùng có bổ sung 500 mg/l Cefotaxime  Nuôi cấy trên môi trường chọn lọc có Phosphinothricin (3 mg/l)  Cấy chuyền mô kháng PPT sang môi trường chọn lọc từ 3-4 lần

• Tái sinh cây: môi trường MS có bổ sung

0,2 mg/l NAA, 2 mg/l Kinetin, 500 mg/l

Cefotaxim, có hoặc không có PPT

• Phân tích PCR: dùng mồi đặc hiệu cho

gene bar, sau đó chạy điện di trên gel

agarose

• Thử nghiệm enzyme Phosphinothricin

Acetyltransferase (PAT): sử dụng đồng

vị phóng xạ [1-14C] Acetyl-coenzymA

• Trắc nghiệm nhanh ELISA: phát hiện

protein cryIAb/cryIAc

• Tái sinh cây: môi trường MS có bổ sung 0,2 mg/l NAA, 2 mg/l Kinetin, 500 mg/l Cefotaxim, có hoặc không có PPT

• Phân tích PCR: dùng mồi đặc hiệu cho gene bar, sau đó chạy điện di trên gel agarose

• Thử nghiệm enzyme Phosphinothricin Acetyltransferase (PAT): sử dụng đồng

vị phóng xạ [1-14C] Acetyl-coenzymA

• Trắc nghiệm nhanh ELISA: phát hiện protein cryIAb/cryIAc

• Thí nghiệm Southern blot: sử dụng

enzyme giới hạn Hind III đối với gen

cryIA(b)-cryIB, enzyme Sma I đối với

gen bar

• Thử tính kháng thuốc diệt cỏ thương

mại Basta: theo dõi hiện tượng cháy lá

• Thử tính kháng sâu: Cắt đốt thân (8 cm)

cho vào đĩa petri, đặt 6 con sâu đục

thân lên đoạn thân  tính tỉ lệ số sâu

chết + số sâu thất lạc / tổng số sâu cho

vào đĩa

Định dạng
Số trang	13
Dung lượng	1,6 MB