CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN TỬ pps

o Promoter Pl• Được kiểm soát bởi protein ức chế cI của thực khuẩn thể lambda • Được kiểm soát nhờ sự nhạy nhiệt độ:  ở 30oC, thể ức chế cI được tổng hợp liên tục  liên kết với operat

CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN TỬ

CÔNG NGHỆ ADN TÁI TỔ HỢP

• Tách chiết phân tách AND ngoại lai từ sinh vật

đích

• Phản ứng nối AND – vector tạo phân tử AND

TTH

• Chuyển AND TTH vào tế bào chủ

• Chọn lọc các tế bào mang AND TTH

• Sản xuất, tinh sạch protein

 Các bước cơ bản tạo ADNtái tổ hợp

• Endonuclease giới hạn (RE)

CÔNG NGHỆ ADN TÁI TỔ HỢP

CÔNG NGHỆ ADN TÁI TỔ HỢP

Thao tác biểu hiện ở sinh vật nhân sơ

 Biểu hiện gen ở các promoter mạnh và có thể điều chỉnh

o Promoter gen 10 từ thực khuẩn thể T7

Thao tác biểu hiện ở sinh vật nhân sơ

Thao tác biểu hiện ở sinh vật nhân sơ

Nồng

độ AMPv

Vùng promoter – operator lac Mức độ

phiên mã

promoter

gen operator

promoter

gen operator

promoter

gen operator

promoter

CAP

AMPv Thể ức

chế lac Thể ức chế lac

CAP

AMPv

o Promoter tac và trc:

• Chứa vùng -35 của promoter trp và vùng -10 của

promoter lac

• khác nhau một cặp base duy nhất:

 Promoter tac: vùng -35 của trp và -10 của lac cách nhau 16 base

 Promoter trc: vùng -35 của trp và -10 của lac cách nhau 17 base

• Đều được cảm ứng khi bổ sung IPTG vào môi trường

• Mạnh hơn promoter trp 3 lần, hơn promoter lac 10 lần

Thao tác biểu hiện ở sinh vật nhân sơ

o Promoter Pl

• Được kiểm soát bởi protein ức chế cI của thực khuẩn thể lambda

• Được kiểm soát nhờ sự nhạy nhiệt độ:

 ở 30oC, thể ức chế cI được tổng hợp liên tục  liên kết với operator của promoter Pl  ngăn cản dịch mã tổng hợp protein đích

 ở 42oC, thể ức chế bị bất hoạt  promoter hoạt động 

protein đích

Thao tác biểu hiện ở sinh vật nhân sơ

o Promoter gen 10 của thực khuẩn thể T7

• Gen T7 ARN – pol – kiểm soát phiên mã của gen đích - được chèn vào NST của E.coli trên một thể tiềm tan của thực khuẩn thể lambda dưới sự kiểm soát của promoter lac của E coli

• Khi không có lactose hoặc IPTG, thể ức chế lac được

tổng hợp, ức chế o – lac và p – lac  ức chế tổng hợp T7 ARN – pol  gen đích không được phiên mã

• Khi có lactose hoặc IPTG  liên kết với thể ức chế lac 

ngăn cản sự ức chế phiên mã T7 ARN – pol  gen đích được phiên mã

Thao tác biểu hiện ở sinh vật nhân sơ

PROTEIN DUNG HỢP

 Protein dung hợp= protein đích liên kết protein tế bào

chủ  bảo vệ protein đích khỏi sự phân hủy của protease tế bào chủ

 Gắn nối phần mã hóa của hai hay nhiều gen với nhau

 Sự có mặt của protein chủ  protein dung hợp không thích hợp cho ứng dụng lâm sàng

 Protein chủ có thể ảnh hưởng đến hoạt tính sinh học của protein đích

 Cắt protein dung hợp:

• Nối gen protein đích và protein chủ bằng một đoạn

oligonucleitide mã hóa cho các aa được nhận biết bởi

protease không phải của vi khuẩn

PROTEIN DUNG HỢP

ứng dụng của protein dung hợp

o Sử dụng làm kháng

nguyên, kháng thể

o Được dùng để đơn giản

hóa quá quá trình tinh

• Khắc phục: tạo protein dung hợp

• Protein dung hợp protein đích – thioredoxin – được tổng hợp và tích tụ ở vùng nhạy thẩm thấu

 tiết vào môi trường nuôi cấy dạng hòa tan

 tinh sạch bằng ủ ở nhiệt độ cao – nhờ tính bền nhiệt (80oC của thioredoxin)

Xếp liên tiếp các gen theo một hướng

 VẤN ĐỀ:

o Để tăng lượng protein gen nhân dòng

tăng số bản sao plasmid

 Cạn kiệt nguồn năng lượng tế bào

 KHẮC PHỤC:

o Sắp xếp liên tiếp các trình tự của gen theo

hướng có thể phiên mã và dịch mã

o Yêu cầu trình tự nucleotide:

• hai đầu 5’ kéo dài của mỗi đoạn gen có 3

nucleotide khác nhau, mỗi đầu chỉ bổ

sung cho một đầu kéo dài khác trên một

Các vector biểu hiện dịch mã

• Cơ sở phân tử của sự dịch mã khác nhau là sự có mặt của tín hiệu khởi động dịch mã – vùng liên kết ribosome trên phân tử mARN (Ribosome Binding Site – RBS)

• RBS: trình tự 6 – 8 nu bắt cặp bổ sung với trình tự nu trên ARN

Cơ sở phân tử

• Gen đánh dấu chọn lọc: gen kháng ampicillin

• Promoter tac

• Vị trí đa điểm tách dòng: NotI, PstI, HindIII

• Vùng liên kết ribosome lacZ

• Codon khởi đầu ATG cách RBS 8 nu theo chiều xuôi

• Các yếu tố kết thúc phiên mã T1, T2 từ thực khuẩn thể lambda.

Các vector biểu hiện dịch mã

Vector biểu hiện pKK233 - 2

• Gen nhân dòng có các codon hiếm được sử dụng trong tế bào chủ - hiện tượng không tương hợp tế bào  tế bào chủ không tổng hợp đủ tARN nhận biết các codon

hiếm  giảm hiệu suất tổng hợp protein.

 Cải biến tế bào chủ để biểu hiện vượt mức

Các vector biểu hiện dịch mã Vấn đề

 ở E.coli và các G-, cầu disulfua được hình thành ở khoang chu chất

 Đòi hỏi sự tham gia của 2 enzyme chu chất hòa tan (DsbA, C) và hai enzyme màng (Dsb B,D)

 Các protein ngoại lai chứa từ 3 cầu disulfua trở lên thường cuộn gập không chính xác và tạo các thể vùi khắc phục :

 Đồng biểu hiện với enzyme hỗ trợ cuộn gập (ví dụ: disulfua isomerase)

 Đồng biểu hiện với sự biểu hiện vượt mức của enzyme chu chất hòa tan tạo liên kết disulfua (DsbC)

o Sự có mặt của aa ở đầu N bền với sự phân hủy của protease

o Trình tự nhạy với protease:

• Trình tự PEST – prolin (P), acid glutamic (E), serine (S), threonine (T)

• Thường bị chặn hai dầu bởi các cụm aa tích điện dương (lysine,

arginine) tín hiệu phân hủy cho protease

 Thay đổi vùng PEST tăng độ bền protein

Cài nhập ADN vào nhiễm sắc thể chủ

Vấn đề

• Số lượng bản sao plasmid

cao  gánh nặng trao đổi

chất cho tế bào chủ 

hiện tượng mất plasmid

trong quá trình sinh

trưởng  giảm hiệu suất

sản phẩm gen nhân dòng

Khắc phục

 Hai phương pháp chủ yếu:

1 Nuôi tế bào trong môi trường

có kháng sinh hoặc chất đồng hóa bắt buộc chọn lọc tế bào mang plasmid có khả năng

kháng kháng sinh giá thành cao

2 Đưa ADN nhân dòng trực tiếp vào ADN nhiễm sắc thể một phần của tế bào chủ tồn tại bền qua nhiều thế hệ không cần hóa chất chọn lọc

Cài nhập ADN vào nhiễm sắc thể chủ

• Vị trí cài nhập là vị trí không

mang gen cần thiết của NST

• Được kiểm soát bởi một promoter

có thể điều khiển

• AND đích phải có độ tương đồng

trình tự nhất định (ít nhất là

50nu) với ADN NST trao đổi

vật lý (tái tổ hợp) giữa hai phân

tử AND

 Quy trình cài nhập:

1 Nhận dạng vị trí cài nhập

2 Phân lập và nhân dòng một phần hoặc tất cả vùng cài nhập NST

3 Gắn nối gen nhân dòng và một promoter có thể điều khiển vào đúng hoặc lân cận vị trí cài nhập

4 Chuyển bản thiết kế đoạn cài nhập NST – gen nhân dòng vào tế bào chủ như một phần plasmid mà không sao chép trong tế bào chủ - cần thiết để xảy ra trao đổi chéo xúc tác bởi enzyme tế bào chủ

5 Chọn lọc và duy trì các tế bào có biểu hiện gen nhân dòng

Phương pháp cài nhập AND vào nhiễm sắc thể

 Việc cài nhập AND đích vào

NST có thể thực hiện nhờ trao

đổi chéo

 Trao đổi chéo kép ưu điểm:

chỉ mình gen nhân dòng được

cài nhập vào NST, chỉ áp dụng

khi nhận dạng được một vị trí

không cần thiết trên NST

 Trao đổi chéo đơn: khi trên

NST không có một vị trí không

cần thiết nào cài nhập toàn

bộ plasmid ngoại lai cài

nhập cả gen đánh dấu chọn

lọc hiệu quả không mong

muốnloại bỏ gen đánh dấu

chọn lọc

 Loại bỏ gen đánh dấu chọn lọc:

o Thiết kế gen đánh dấu chọn lọc chặn hai đầu bởi trình tự AND đặc hiệu được nhận biết cắt bởi enzyme đặc hiệu khi bổ sung chất cảm ứng vào môi trường

Cài nhập ADN vào nhiễm sắc thể chủ

Sự tiết protein ở E.coli

• Sự tiết protein: kết quả sự

đi qua màng tế bào vào

vùng chu chất, hoặc qua

màng ngoài vào môi

trường của protein

tỷ lệ tiết cao

o E.coli và các G- tiết protein vào môi trường nhờ sự có mặt của màng ngoài

o Biến thể của vi khuẩn thông thường

o Tồn tại ở dạng thiếu thành tế bào – kết quả của đột biến tự phát khi

xử lý các vk nhạy cảm với chất cảm ứng dạng L: penicillin,

Sự tiết protein ở E.coli

Gánh nặng trao đổi chất

1 Tăng số bản sao và/ hoặc kích thước plasmid  tăng nhu

cầu tế bào cho việc sao chép và duy trì plasmid

2 Giới hạn hàm lượng oxy hòa tan trong môi trường nuôi cấy

3 Biểu hiện cao cả protein đích và protein đánh dấu  làm cạn

kiệt nguồn aminoacyl – tARN, nguồn aa và nguồn năng lượng của tế bào chủ

4 Sự biểu hiện vượt mức protein ngoại lai  vận chuyển vào

khoang chu chất  tắc nghẽn vùng tiết xuất  ngăn cản sự định vị đúng protein tế bào chủ cần thiết

5 Một số tế bào chủ vốn có đặc tính trao đổi chất bất

thường  dễ bị ảnh hưởng bởi trạng thái gánh nặng trao đổi chất

6 Protein ngoại lai xen vào chức năng tế bào chủ  tạo ra sản

phẩm độc hại đối với tế bào chủ

Nguyên nhân gánh nặng trao đổi chất

1 Giảm tốc độ sinh trưởng của tế bào sau khi đưa AND

ngoại lai vào

2 Mất plasmid tái tổ hợp

3 Thay đổi hình dạng kích thước tế bào chủ

4 Tăng hàm lượng polysaccharide ngoại bào do vi khuẩn

chủ tổng hợp  gây kết dính tế bào  khó khăn cho

việc thu nhận tinh sạch protein

Gánh nặng trao đổi chất

Hệ quả của gánh nặng trao đổi chất

SẢN XUẤT PROTEIN DỊ CHỦNG TRONG TẾ BÀO

NHÂN CHUẨN

 Không tạo ra phiên bản protein đích thực của nhân

chuẩn – không bền hoặc không có hoạt tính sinh học

nguyên nhân do:

 Cuôn gập protein không chính xác

 Không có cơ chế cải biến sau dịch mã

 Quá trình tinh sạch phức tạp, không loại bỏ hết yếu tố vi khuẩn gây độc

Nhược điểm của hệ thống biểu hiện nhân sơ

 Sự hình thành liên kết disulfua:

o Sự tham gia của enzyme nhân chuẩn protein disulfua isomerase

(PDI)

 Sự glycosyl hóa:

o Gắn các đường đặc hiệu vào các aa xác định tạo tính bền và

tính liên kết riêng biệt cho protein

 Cấu trúc vector giống như hệ thống biểu hiện nhân sơ

o Promoter nhân chuẩn ddiieuf khiển phiên mã gen nhân dòng

o Tín hiệu kết thúc phiên mã và dịch mã nhân chuẩn:

• Tín hiệu kết thúc phiên mã: vị trí poly (A)

• Tín hiệu kết thúc dịch mã: một trong ba codon kết thúc: UAA, UAG, UGA

o Trình tự giúp poly A hóa mARN

o Gen đánh dấu chọn lọc nhân chuẩn

SẢN XUẤT PROTEIN DỊ CHỦNG TRONG TẾ BÀO

NHÂN CHUẨN

Vector biểu hiện nhân chuẩn

 Hệ vector thường được sử dụng ở hệ thống biểu hiện nhân chuẩn: vector con thoi

o Hai vùng khởi đầu sao chép:

1 Vùng khởi đầu sao chép nhân chuẩn

2 Vùng khởi đầu sao chép E.coli

CHÚ Ý:

Sự gắn thêm AND ngoại lai gây biến đổi di truyền

1 ở vi khuẩn, nấm men: dgl biến nạp

 Dòng tế bào được sử dụng:

o Biểu hiện tạm thời: tế bào thận khỉ xanh châu Phi

(COS), thận chuột Hamster non (BHK), thận phôi người (HEK – 239)

o Biểu hiện lâu dài: tế bào trứng chuột hamster Trung

 Vector biểu hiện động vật

có vú:

o Vùng khởi đầu sao chép

nhân chuẩn – thường là từ

virus động vật

o Promoter điều khiển gen

nhân dòng và gen đánh dấu

o Một intron lai – chứa vị trí

cắt – nối cho và nhận từ hai

gen khác nhau – nằm giữa

• Eu – ori: vị trí khởi đầu sao chép nhân chuẩn

• E – ori: vị trí khởi đầu sao chép E.coli

• ampR: gen kháng amp

• Trình tự chứa các vùng không được dịch mã đầu 5’ và 3’ – 5’UTR và 3’ UTR (untranslated region tăng hiệu quả dịch mã và góp phần làm tăng độ bền mARN

• Trình tự Kozak (K):

 Trình tự nu đặc biệt bao quanh codon mở đầu:CCA(G)CCAUGG

• Trình tự tín hiệu (S ): theo sau trình tự K tạo điều kiện cho việc tiết

• Trình tự đuôi ái lực protein (T): tăng khả năng tinh sạch protein tái

Các yếu tố điều hòa dịch mã ở sinh vật nhân chuẩn

5’ - UTR K S T P Gen đích SC 3’ - UTR

• Dạng hoạt động của protein động vật có vú thường chứa hai chuỗi protein khác nhau

 Thiết kế hệ thống biểu hiện hai vector:

 Mỗi vector mang một gen hay cADN của một trong các tiểu phần protein và một gen đánh dấu chọn lọc khác nhau

 Đồng chuyển nhiễm vào tế bào chủ

 Nhược điểm:

 Hiện tượng mất một trong hai vector

 Số lượng bản sao của hai vector không luôn được duy trì bằng

nhau một tiểu phần được tạo ra nhiều hơn giảm hiệu suất tổng hợp sp cuối cùng

 Khắc phục : Hệ thống một vector duy nhất mang hai gen nhân dòng

SẢN XUẤT PROTEIN DỊ CHỦNG TRONG TẾ BÀO

NHÂN CHUẨN

Hệ thống biểu hiện hai vector

• Cấu trúc vector: gen α – IRES – gen β – hình thành một đơn vị phiên mã.

• IRES: internal ribosomal entry site – vị trí gắn trong ribosome

 Được tìm thấy trong hệ gen virus của động vật có vú

 Sau khi phiên mã chúng cho phép đồng thời dịch mã các protein

khác nhau từ một mARN polycistron.

• Một promoter, một tín hiệu polyA, một tín hiệu kết thúc phiên mã

• Phiên mã cho một bản mARN hai gen duy nhất

• Dịch mã từ đầu 5’ của mARN để tổng hợp chuỗi α, và ở bên trong từ yếu tố IRES đê tổng hợp chuỗi β

• Các tiểu phần α, β được tổng hợp và lắp ghép để tạo thành protein dimer αβ có chức năng.

SẢN XUẤT PROTEIN DỊ CHỦNG TRONG TẾ BÀO

NHÂN CHUẨN

Hệ thống một vector duy nhất mang hai gen nhân dòng

• Hệ thống biểu hiện chọn lọc các tế bào chuyển nhiễm ở động vật có vú tương tự như các hệ thống tế bào chủ khác

• ở động vật có vú, các hệ thống chọn lọc DHFR – MTX (dihydrofolat reductase – methotrexat) cho phép chọn lọc các tế bào có số lượng lớn bản sao của vector biểu hiện  tăng sản lượng protein tái tổ hợp

SẢN XUẤT PROTEIN DỊ CHỦNG TRONG TẾ BÀO

NHÂN CHUẨN

Hệ thống đánh dấu chọn lọc cho vector biểu hiện động vật có vú

ĐỘT BIẾN ĐỊNH HƯỚNG VÀ KỸ THUẬT PROTEIN

• Gây đột biến định hướng: thay đổi aa đặc hiệu mã hóa bởi gen nhân dòng tạo ra các aa phù hợp hơn cho quy trình công nghiệp

• Các kỹ thuật gây đột biến định hướng:

 Thay đổi hằng số Michaelis thay đổi mức độ liên kết enzyme – cơ chất, tốc độ phản ứng.

 Thay đổi chính chịu nhiệt hay độ bền pH, hoặc cả hai của một protein  protein cải biến được sử dụng trong điều kiện làm bất hoạt protein tự nhiên.

 Biến đổi hoạt tính enzyme trong dung môi không phải là nước puhh được thực hiện trong điều kiện phi sinh lý

 Thay đổi enzyme sao cho không cần một đồng nhân tố phải được bô sung theo chu kỳ

 Thay đổi vị trí liên kết enzyme – cơ chất tăng tính đặc hiệu giảm các phản ứng phụ không mong muốn

 Tăng tính chống chịu của protein với các protease nội bào dễ tinh sạch

 Thay đổi điều hòa dị lập thể giảm ảnh hưởng của sự kìm hãm ngược

Đột biến định hướng

 Là phương pháp đột biến điểm đặc hiệu  tạo các đột biến điểm xác định trong gen nhân dòng

 Yêu cầu: xác định được:

o Trình tự nu chính xác trong vùng AND mã hóa cho mARN cần biến đổi

o Các thay đổi các aa cần thực hiện

Các quy trình đột biến định hướng

Đột biến định hướng oligonucleotide với AND M13

 Pp đột biến định hướng với AND M13 :

o Gen nhân dòng được chèn vào dạng sợi kép của vector thực khuẩn thể M13

o Phân lập dạng sợi đơn (sợi M13+ mang một gen nhân dòng) của vector tái tổ hợp  trộn với oligonucleotide tổng hợp

o Đoạn oligonucleotide tổng hợp có trình tự bổ sung chính xác với gen nhân dòng trừ duy nhất 1 nu bắt cặp sai – ăn khớp chính xác với nu của codon mARN cần thay đổi

 Oligonu lai với vùng bổ sung của gen nhân dòng (trong điều kiện lượng oligonu dư so với AND M13, vị trí bắt cặp sai ở gần trung tâm oligonu, phản ứng thực hiện ở nhiệt độ thấp, nồng độ muối cao)  phân tử M13 xoắn kép hoàn chỉnh chứa

nu bắt cặp sai

 Biến nạp vào E.coli

 Sản xuất các hạt virus M13

 Phân giải tế bào  vết tan

Đột biến định hướng oligonucleotide với AND M13

o AND đích được chèn vào vị trí MCS của plasmid mang gen kháng tetracyclin hoạt động và gen kháng amp

không hoạt động do sự thay thế một nu ở gen amp

o Biến nạp vào E.coli

o Tách chiết AND plasmid sợi kép  xử lý kiềm tạo dạng sợi đơn vòng  ủ với 3 oligonu:

• Một oligonu làm thay đổi AND đích

• Một oligonu sửa chữa nu bị thay thế ở gen kháng amp

• Một oligonu làm thay đổi gen tet  bất hoạt gen

• Tổng hợp AND mới

• Chọn lọc tính kháng amp và tính nhạy tet

Đột biến định hướng oligonucleotide với AND plasmid