Giới thiệu chung về Biosensor

Giới thiệu chung về Biosensor

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ BIOSENSOR 1.1 LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN CỦA BIOSENSOR

Năm 1956, giáo sư Leland Clark Jnr – người khai sinh về khái niệm điện cựcsinh học (Biosensor) đã có công bố về điện cực Oxy Dựa trên kinh nghiệm và tâmhuyết của mình, ông đã phát triển lĩnh vực phân tích giúp có thể đo lường được trong

Năm 1975, ý tưởng của Clark trở thành hiện thực với sự công bố của công tyYellow Springs Instrument (Ohio) về máy phân tích glucose dựa trên việc đo dòngđiện của hydro peroxide Đây là lần đầu tiên các phòng thí nghiệm trên thế giới phântích dựa trên một Biosensor Cũng vào năm này, Biosensor tiến thêm một bước mới làkhi Divis đề xuất rằng vi khuẩn có thể được dùng như một yếu tố sinh học trong điệncực vi khuẩn để đo hàm lượng rượu

Năm 1976, La Roche (Thụy Sĩ) giới thiệu máy phân tích Lactat (LactateAnalyser – LA640) trong đó sử dụng tác nhân trung gian hexacyanoferrat hòa tan đểchuyển các electron từ lactatdehydrogenase tới một điện cực Mặc dù không thànhcông trên thương trường nhưng là bước đột phá quan trọng cho một thế hệ củaBiosensor được ứng dụng trong thể thao và chẩn đoán lâm sàng

Năm 1987, điện cực enzym screen-printed được công bố bởi Medisense(Cambridge, USA) với dụng cụ đo có kích thước như một chiếc bút cho phép giám sátlượng glucose trong máu tại nhà Điện cực này được thiết kế lại làm cho thông dụnghơn và số lượng bán của Medisense đã đạt tới 175 triệu đôla năm 1996 khi họ đượcAbbort mua lại Hiện nay Hãng Boehringer, Manheim và Bayer đang cạnh tranh nhaurất gay gắt về Biosensor và lượng bán ra của ba công ty chiếm ưu thế trên thị trườngBiosensor của thế giới tới 85%

1.2 KHÁI NIỆM VỀ BIOSENSOR

Biosensor thực chất là một thiết bị phân tích chuyển một tín hiệu sinh học thànhmột tín hiệu điện Đầu tiên, Biosensor sẽ nhận dạng hiện tượng và biên dịch thànhmột đặc tính có thể định lượng được, sau đó đặc tính định lượng này được chuyển đổithành một tín hiệu điện bởi một bộ biến năng Trong Biosensor, hiện tượng được nhậndạng bởi một hệ thống sinh học gọi là cơ quan thụ cảm sinh học (bioreceptor) Hệthống này sẽ tiếp xúc trực tiếp với mẫu phân tích gây ra phản ứng và tạo thành hợpchất nhạy cảm cho Biosensor Cơ quan thụ cảm sinh học có đặc tính chọn lọc đặc biệtđối với chất phân tích

Hình 1.1 Sơ đồ cấu tạo của biosensor

Chú thích: Chất xúc tác sinh học (a) chuyển cơ chất (S) thành sản phẩm (P) Bộ biến năng

(b) chuyển sản phẩm phản ứng thành tín hiệu điện Bộ khuếch đại (c) nhằm khuếch đại tín

hiệu điện của bộ biến năng Bộ vi xử lý tín hiệu (d) Màn hình hiển thị (e).

1.3 ĐẶC ĐIỂM – YÊU CẦU CỦA BIOSENSOR

Để định lượng, Biosensor phải đáp ứng yêu cầu liên quan đến đo lường: khả nănglặp lại, khả năng tái sử dụng cao, tính chọn lọc, tính nhạy cảm, vùng trả lời tuyến tínhvà thời gian đáp ứng tín hiệu tốt

Các phép đo có độ lặp lại tốt nếu như hai loạt kết quả thu được tương tự nhauđược thực hiện bởi cùng người phân tích, sử dụng cùng biosensor trong cùngmột mẫu phân tích

Phương pháp đo có khả năng tái sử dụng cao nếu các kết quả trước có thể đạtđược khi tiến hành phân tích lặp lại lần hai

Tính chọn lọc của biosensor thể hiện ở khả năng nhận ra một hợp chất đơntrong hỗn hợp các cấu tử của mẫu, khả năng này phụ thuộc vào cơ quan thụcảm sinh học và bộ biến năng Một biosensor có tính chọn lọc cao nếu nhưthành phần tạp chất của mẫu thấp.

Tính nhạy cảm của biosensor thể hiện ở sự thay đổi về lượng thì sẽ gây ra sựthay đổi về tín hiệu trả lời:

a = s mTrong đó a : Độ dao động về biên độ của dòng ra

m : Độ dao động về biên độ của dòng vào

s : Độ nhạy cảm của biosensor, đặc trưng cho mức độ phù hợp củabiosensor trong một ứng dụng cụ thể

Đối với Biosensor đo bằng điện thế thì biên độ của tín hiệu trả lời tỷ lệ thuậnvới logarite của nồng độ chất phân tích Theo định luật Nernst: a = s (logc)

Vùng tín hiệu tuyến tính thu được là một đường cong hiệu chỉnh của tínhiệu trả lời với nồng độ khác nhau của chất phân tích Đường cong chỉ thật sựcó ý nghĩa nếu tiến hành hiệu chỉnh cả hai loạt nồng độ tăng và giảm Đườngcong hiệu chỉnh gọi là tốt nếu như tín hiệu trả lời ổn định theo thời gian

Thời gian đáp ứng khá dài bởi bản chất của đường cong hiệu chỉnh, nócho biết một phương pháp đo cho tín hiệu trả lời nhanh hay chậm khi thay đổinồng độ

1.4 NGUYÊN LÝ HOẠT ĐỘNG CỦA BIOSENSOR

Các chất cần phân tích trong mẫu phân tích sẽ đi vào trong điện cực Màngngoài (external membrane) của biosensor sẽ cho các chất cần phân tích thấm qua Cácthành phần sinh học (enzym, tế bào vi sinh vật, mô, cơ quan) sẽ phản ứng với chất cầnphân tích và tạo ra các đáp ứng mà các bộ biến năng (transducer) có thể phát hiệnđược Các thành phần sinh học ở đây thực hiện các hoạt động sau:

Biến đổi các chất cần phân tích thành các chất hóa học khác thông qua cácphản ứng sinh hóa (biểu diễn bằng vòng tròn rỗng trong sơ đồ)

Giải phóng ra các sản phẩm hóa học rồi từ đây tạo ra các tác nhân kích thích

Thay đổi các đặc tính như quang học, điện học, cơ học.

Tạo ra một số các đáp ứng khác nhau với lượng có thể đo được

Còn có một số màng khác gần bộ phận transducer, những màng này có thể có cácđặc tính thấm khác nhau so với màng bên ngoài Tín hiệu ra của điện cực thườngphụ thuộc vào loại biến năng mà nó sử dụng

Hình 1.2: Nguyên lý hoạt động chung của một Biosensor:

- Chất cần phân tích

- Tác nhân kích thích (chất tạo ra tín hiệu)

Bảng 1.1: Một số điện cực enzym thường sử dụng

CHƯƠNG 2 PHÂN LOẠI BIOSENSOR

2.1 ĐIỆN CỰC ĐIỆN HÓA (Electrochemical biosensor)

2.1.1 Điện cực đo điện thế (potentiometric biosensor)

Điện cực đo điện thế hoạt động dựa trên nguyên tắc xác định sự khác nhau vềđiện thế giữa điện cực đo (probe electrode) và điện cực so sánh (reference electrode)(là điện cực có điện thế không đổi) Sự khác nhau về điện thế giữa hai điện cực làhàm của hoạt độ các ion trong dung dịch điện phân nơ đặt điện cực (điều kiện hoạtđộng của điện cực đo điện thế là không có dòng điện trong mạch đo, vì thế người tagọi nó là điện cực có dòng điện bằng không) Điện thế này được xác định theo phươngtrình Nerst:

Trong đó: Eo: Điện thế oxy hóa-khử tiêu chuẩn;

R: Hằng số khí;

T: Nhiệt độ tuyệt đối;

F: hằng số Faraday;

N: số điện tử trao đổi của cơ chất;

1, 2: Hoạt độ trong dung dịch và trong lớp màng điện cực

Điện cực đo (probe electrode):

Điện cực đo là điện cực có tham gia phản ứng điện hóa với một trong các cấu tửcủa cân bằng điện thế Điện cực đo phải có thế điện cực được thiết lập đủ nhanhvà có độ chính xác cao Trong điện cực điện hóa, điện cực đo thường dùng là điệncực màng và điện cực khí

 Điện cực khí :

Điện cực được cấu tạo bởi kim loại trơ như Pt, Au…tiếp xúc đồng thời với khí vàdung dịch chứa ion tương ứng với khí này Trên thị trường đã có điện cực khí hydro,điện cực Oxy, điện cực khí clo được sử dụng rộng rãi.

 Điện cực màng chọn lọc ion :

Điện cực màng chọn lọc thông thường là các bán pin có lớp màng phân cách dungdịch cần phân tích với một dung dịch chuẩn ở bên trong Nguyên tắc hoạt động củađiện cực màng là dựa vào sự xuất hiện của một đại lượng điện thế trên bề mặt củamàng phân cách chứ không phải do phản ứng điện hóa kèm theo sự vận chuyển ion.Màng có tác dụng thuận nghịch với một ion hay một nhóm ion trong dung dịch mộtcách chọn lọc Điện cực thủy tinh là điện cực điển hình của loại điện cực màng này.Tất cả các loại điện cực màng đều phải đáp ứng các yêu cầu bắt buộc sau đây:

1 Màng phải không được tan trong dung dịch cần phân tích Để đáp ứng được điều này, màng phải được cấu tạo từ những chất có phân tử lượng lớn như thủy tinh silicate hoặc nhựa polymer.

2 Màng chọn lọc phải có độ dẫn điện Độ dẫn điện này thường được tạo ra nhờ vào sự dịch chuyển của các ion hóa trị một bên trong màng.

3 Màng hoặc một vài phần tử chứa trong bộ khung của màng phải có khả năng tác dụng chọn lọc với ion cần khảo sát theo nguyên tắc: trao đổi ion, kết tinh hay tạo phức Hai nguyên tắc đầu phổ biến hơn nguyên tắc thứ ba.

Đây là loại điện cực màng thông dụng nhất Điện cực gồm một ống thủy tinh, ởđầu của ống là một bầu tròn cấu tạo bằng thủy tinh mỏng (0.06-0.10mm) Đây chínhlà lớp màng thủy tinh có thành phần xác định và có khả năng trao đổi chọn lọc vớiproton và các cation khác

Điện cực màng thủy tinh đo pH: Phổ biến nhất là thủy tinh chứa 22%Na2O,

6%CaO và 72%SiO2 có khả năng trao đổi chọn lọc ion H+ đến pH xấp xỉ 9 Ở pH caohơn, lớp màng thủy tinh trở nên kém chọn lọc với H+ vì có thể trao đổi với Na+ cũngnhư các cation hóa trị I khác Ngày nay người ta đã sử dụng loại thủy tinh trong đo Na+và Ca2+ được thay thế bởi Li+ và Ba2+ có khả năng xác định chọn lọc H+ ở pH cao hơn.Phần cuối của điện cực là một bầu thủy tinh có thành mỏng và có thành phần đặc biệt.Bên trong bầu thủy tinh chứa dung dịch H+ có nồng độ xác định Nhúng vào dung dịch

H+ là dây dẫn Pt hay kim loại Ag phủ AgCl Toàn bộ bộ phận trên được đặt trong ốngbảo vệ

Khi nhúng điện cực thủy tinh vào dung dịch chứa ion H+, ở hai bề mặt của màng thủytinh tiếp xúc với H+ có phản ứng trao đổi:

H+dd + Na+dd H+tt + Na+dd

nghĩa là ở hai mặt của lớp thủy tinh sẽ tạo ra hai lớp “gel” H2SiO3 (dày 10-4-10-5 mm)

do sự hiện điện của H+ trong thủy tinh Vì có hiện tượng trao đổi ion xảy ra ở hai mặtcủa màng thủy tinh nên mỗi lớp gel sẽ xuất hiện một điện thế có giá trị phụ thuộc vàohoạt độ của H+ trong dung dịch và hoạt độ của H+ trong lớp gel Hay nói cách khác,hiệu thế màng E qua lớp thủy tinh sẽ phụ thuộc vào hoạt độ của H+ bên trong bầu, của

H + ở ngoài bầu và hoạt độ H+ ở trong hai lớp gel Với giả sử rằng hiện tượng trao đổiion xảy ra ở hai mặt thủy tinh gần giống nhau và do cố định hoạt độ H + ở trong bầuthủy tinh nên hiệu thế màng E chỉ phụ thuộc vào hoạt độ của H+ trong dung dịch cầnkhảo sát

Bằng việc thay thế thành phần của thủy tinh sao cho điện thế màng không phụ thuộcvào giá trị pH, thường sử dụng Al2O3 và B2O3 ta có thể tạo ra các điện cực màng thủytinh dùng xác định các cation hóa trị I như Na+, K+, NH4+…

 Đầu dò khí:

Đầu dò khí là các thiết bị đo có tính chọn lọc và độ nhạy cao dùng để xác định cáckhí hòa tan hoặc các ion có thể chuyển thành khí hòa tan khi điều chỉnh pH của môitrường Bộ phận chính của đầu dò khí là một lớp màng xốp mỏng được lắp vào phầncuối của đầu dò và có thể được thay thế một cách dễ dàng Tấm màng này được gọi làmàng thấm khí, được chế tạo từ các polymer chịu nước như polytetrafluoroethylenehoặc polypropylene với độ xốp khoảng 70% (kích thước lỗ xốp nhỏ hơn 1m) Lớpmàng này sẽ phân tách dung dịch cần phân tích với dung dịch NaHCO3 và NaCl (nếuthiết bị dùng để đo CO2 hòa tan)

Điện cực chuẩn:

Trong hầu hết các ứng dụng điện hóa, ngoài điện cực đo ta phải sử dụng thêm mộtđiện cực có điện thế xác định và không đổi Điện cực này được gọi là điện cực chuẩnhay điện cực so sánh Điện cực chuẩn phải không tham gia phản ứng với bất kỳ thànhphần nào trong dung dịch cần khảo sát, phải thuận nghịch và tuân theo phương trìnhNerst, phải có điện thế không đổi theo thời gian và có thể lấy lại giá trị thế ban đầu

sau khi có dòng điện nhỏ chạy qua… Điện cực chuẩn thường là điện cực kim loại loạihai (kim loại M phủ một lớp hợp chất ít tan MA của kim loại đó và được nhúng vàotrong dung dịch muối có chứa anion A- có nồng độ xác định).

Chú thích:

a) Màng bán thấm

b) Thành phần sinh học

c) Màng thủy tinh

d) Điện cực thủy tinh đo pH

e) Điện thế giữa điện cực đo và điện cực so sánh

g) Dung dịch HClf) Điện cực đo Ag/AgClh) Điện cực so sánh

Ứng dụng: Điện cực đo điện thế được dùng để xác định glucose với sự cố định enzym

glucooxydase lên điện cực:

D-glucose Glucooxydase D-gluconat + H+

Đo lượng H+ tạo thành (đo pH sau khi giải phóng H+) sẽ xác định hàm lượng D glucose

-Xác định Ure với sự có mặt của enzym Urease:

c – Cáp bảo vệ

e – Dung dịch điện phân

m – màng kỵ nước

r – điện cực so sánh

Xác định lysin:

lysin lysindecarbocylase cadalverin + CO2

2.1.2 Điện cực đo dòng điện (Amperometric biosensor)

Điện cực đo dòng điện hoạt động dựa vào dòng điện chạy qua mạch đo khi đặtmột hiệu điện thế giữa hai điện cực (điện cực đo và điện cực so sánh) Mật độ của cáchạt tích điện tỷ lệ thuận với cường độ dòng điện chạy giữa hai điện cực

Cường độ dòng điện chạy giữa hai điện cực là hàm của mật độ các hạt tích điệntrong dung dịch và điện thế đặt giữa hai điện cực Trong đa số trường hợp, người tathường tiến hành oxy hóa hoặc khử một loại hạt tích điện trên cực đo

Nếu đặt vào điện cực đo một điện thế E biến thiên so với điện cực so sánh và vẽđường cong I = f(E), chiều cao I của bậc giới hạn khuếch tán sẽ tỷ lệ với nồng độ củahạt bị oxy hóa hoặc bị khử trên điện cực đo

Hình 2.3: Đồ thị I = f(E)

Chú thích: 1- E quá nhỏ để sự oxy hóa có thể xảy ra

2- vận tốc oxy hóa điện hóa và cường độ dòng điện sẽ tăng cường với sựtăng hiệu điện thế

3- cường độ không phụ thuộc vào hiệu điện thế và I = K.CredHiện nay các điện cực đo dòng điện đang được sử dụng rộng rãi là điện cực oxyvà điện cực hydroperoxyde Oxy và hydroperoxyde (H2O2) đều là những chất đượcsinh ra trong một số phản ứng có enzym xúc tác, cũng như trong phản ứng có các chấttrung gian oxy hóa-khử nhân tạo: ferrocyanua, ion N-metyl-phenazini (NMP) vàbenzoqiunon và chúng có thể xác định nhờ đo dòng điện

Các điện cực đo dòng điện thường sử dụng các enzym oxydoreductase để gắnvào màng Oxy, NAD+, NADP+ được dùng như chất nhận điện tử để phục hồi enzymsau khi tham gia phản ứng xúc tác cơ chất Các enzym sử dụng Oxy như oxydase và

enzym sử dụng NAD+, NADP+ được gọi là dehydrogenase hay reductase Trong hainhóm enzym này thì oxydase được dùng nhiều nhất Các điện cực đo dòng điện đượcsử dụng để xác định các cơ chất của enzym như glucose, monosacharide, hypoxanthyl,lactate, acid amin, sulfite, salicylate, oxalate và pyruvate.

Điện cực enzym để đo nồng độ glucose có cấu tạo gồm: một anod Pt và mộtcatod Ag phủ AgCl tiếp xúc với màng đã cố định glucoseoxydase (GOD) Cả hai đềuđược đặt trong dung dịch điện phân KCL Điện áp phân cực 0.68 Volt được đặt vàogiữa hai điện cực Dưới tác động của điện áp phân cực này H2O2 được giải phóng ra sẽ

bị oxy hóa ở mặt phân cách giữa anod và màng theo phản ứng:

Glucose GOD Acid gluconic + H2O2

H2O2 O2 + 2H++ 2e

-+ O2

Dòng điện đo được tỷ lệ với lượng H2O2 bị oxy hóa và do đó tỷ lệ với lượng glucosetrong môi trường cần đo

Hình 2.4: Sơ đồ nguyên tắc của điện cực đo dòng điện

Cũng như đo glucose, để đo lượng lactate, dùng điện cực có gắn lactatoxydase

(LOD) từ Pediscoccuspecies xúc tác phản ứng:

Lactate + O2 lactatoxydase pyruvat + H2O2

Để đo lượng cholesterol thì gắn enzym cholesteroloxydase (ChOD) từ

Rhodococcus eryththropolis, xúc tác phản ứng:

Cholesterol + O2 ChOD Chlest-4-ene-3-one + H2O2

Để đo lượng lactose thì gắn enzym -galactosidase (-GAL) từ E.coli và glucoozydase (GOD) từ A.niger, xúc tác các phản ứng:

lactose + H2O -GAL  -D-glucose + D-galactose

-D-glucose + O2 + H2O GOD acid gluconic + H 2 O2

Do quá trình chuyển khối H2O2 đến điện cực anod mà vận tốc phản ứng ở anodthường bị giới hạn Khi đó, cường độ dòng điện ở anod tỷ lệ thuận với nồng độ H2O2trong môi trường tiếp xúc với anod

Cũng có thể xác định lượng glucose qua đo nồng độ Oxy hòa tan trong dung

dịch nhờ điện cực Oxy hay điện cực Clark, có cấu tạo gồm: hai điện cực có khả năng

phân cực, một catod bằng Pt và một anod bằng Ag phủ AgCl Cả hai điện cực được đặtvào chất điện phân là KCl Hệ thống điện cực này được ngăn cách với môi trườngnghiên cứu bằng một màng thấm khí kỵ nước bằng teflon hay polypropylen) cho Oxythấm qua Dưới tác dụng của điện áp phân cực 0.65V đặt vào giữa hai điện cực, Oxykhuếch tán qua màng sẽ bị khử tại catod theo phản ứng:

O2 + 4e- + 4H+ 2H2O

Hình 2.5: Cấu tạo của điện cực Oxy xác định nồng độ Glucose

Dòng điện chạy giữa hai điện cực do phản ứng điện hóa tỷ lệ với lượng O2 bị khử và

do đó tỷ lệ với lượng O2 và lượng glucose Dòng điện được đo sau khi khuếch đại vàđược chỉ thị trực tiếp bằng số hoặc biểu diễn dưới dạng nồng độ Oxy hay áp suất riêngphần của Oxy

Phương pháp đo dòng điện này có những đặc điểm sau:

Phản ứng Enzym sẽ phụ thuộc vào vận tốc khuếch tán của cơ chất quamàng

Khi phản ứng oxy hóa – khử xảy ra, gradient nồng độ của cơ chất giảmdần, do đó vận tốc chuyển khối chậm và có thể dòng điện bị khử, để duy trìdòng điện không đổi cần phải giữ vững vùng tiếp xúc càng nhỏ càng tốt (tức làcần điều chế các vi điện cực có đường kính rất nhỏ, đến vài m)

Vận tốc phản ứng oxy hóa – khử phụ thuộc vào nồng độ Oxy hòa tan Đểhạn chế ảnh hưởng của nồng độ Oxy hòa tan trong dung dịch đến kết quả phântích thì người ta không sử dụng oxy làm chất nhận điện tử mà sử dụng các chấttrung gian để vận chuyển điện tử đến bề mặt điện cực Các chất vận chuyểnđiện tử trung gian có thể là ion Fe3+, N-methylphenazinium (NMP) hoặctetracyanoquinodimethane (TCNQ), hexacyanoferate

2.2 ĐIỆN CỰC ĐO NHIỆT (Calorimetric biosensor)

Các phản ứng giữa cơ chất và chất xúc tác sinh học thường giải phóng ra nhiệtnăng và người ta có thể đo lượng nhiệt giải phóng ra đó bằng một thiết bị đ nhiệt (điệncực đo nhiệt), từ đó sẽ tính được lượng cơ chất ban đầu Khi nhiệt lượng tỏa ra cànglớn thì độ nhạy phát hiện càng lớn Do đó để tăng nhiệt lượng tỏa ra, có thể cố địnhđồng thời 2 hoặc 3 enzym (cũng có thể lên tới 4-5 enzym)

Bảng 2.1: Enthanpi của một số phản ứng có enzym xúc tác:

H2O2 O2 + 2H++ 2e

-+ O2catalase

Qua nghiên cứu ta thấy cứ 0.1M cơ chất chuyển hóa hoàn toàn thành sản phẩm sẽtạo ra 100 kJ/mol Các thiết bị này phải luôn được đặt trong hệ thống cách nhiệt đểgiữ môi trường ổn định nhiệt độ

2.2.1 Điện cực enzym – cặp nhiệt

Trong loại điện cực này, bộ biến năng là cặp nhiệt điện Trên căp nhiệt, người taphủ một lớp màng chứa enzym Cặp nhiệt có cấu tạo gồm hai dây dẫn nối với nhaunhờ mối hàn Sức điện động E của mạch phụ thuộc vào bản chất của dây dẫn và vàonhiệt độ T1, T2 Thông thường nhiệt độ của một mối hàn được giữ ở giá trị không đổivà biết trước, gọi là nhiệt độ chuẩn T1 = Tref Nhiệt độ của mối hàn thứ hai khi đặttrong môi trường nghiên cứu sẽ nhạy cảm với sự thay đổi nhiệt độ của môi trường gây

ra do phản ứng xúc tác bởi enzym

Ưu điểm: Kích thước cặp nhiệt nhỏ nên có thể đo nhiệt độ ở từng thời điểm của

đối tượng cần nghiên cứu và tăng vận tốc hồi đáp tín hiệu (do nhiệt dung nhỏ) Trên

cơ sở này, Bataillard đã đưa ra cải tiến là sử dụng một cặp nhiệt bán dẫn (intergratedsilicon) để định lượng glucose, ure và penicillin Do tính chất của cặp nhiệt và lớp tiếpxúc enzym-cặp nhiệt có tính truyền nhiệt cao cho phép không phải kiểm soát chặt chẽnhiệt độ của môi trường xung quanh, do đó có thể thu nhỏ kích thước của thiết bị đểcó thể cấy vào dưới da đo trực tiếp nồng độ các chất trong máu

Hình 2.6: Sơ đồ điện cực enzym-cặp nhiệt2.2.2. Điện cực enzym- nhiệt điện trở:

Loại điện cực này còn có thể gọi là điện cực áo nhiệt vì buồng đo nhiệt hoàntoàn bị cô lập với môi trường xung quanh nhờ lớp áo nhiệt, quá trình này gần giốngvới quá trình đoạn nhiệt Loại thiết bị này có cấu tạo đơn giản và được sử dụng rộngrãi nhất

Hình 2.7: Sơ đồ điện cực enzym – nhiệt điện trở.

Chú thích: a- Ống mao dẫn

b- lớp vỏ áo nhiệtc- Thiết bị trao đổi nhiệtd- lớp cách nhiệt

e- nhiệt điện trở so sánhf- cột enzym (1mL)g- nhiệt điện trở đoh- ống mao dẫni- Nguồn điện

Cơ chất được đi vào thiết bị trao đổi nhiệt rồi qua cột enzym để phản ứng vớienzym và giải phóng ra nhiệt, nhiệt độ giải phóng ra sẽ được đo bởi nhiệt điện trở sosánh Kết quả đo được sau đó đi ra qua bộ xử lý để thu nhận tín hiệu.

Mối quan hệ giữa điện trở và nhiệt độ được xác định theo phương trình:

Hay:

Trong đó R1: điện trở của nhiệt điện trở so sánh, R2: điện trở của nhiệt điện trở đo, T1:nhiệt độ của mẫu sau khi qua bộ phận gia nhiệt, T2: nhiệt độ của mẫu sau khi qua cộtenzym, B: Hằng số nhiệt độ của nhiệt điện trở

Khi sự thay đổi nhiệt độ rất nhỏ, B(1/T1-1/T2) nhỏ hơn 1 thì khi đó eB(1/T1-1/T2) ~ 1 + B(1/T1-1/T2) và do đó ta có:

Khi T1~T2 thì biểu thức trên trở thành:

Độ giảm tương đối điện trở (R/R) của nhiệt điện trở thì tỷ lệ thuận với độ tăng nhiệtđộ T Hằng số tỷ lệ (-B/T12) là -4%oC-1 Do đó dựa vào sự thay đổi nhiệt độ mà cóthể xác định được chất cần phân tích

Ngoài cách chế tạo cột vật liệu sinh học như trên, người ta còn có thể bao bên ngoàinhiệt điện trở một lớp vỏ silicon và đặt màng cố định enzym ở trên, nhờ đó thu nhỏđược kích thước thiết bị

Hình 2.8: Điện cực Enzym-nhiệt điện trở có vỏ bọc silicon

Cũng có thể tích hợp nhiều nhiệt điện trở tạo ra điện cực nhiệt định lượng đồngthời nhiều chất Các nghiên cứu về loại điện cực nhiệt độ cho thấy ngoài những ứngdụng trong các lĩnh vực y tế, môi trường, thực phẩm, chúng còn có thể có những ứngdụng đặc hiệu như:

- Xác định các hằng số Ki, Km, Vm của enzym cố định (Stefuca, 1990)

- Định lượng ADP, ATP bằng cách sử dụng puruvatkinase và hexokinase đồngthời cố định trên aminopropyl CPG (Kirstein, 1989)

2.3 ĐIỆN CỰC ĐO QUANG (Optical Biosensor)

Điện cực đo quang được chế tạo dựa vào các tính chất vật lý của ánh sáng đểphát hiện ra sự biến đổi nhỏ trong mẫu phân tích

Nguyên tắc hoạt động: Dung dịch phân tích được tiếp xúc với màng và khi phảnứng enzym xảy ra thì sẽ có hiện tượng ánh sáng bị hấp thụ hoặc phát ra ánh sáng màu.Người ta có thể xác định được hàm lượng các chất của mẫu phân tích thông qua việc

đo độ hấp thụ ánh sáng hoặc sự phát quang ánh sáng của các chất tạo thành do phảnứng xúc tác bởi enzym

Cơ sở của kiểu điện cực quang là sự kết hợp các sợi dẫn ánh sáng với phép trắc phổquang, phép trắc huỳnh quang, hoặc phép đo phản xạ quang Nó có khả năng chỉ báonhững thay đổi của các thông số quang học, chẳng hạn như sự hấp thụ ánh sáng,chiều dài bước sóng hoặc chỉ số phản xạ trong môi trường đo bao quanh sợo dẫn.Những thiết bị này gắn vào hoặc là sợi đơn hoặc là chùm sợi kép để ánh sáng tới vàchùm tia sáng được đo

2.3.1. Điện cực đo phản xạ quang:

Điện cực này hoạt động theo nguyên tắc: năng suất phản xạ từ mặt phản xạ tuân theophương trình:

,%

0 0

I

I R

Trong đó C-nồng độ chất hấp thụ, K-hằng số hấp thụ, hằng số tán sắc

Kỹ thuật này được dùng để định lượng glucose trong máu nhờ thuốc hiện màu MBTH(3-methyl-2-benzotiazolinon) và DMAB (3-dimethyl-aminobenzoic acid) Hai enzymGlucooxydase (GOD) và peroxydase được cố định bằng cách hấp thụ lên bề mặt tấmnền đã phủ thuốc nhuộm Khi mẫu phân tích tiếp xúc với tấm nền thì phản ứng xảy ranhư sau:

H2O2

nếu H2O2 có nồng độ cao thì phải dùng enzym catalase Mẫu phân tích sau đó đượcđem đo năng suất phản xạ ở bước sóng thích hợp và từ đó sẽ tính được hàm lượngglucose

Với Biosensor dựa trên nền tảng của sự phản xạ toàn phần (total internal reflection –TIR) thì bề mặt dây dẫn được phủ kháng thể, sẽ tiếp xúc với mẫu phân tích Khi sóngánh sáng đi đến lớp màng nhạy thì chỉ có một phần nhỏ sóng ánh sáng bị hấp thụ vàotrong môi trường, còn tất cả chúng bị phản xạ lại nhiều lần và dần dần nguồn sáng bịsuy giảm Dựa vào lượng ánh sáng phản xạ, ta có thể tính được hàm lượng mẫu phântích

Hình 2.9: Biosensor dựa trên hiện tượng phản xạ toàn phần

2.3.2. Điện cực đo phát quang :

Nguyên tắc hoạt động: Cơ chất tác dụng với enzym cố định để tạo thành sảnphẩm có khả năng phát ra ánh sáng màu Đo ánh sáng màu đó ở một bước sóng nhấtđịnh sẽ suy ra được nồng độ cơ chất

Dựa vào đặc tính này, người ta thường sử dụng nó để xác định các vi khuẩn trong thựcphẩm Khi các vi khuẩn tác dụng đặc hiệu với ATP và D-luciferin dưới tác dụng củaenzym luciferase sẽ tạo thành oxyluciferin, AMP Pyrophosphate, CO2 và ánh sángvàng đo được ở bước sóng 562nm Từ đó xác định lượng vi khuẩn có mặt trong thựcphẩm

2.4 ĐIỆN CỰC ĐIỆN ÁP (Piezoelectric biosensor):

Nguyên lý của loại điện cực này dựa vào sự dao động của các tinh thể Cácchất điện môi tự nhiên như thạch anh, tuamalin, hoặc nhân tạo như liti sulfat, thạchanh tổng hợp…dao động khi chịu tác động của từ trường Tần số dao động của tinh thểphụ thuộc vào độ dày và sự biến dạng của tinh thể, mỗi tinh thể có một tần số daođộng đặc trưng Tần số dao động này thay đổi theo sự hấp thụ hay nhả hấp thụ từ bềmặt tinh thể, thông thường nó sẽ tăng khi có tạp chất hấp thu lên trên bề mặt của tinhthể Đo tần số dao động sẽ biết được nồng độ của cơ chất cần đo

Tần số dao động được tính theo công thức:

trong đó: f: Chênh lệch tần số dao động (Hz), m: chênh lệch khối lượng của chấthấp thu (g), K: hằng số đặc trưng cho sự dao động của tinh thể, phụ thuộc vào bề dàyvà độ nứt của tinh thể, A: diện tích bề mặt hấp thu (cm2).

Điện cực điện áp được dùng để đo amoniac, methane, lưu huỳnh dioxit và cơ chấtphosphate hữu cơ Ta có thể dùng nó để xác định nồng độ formaldehyde nhờformaldehyde dehydrogenase hay xác định dư lượng thuốc trừ sâu vô cơ phospho vốnkìm hãm enzym xholinesterase

Ưu điểm: Cho thời gian đáp ứng nhanh, nhỏ gọn và rẻ tiền

Nhược điểm: Không dùng phân tích mẫu dạng lỏng, dễ bị hư hỏng do độ ẩm không

Phản ứng kháng nguyên – kháng thể được xác định bằng nhiều cách, trong đó có kỹ thuật ELISA (enzym linked immunosorben assay: kỹ thuật hấp thụ miễn dịch có gắn enzym) Nguyên tắc của kỹ thuật ELISA như sau:

Kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên được cố định trên bề mặt của một ống Một hỗnhợp gồm một lượng đã biết phức kết enzym-kháng nguyên và một lượng chưa biết kháng nguyên của mẫu được đặt vào ống Sau một thời gian thích hợp kháng thể, phứcenzym-kháng nguyên và kháng nguyên tự do có thể gắn kết hoặc vẫn ở trạng thái tự

do, phụ thuộc vào nồng độ của chúng Các kháng nguyên tự do được rửa trôi và loại bỏ Lượng phức kết enzym-kháng nguyên gắn với kháng thể được xác định bằng vận tốc phản ứng enzym

Hình 2.11: Nguyên lý hoạt động của kỹ thuật ELISA

ELISA được sử dụng để phát hiện và khuếch đại một phản ứng kháng kháng thể Lượng kháng nguyên liên kết với enzym gắn với kháng thể cố định được

nguyên-xác định bằng nồ độ tương đối giữa kháng nguyên liên kết và kháng nguyên tự do vàđược định lượng bằng tỷ lệ của phản ứng enzym Để có thể đáp ứng nhanh chóng,người ta sử dụng các enzym có khả năng sử dụng lại nhiều lần Độ nhạy của phươngpháp này cũng có thể tăng lên bằng cách sử dụng các phản ứng có xúc tác enzym Cácphản ứng này cho đáp ứng nhanh hơn: chẳng hạn tạo ra các sản phẩm phát quang,hoặc huỳnh quang, hoặc có màu đậm hơn Kỹ thuật này hiện nay được sử dụng rộngrãi trong các phòng phân tích thí nghiệm.

Gần đây để tăng phạm vi ứng dụng, vận tốc và độ nhạy, kỹ thuật ELISA được kếthợp với các bộ Biosensor hình thành phương pháp sử dụng điện cực miễn dịch(immunosensor) Các điện cực miễn dịch này rất thích hợp khi sử dụng với điện cựcđiện áp hoặc các điện cực đo điện thế

Hình 2.12: Nguyên lý hoạt động của điện cực miễn dịch

(I): Điện cực sinh học dùng ở đây thay thế cho hệ thống giám định màu truyền thống.

a) Ống được phủ kháng nguyên cố định Một lượng dư phức kết enzym-kháng thể được đặt vào trong ống và xảy ra sự gắn kết;

b) sau một thời gian thích hợp, những phân tử nào không được gắn kết sẽ bị rửatrôi;

c) dung dịch chứa kháng nguyên phân tích được đưa vào ống, phụ thuộc vàonồng độ kháng thể mà xảy ra sự gắn kết và loại một số phức kết enzym-kháng thể.Lượng phức kết enzym-kháng thể loại ra được xác định bằng tín hiệu đáp ứng từ bộđiện cực sinh học

(II): Điện cực sinh học này dựa vào giám định trực tiếp các kháng nguyên gắn bề mặtđược phủ kháng thể

a) điện cực sinh học được phủ kháng thể (cố định), đặc hiệu với kháng nguyênphân tích Bộ chuyển đổi được ngâm trong dung dịch chứa một hỗn hợp gồmmột lượng đã biết phức kết enzym-kháng nguyên và nồng độ chưa biết khángnguyên phân tích;

b) sau một thời gian thích hợp, kháng nguyên và phức kết enzym-kháng thể đượcgắn với kháng thể;

c) những phân tử nào không được gắn với kháng thể bị rửa trôi và loại bỏ Lượngphức enzym-kháng nguyên gắn với kháng thể được xác định trực tiếp từ tínhiệu chuyển đổi

2.6 ĐIỆN CỰC VI SINH VẬT (microbial biosensor)

Điện cực vi sinh vật được chế tạo để phát hiện các chất hóa học, dựa vào sự hô hấp vàtrao đổi chất của vi sinh vật

Điện cực này gồm hai loại:

Điện cực dùng để đo sự thay đổi hoạt lực hô hấp của vi sinh vật cố định với mộtthiết bị đo điện thế

Điện cực dùng để đo các chất sinh ra từ vi sinh vật và phản ứng dễ dàng vớiđiện cực

Các vi khuẩn hiếu khí sử dụng Oxy và sản sinh năng lượng Nhờ việc đo lượng Oxytiêu thụ thông qua điện cực O2, ta có thể xác định và đánh giá được hoạt lực hô hấpcủa vi khuẩn Oxy thấm qua màng teflon và bị khử trên trên điện cực platin Nếu cácthành phần của dung dịch có ảnh hưởng đến hoạt lực hô hấp thì nồng độ của nó có thểđược định lượng thông qua việc xác định nồng độ Oxy.

Người ta thường dùng điện cực này để xác định chỉ số BOD (Biochemical OxygenDemand – nhu cầu Oxy sinh hóa) ( là lượng Oxy do vi sinh vật tiêu thụ để oxy hóasinh học các chất hữu cơ trong bóng tối ở điều kiện chuẩn về nhiệt độ và thời gian).Chỉ số BOD là thước đo lượng chất hữu cơ gây ô nhiễm nước và nó được sử dụng đểđánh giá chất lượng nước Các chất gây ô nhiễm có thể bị phân hủy bởi vi sinh vậtnhờ tiêu thụ Oxy Vì vậy mức độ ô nhiễm có thể được xác định thông qua việc đolượng Oxy

Điện cực được chế tạo bằng các cố định trichosporon cutaneun vào màng cellulose

và gắn với điện cực Oxy

Nguyên lý hoạt động của điện cực đo BOD: Oxy khuếch tán từ dung dịch bão hòa

không khí qua màng thẩm tích đi vào màng có chứa các tế bào vi sinh vật rồi quamàng teflon và cuối cùng chúng bị khử trên bề mặt catod Pt của điện cực oxy Dòngđiện của điện cực Oxy dần dần ổn định do vận tốc khuếch tán của Oxy qua màng cânbằng với vận tốc tiêu thụ Oxy do hô hấp của vi sinh vật cố định trên màng Người tagọi dòng điện này là dòng điện cơ bản (base current) Nếu ta cho chất đồng hóa hữu

cơ vào dung dịch đo thì khả năng phân tán oxy hòa tan trong dung dịch tăng do đó visinh vật sẽ sử dụng oxy cho hô hấp tốt hơn Kết quả là vâïn tốc hô hấp tăng dần cònnồng độ oxy hòa tan giảm dần, dẫn đến dòng giảm dần cho tới khi đạt đến trạng tháiổn định mới và người ta gọi dòng điện này là dòng đỉnh (pick current) Sự khác nhaugiữa dòng cơ bản và dòng đỉnh được gọi là dòng ra (output), tín hiệu của dòng ra tỷ lệthuận với nồng độ của các chất hữu cơ bị phân hủy sinh học của mẫu đo Vì vậy ta cóthể biết được nồng độ BOD dựa trên điện cực vi sinh vật

PHƯƠNG PHÁP CHẾ TẠO BIOSENSORViệc chế tạo Biosensor bao gồm ba bước:

Chọn lựa bộ thụ cảm sinh học

Chọn lựa bộ biến năng

Cố định thành phần sinh học lên bộ biến năng

3.1 CHỌN LỰA BỘ THỤ CẢM SINH HỌC (Bioreceptor):

Bộ thụ cảm sinh học đóng một vai trò là thiết bị nhận dạng sinh học Khi cómặt chất cần kiểm tra, bộ thụ cảm sinh học phải tạo ra một hiệu ứng hóa lý có khảnăng phát hiện bởi bộ biến năng Điều này liên quan nhiều quá trình chẳng hạn nhưsự xúc tác sinh học, sự cặp đôi miễn dịch hay sự nhận cảm hóa học

3.1.1 Enzym:

Chất xúc tác sinh học thường được sử dụng là enzym vì có sẵn trên thị trường,chẳng hạn như glucose oxidase (enzym oxy hóa glucose) và urease (Enzym thủy phânure) Các enzym này được thu nhận từ nhiều nguồn sinh học khác nhau và được sửdụng một mình hay kết hợp với cofactor của chúng như NAD+ và NADP+

Sự sử dụng các enzym thương mại có nhiều thuận lợi chẳng hạn như khả năngsản xuất hàng loạt với những đặc điểm, thời gian sống biết trước và sẵn có Vì vậy cácenzym thương mại đóng một vai trò quan trọng trong các Biosensor hiện đang có mặttrên thị trường Nhưng bên cạnh đó chúng có những bất lợi như ít bền và khi hoạt độngcần có cofactor kết hợp, đồng thời một enzym đơn lẻ thì không xúc tác hoàn toàn chomột chuỗi phản ứng, vì vậy trong biosensor thường kết hợp nhiều enzym với nhau theomột trình tự hợp lý để đảm bảo sự hoạt động tối ưu của Biosensor

3.1.2 Vi sinh vật:

Cơ thể vi sinh vật có đầy đủ các enzym và cofactor cần thiết trong một môitrường đã được tối ưu hóa Trong môi trường thích hợp, Vi sinh vật sẽ sản sinh và đềnbù bất cứ sự mất mát hoạt tính của Enzym theo thời gian

Có thể tận dụng các phần mô thực vật hay mô động vật làm nguồn nguyên liệucung cấp enzym vì chúng có khả năng gắn kết cao, có một cấu trúc đủ mạnh để gắnkết trực tiếp lên bộ biến năng mà không cần đến kỹ thuật cố định protein.

Mô thực vật – động vật :

Thực vật là nguồn enzym hữu dụng cho hóa học phân tích Bằng việc sử dụng bộbiến năng thích hợp, có thể chế tạo Biosensor có tính năng ổn định cao vì các enzymvẫn được duy trì hoạt tính trong mô thực vật Tương tự như vậy, mô động vật đượcxem như là một bộ thụ cảm sinh học hữu dụng cho sự phát hiện chọn lọc L-amionoacid mà không bị ảnh hưởng đáng kể bởi D-amino acid Để tăng khả năng chọn lọc cóthể kết hợp một chất kháng khuẩn để tránh sự nhiễm khuẩn, chẳng hạn như thêm0.02% NaOH vào điện cực glutamine

Bộ phận cơ quan :

Các xúc tác sinh học cũng được tìm thấy trong các cơ quan tế bào như lysosome,lục lạp, thể hạt và vi thể vì chúng chứa nhiều hệ thống enzym được dùng trongbiosensor Chẳng hạn như vi thể gan có hệ thống enzym monooxidase với cytochrome

P 450 xúc tác cho phản ứng oxy hoá nhiều acid béo, hormone steroids… Các cơ quantế bào được gắn trực tiếp lên bộ biến năng đo dòng điện trong thiết bị Biosensor

3.1.4 Tác nhân miễn dịch :

Kháng nguyên và kháng thể cũng được sử dụng làm bộ thụ cảm sinh học Tínhchọn lọc của Biosensor được quyết định bởi kháng thể và tính nhạy cảm được quyếtđịnh bởi enzym kết hợp Kháng thể được cố định vào bộ biến năng nhờ vào kỹ thuậtMiễn dịch học Enzym (EIA) Hoặc thay enzym bằng chất mang ion đóng vai trò nhưchất trung gian của các quá trình điện hóa miễn dịch Kháng nguyên thích hợp vớikháng thể được kết hợp với chất mang ion tạo ra sự tiếp hợp được phát hiện bởi bộbiến năng điện hóa

3.1.5 Bộ thụ cảm hóa học:

Màng tế bào cũng được sử dụng do khả năng kích thích hóa học gây ra sự thayđổi cấu tạo Các tế bào thần kinh cũng được dùng trong phát hiện thuốc, độc tố haycác chất khác

3.2. CHỌN LỰA BỘ BIẾN NĂNG:

Bộ biến năng Biosensor

Enzym Tế bào, visinh vật miễn dịchTác nhân Mô thực vật-động vật Bộ thụ cảmhóa họcTế

Chú thích: x: Đang nghiên cứu cơ bản

xx: Đã nghiên cứu và phát triển những mẫu đầu tiênxxx: Những thiết bị có mặt trên thị trường

Phụ thuộc vào kiểu phản ứng và từng ứng dụng cụ thể của Biosensor mà chọn bộ biếnnăng phù hợp

Nếu nó được dùng trong sinh học thì cần phải đáp ứng các tiêu chuẩn tương ứngnhư khả năng tách protein, lipid hay tế bào

Nếu nó được dùng trong invivo thì cần phải giảm kích thước tối thiểu và đòi hỏihình dạng của nó phải phù hợp để không phá huỷ mô thực vật-động vật, đồngthời cũng có khả năng loại bỏ độc tố, kim loại hoặc các thành phần đa phân tử

ra khỏi bộ biến năng

Vấn đề tác động hóa học cũng ảnh hưởng đến sự chọn lựa bộ biến năng Có thể kếthợp enzym urese vào các điện cực pH, pCO2, hay pNH3 Bộ biến năng tốt nhất choviệc xác định ure trong một mẫu sinh học là các điện cực pCO2, pNH3 bởi chúng cómột màng thẩm thấu để loại bỏ tất cả những ảnh hưởng của cation và anion

3.3 SỰ CỐ ĐỊNH THÀNH PHẦN SINH HỌC LÊN BỘ BIẾN NĂNG:

Làm cho enzym trong nhiều trường hợp bền hơn.

Tách phức enzym – chất mang ra khỏi mẫu dễ dàng

Hoạt độ enzym giữ được ổn định trong một thời gian dài

Tuy nhiên, việc sử dụng enzym cố định cũng có những hạn chế nhất định như:Sự chuyển khối bị hạn chế

Có thể mất hoạt tính khi cố định

Không có hiệu quả đối với cơ chất rắn

Mất tính thích nghi hình thể

Nhưng những hạn chế trên là không đáng kể so với những lợi ích mà enzym cố địnhmang lại Do vậy ngày càng có nhiều nghiên cứu mới cũng như các công nghệ mới đểcố định enzym

Người ta thường cố định các thành phần sinh học lên một chất mang rắn bằngnhiều cách Trong kỹ thuật cố định, cần đảm bảo những yêu cầu nhất định, nhất là khicác điện cực sinh học (biosensor) được đưa vào sử dụng trong thực tế:

Các cấu tử sinh học phải giữ được hoạt độ khi gắn trên bề mặt biosensor

Màng sinh học phải được gắn chặt với bề mặt cảm biến và vẫn giữ được cấutrúc và chức năng

Màng sinh học đã được cố định phải ổn định và bền trong một thời gian dài.Vật liệu sinh học cần có tính đặc trưng riêng đối với từng cấu tử sinh học

Để cố định các thành phần sinh học trong Biosensor, người ta thường sử dụng cáckỹ thuật như hấp thụ vật lý, bao gói trong khuôn gel hoặc trong polymer, liên kết đồnghóa trị với chất mang và liên kết chéo các protein

3.3.1 Sự cố định Enzym:

a Sự cố định bằng hấp thụ vật lý:

Điện cực Enzym đầu tiên được chế tạo bởi Updike và Hicks bằng cách cố địnhEnzym Glucose oxidase trong một lớp gel polyacrylamide, sau đó Enzym này đượcgắn lên màng Plastic của điện cực oxy Hoặc có thể cố định một enzym lên một thànhphần nhạy cảm của một điện cực bằng màng thẩm thấu ngăn cản sự khuếch tánprotein Guibault và Shu đã chế tạo một điện cực enzym nhạy cảm với ure bằng cáchtrải một dung dịch huyền phù của enzym urease lên bề mặt của điện cực có màngnilon và bao bọc khít hoàn toàn bằng màng thẩm thấu, sau đó điện cực enzym nàyđược rửa sạch với nước và sẵn sàng để sử dụng

Nguyên tắc của phương pháp hấp phụ vật lý như sau:

Hấp phụ enzym lên chất mang nhờ lực tương tác yếu giữa chất mang và proteinnhư lực Valderwaalls, liên kết hydro và liên kết kỵ nước Khi chất mang khôngcó lỗ xốp, enzym bám trên bề mặt chất mang Khi chất mang có lỗ xốp, enzymchui vào trong các lỗ xốp của chất mang

Nếu chất mang có chứa điện tích, liên kết giữa chất mang và enzym là liên kếtion (Liên kết này bền hơn so với hấp phụ)

Chất mang hữu cơ: than hoạt tính, cellulose, tinh bột, dextran, collagen,albumin, agarose, chitin.

Chất mang vô cơ: silic, thủy tinh xốp, oxide của kim loại

Chất trao đổi ion: amberlit, DEAE – sephadex CM – sephadex, DEAE –celllulose, CM – cellulose

Polymer tổng hợp: polyamide, polyacrylamide, polystyrol, nilon, polyvinyl.Phương pháp điều chế: Cho enzym và chất mang tiếp xúc với nhau (khuấy trộn), sauđó rửa để loại bỏ những phân tử bị gắn yếu lên chất mang

Các yếu tố ảnh hưởng đến lượng enzym cố định được và độ bền của liên kết cố định:

Nồng độ protein enzym: lượng enzym cố định lên chất mang thường tỷ lệ thuậnvới nồng độ của nó ở một giới hạn nhất định

pH: pH môi trường phụ thuộc vào số lượng và bản chất của các nhóm tích điện

ở chất mang cũng như ở protein enzym Sự thay đổi pH thường ảnh hưởng lớnđến lượng enzym cố định được bằng liên kết ion Đồng thời sự thay đổi pH độtngột thường dẫn đến sự nhả hấp phụ của enzym

Lực ion của môi trường: sự có mặt của các muối tích điện trái dấu với chấtmang có thể kéo theo sự kết tủa cục bộ của protein trong dung dịch Tuy nhiên,sự có mặt của muối cũng có thể làm tăng độ hòa tan của protein do đó ảnhhưởng xấu đến hiệu quả cố định

Nhiệt độ: nhiệt độ tăng làm duỗi mạch protein enzym, do đó làm tăng liên kếtprotein enzym với chất mang, nhưng cũng làm mất hoạt tính của enzym

Khối lượng phân tử và bản chất của chất mang: enzym có khối lượng phân tửcàng nhỏ thì hấp phụ càng cao Những chất mang có chứa nhiều nhóm háo nướchấp phụ tốt hơn và bền hơn

Tuy nhiên sự cố định vật lý ngày nay ít được sử dụng do sự có mặt của enzymtrong dung dịch không giữ được hoạt tính trong thời gian dài Do đó sự cố định hóa

b Sự cố định bằng liên kết ngang (cross – linking immobilization):

Sự tạo liên kết ngang là quá trình sử dụng một tác nhân đa chức để tạo cầu nốigiữa các nhóm xúc tác sinh học khác nhau hay protein khác nhau để tạo ra một hợpchất có trọng lượng phân tử lớn rất nhiều và không có tính hòa tan

Có thể tạo liên kết ngang các phân tử của cùng enzym hay cố kết hai hay nhiềuprotein với nhau (enzym với enzym hay enzym với protein hoặc nhiều enzym trênprotein mang chẳng hạn như albumin trong huyết thanh của bò (BSA) Ngay cả cơquan hay các tế bào cũng có thể kết dính được bằng việc tạo ra các liên kết ngang

Glutaraldehyde là tác nhân tạo liên kết ngang thường dùng Tác nhân có hainhóm chức aldehyde ở các đầu mạch này sẽ phản ứng với nhóm amine trên phân tửprotein hay enzym và tạo ra các hợp chất mang tính base:

Cũng có thể thay Glutaraldehyde bằng tác nhân hai chức khác nhưhexamethylene diisocyanate O=C=N-(CH2)6-N=C=O làm tác nhân tạo liên kết ngang.Có 4 phương pháp chính để cố định enzym bằng liên kết ngang:

Phương pháp ngâm (Immersion method)

Ứng dụng: Phương pháp ngâm này dùng để cố định enzym urease lên điện cực

thủy tinh hay điện cực pH-nhạy cảm với các cation hóa trị I

Nguyên tắc: Chuẩn bị dung dịch cố định: Lấy 600 đơn vị I.U enzym Urease hòa tan

trong 1ml đệm phosphate 0.02M, pH = 6.8 Thêm vào 1 ml dung dịch albumine huyếtthanh bò 17.5%, sau đó thêm 0.07 ml dung dịch glutaraldehyde 25% để thu được nồngđộ cuối cùng 0.8% Khuấy dung dịch trong 2 phút

điện cực nhẹ nhàng xung quanh trục của điện cực trong 15 phút để tạo một lớp dungdịch cố định đồng nhất Một vòng “O” được gắn khít vào để giữ cho màng enzym nàybám chặt lên bầu điện cực Sau đó rửa điện cực bằng nước cất, dung dịch glycine, vàcuối cùng bằng nước cất để tách rửa hay trung hòa tác nhân tạo liên kết ngang.

Hình 3.2: Nguyên tắc của phương pháp ngâm

Ưu điểm: Phương pháp thực hiện đơn giản, thích hợp cho việc cố định các

Enzym lên đa số các bộ biến năng, đặc biệt bộ biến năng nhỏ

Phương pháp kết hợp trực tiếp (Direct binding method):

Nguyên tắc: Nhỏ 10 l dung dịch chứa enzym lên trên đỉnh của một điện cực, sauđó nhỏ 10l dung dịch chứa tác nhân tạo liên kết glutaraldehyde

Phương pháp này cũng được dùng để cố định enzym lên màng kỵ nước của các điệncực cảm ứng khí như màng fluorocarbon hay polytetrafluoroethylene

Ưu điểm: Tiết kiệm enzym, dùng để cố định các enzym có giá thành cao.

Phương pháp sử dụng bình phun (Use of aerosol):

Nguyên tắc: đầu nhạy cảm của một điện cực được rửa và ngâm trong dung dịchenzym khoảng 20 phút để đảm bảo sự hấp thu enzym lên điện cực enzym Điện cựcnày sau đó được sấy khô ở 4oC và xoay Glutaraldehyde được bơm lên trên điện cực từmột khoảng cách đủ lớn để ngăn cản tạo giọt Sau khi tạo liên kết ngang, điện cựcenzym được rửa với nước, sẵn sàng cho việc sử dụng

Ưu điểm: bề dày lớp enzym cực kỳ mỏng (1-2m) và các biosensor tạo ra có

thời gian đáp ứng cực ngắn (5-10s)

Ứng dụng: Phương pháp này dùng để cố định enzym pennicilinase, urease và

acetylcholinesterase, cố định các protein lên nhiều chất mang

Hình 3.4: Phương pháp sử dụng bình phun

Các màng membrane tăng cường-gia cố (Re-inforced membranes): Enzym được cốđịnh lên một diện tích rộng của màng nylon bằng những dĩa nhỏ chứa membraneenzym có cùng mẻ và sự cố định giống nhau Sau đó các màng này được kẹp vàotrong bộ biến năng Màng membran tăng cường-gia cố này có phần sợi do đó cải thiệntính chất cơ học của màng enzym.

Các màng membrane gắn nhóm chức sẵn (Prefunctionalized membrane) dùng cácmàng membrane xốp sẵn có trên thị trường Những màng này có các nhóm chức liênkết có khả năng phản ứng với vị trí tự do của enzym Các màng này sau đó đem ngâmtrong dung dịch chứa enzym đã chọn để thu được một màng enzym với những tính chất

cơ học hữu dụng

3.1.3 Sự cố định cofactor:

Cofactor được cố định lên chất mang đồng thời cùng lúc với enzym bằng phương pháphấp thụ vật lý, hay bằng liên kết ngang

3.2 Cố định Vi sinh vật

Vi sinh vật có kích thước lớn hơn enzym do đó dễ dàng cố định bằng phương pháp vậtlý Chúng có thể được cố định bằng gel agar hay polyacrylamide hoặc màng thẩmthấu và màng lọc membrane như millipore 0.22 m – chế tạo từ ester cellulosic Toànbộ tế bào vi sinh vật được cố định trong huyền phù collagen đã được xử lý bởiglutaraldehyde Màng collagen cũng được sử dụng như một chất mang vật lý

Màng kỵ nước và vi sinh vật có thể được gắn đồng thời lên các điện cực khuếchtán khí chẳng hạn như điện cực pNH3, pO2, pCO2 Vi sinh vật được nhốt trong các lỗmàng lọc cellulose acetate, sau đó rửa các tế bào vi sinh vật tự do trên bề mặt và đặtmàng vi sinh vật trên vào điện cực dùng màng thẩm thấu và ngâm trong dung dịchđệm để loại bỏ các thành phần dinh dưỡng ảnh hưởng tới phép đo Các điện cực visinh vật được bảo quản ở nhiệt độ 40C trong dung dịch đệm phosphate

Cũng có thể cố định một enzym và một tế bào vi sinh vật lên cùng bộ biếnnăng Vi sinh vât được cố định bằng phương pháp vật lý và enzym được cố định bằngphương pháp liên kết đồng hóa trị để tránh sự nhả protein

Vi khuẩn acetic thuộc loài Acetobacter xylinum có khả năng tạo ra màng mỏng

trong môi trường tĩnh sau khi xử lý với glutaraldehyde và có những tính chất cơ họcnhất định thì có thể cố định trực tiếp vào điện cực Oxy mà không cần dùng màng thẩmthấu

3.3.2 Cố định các tác nhân miễn dịch:

Nhiều điện cực miễn dịch được tạo ra bằng các cố định các tác nhân miễn dịch lên cácbộ biến năng khác nhau

a) Cố định kháng thể (Immobillization of antibodies):

Mục đích: Để phát hiện ra kháng nguyên tương ứng tạo ra kháng thể Do kháng thể cócấu trúc là protein nên phương pháp cố định kháng thể tương tự như phương pháp cốđịnh enzym: dùng phương pháp cố định trực tiếp hay sử dụng màng membrane

Cố định trực tiếp lên bộ biến năng:

Các kháng thể có thể được gắn lên một điện cực carbon bằng liên kết cộng hóa trị.Các nhóm COOH được tạo ra trên điện cực carbon bằng phản ứng điện hóa trong môitrường acid nitric HNO3 và kali bicromat K2Cr2O7 và gắn với kháng thể bằng một tácnhân tạo liên kết ngang như carbodiimide