Hướng dẫn phê duyệt phương pháp phân tích vi sinh docx

PHạM VI ĐÁNH GIÁ PHƯƠNG PHÁP TIÊU CHUẩNPhương pháp định lượng:  Độ lặp lại Repeatability: S r  Được thực hiện trên cùng mẫu, lặp lại n lần bởi một KNV và cùng một điều kiện: môi trường

PHÊ DUYệT PHƯƠNG PHÁP

PHÂN TÍCH VI SINH

TS Nguyễn Tiến Dũng

KHÁI NIệM Về PHƯƠNG PHƯƠNG PHÁP

 Phương pháp tiêu chuẩn:

Phương pháp do các tổ chức quốc tế, hiệp hội, các tổ chức có uy tín (AOAC ISO,

NMKL, ) công bố và đã được phê duyệt, (được hiểu là các phương pháp của một tổ chức từ 2 quốc gia trở lên)

Các tiêu chuẩn, quy chuẩn quốc gia do các

Bộ, Ngành công bố, bao gồm cả nước nhập khẩu (TCVN, FDA…)

Phương pháp tiêu chuẩn nội bộ được phê duyệt trong hệ thống Cục QLCL NLS&TS.

KHÁI NIệM Về PHƯƠNG PHƯƠNG PHÁP

Phương pháp không tiêu chuẩn

Phương pháp mới do phòng kiểm nghiệm tự

nghiên cứu xây dựng và đưa vào áp dụng.

Phương pháp được công bố trên các tạp chí, tài liệu khoa học, hoặc nhà sản xuất chưa được

chuẩn hoá bởi tổ chức nào.

Phương pháp có sửa đổi từ phương pháp tiêu chuẩn mà phần sửa đổi có thể ảnh hưởng trực tiếp đến kết quả kiểm nghiệm hoặc làm thay

đổ i bản chất phương pháp gốc.

PHạM VI ĐÁNH GIÁ PHƯƠNG PHÁP TIÊU CHUẩN

Phương pháp định lượng:

 Độ lặp lại (Repeatability): S r

 Được thực hiện trên cùng mẫu, lặp lại n lần bởi một KNV và cùng một điều kiện: môi trường, nhiệt độ, thời gian nuôi cấy …

 Độ tái lập (Reproducibility): S R

 Được thực hiện n mẫu, mỗi mẫu được thực hiện phân tích ít nhất 2 lần lặp lại trên cùng một mẫu Các mẫu được thực hiện tại các thời gian khác nhau, trong các

đ iều kiện khác nhau: môi trường, thiết bị

 Độ đúng (trueness): kết quả phân tích so với mẫu chuẩn

 Độ không đảm bảo đo

PHạM VI ĐÁNH GIÁ PHƯƠNG PHÁP TIÊU CHUẩN

 Giới hạn phát hiện (LOD50):

 Là mật độ vi sinh vật trong 01 đơn vị mẫu phân tích mà tại đó có 50% số mẫu gây

nhiễm được phát hiện

PHạM VI ĐÁNH GIÁ PHƯƠNG PHÁP KHÔNG TIÊU CHUẩN

PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐịNH CÁC

THÔNG Số Kỹ THUậT CủA

PHƯƠNG PHÁP

PHƯƠNG PHÁP ĐịNH LƯợNG

 Khái niệm

Độ chính xác của một phương pháp phân tích là mức độ thống nhất của các kết quả thử riêng biệt khi quy trình thử nghiệm được áp dụng lập đi lập lại trên cùng một mẫu nhỏ lấy từ cùng một mẫu đồng nhất

Độ ĐÚNG (TRUENESS)

 Khái niệm

Độ đúng của một phương pháp phân tích là mức

độ sát gần của các giá trị tìm thấy so với giá trị thực

Độ đúng: được biểu diễn bằng 2 giá trị:

Độ ĐÚNG (TRUENESS)

Nếu có mẫu chuẩn hoặc mẫu gây nhiễm:

 độ đú ng PTN và độ đúng của phương pháp được tự

tích hợp và được biểu diễn bằng % độ lệch giữa giá trị của mẫu chuẩn và trung bình kết quả thu được

từ PTN khi phân tích bằng phương pháp của PTN.

Không có mẫu chuẩn:

 chỉ xác định được độ đúng của phương pháp do chính PTN xây dựng so với phương pháp tiêu chuẩn khi áp dụng tại PTN đó

% 100

Ts

XÁC ĐịNH Độ CHụM

 Tùy theo mục đích và qui mô đánh giá sẽ có các cách bố trí thí nghiệm khác nhau

Đánh giá độ chụm của phương pháp tại 1 PTN

 Độ lặp lại: được thực hiện trên 1 mẫu, tại cùng 1 KNV,

trong cùng 1 điều kiện

 Độ tái lập: được thực hiện trên các mẫu, bởi các KNV

khác nhau (cùng thực hiện 1 mẫu); các mẫu khác nhau được thực hiện trong các điều kiện khác nhau

2 2

)

( 1

1

x

x n



2 2

)

( 2

1

i i

n

Độ chọn lọc dương: khả năng phát hiện nhiều

nhất trong số các đối tượng mục tiêu

 Độ chọn lọc âm: mức độ can thiệp của các đối

tượng khác với VSV mục tiêu vào qui trình phân tích

CÁCH THựC HIệN

nuôi cấy thuần khiết

thế)

Thực hiện 1 lần với phương pháp tham chiếu

nuôi cấy

BảNG GHI NHậN KếT QUả Độ CHọN LọC

Chủng thử nghiệm Biểu hiện khuẩn lạc

khi thực hiện với pp tham chiếu

Biểu hiện khuẩn lạc khi thực hiện với pp thay thế

DIễN GIảI VÀ ÁP DụNG KếT QUả

 Sử dụng kết quả đánh giá để bổ sung vào các bước của phương pháp

 Lựa chọn khuẩn lạc đặc trưng

 Giới hạn đếm

 Khẳng định sinh hóa

 Các lưu ý có thể có liên quan đến sự ổn định của kết quả

GIớI HạN PHÁT HIệN (LOD) VÀ GIớI

HạN ĐịNH LƯợNG (LOQ)– PP ĐịNH

LƯợNG

 Mức tới hạn (Critical level – LC)

là mật độ VSV mục tiêu thấp nhất mà pp có thể phát hiện được (không cho giá trị định lượng chính xác)

 Tại giá trị này khả năng phát hiện chính xác là β~50%

là mật độ VSV trong 1 đơn vị mẫu mà tại đó khả năng phát hiện của phương pháp là 1- β (50% đến 95%)

LOD = Xo + 3.3 So

 X 0 : kết quả trung bình phân tích lặp lại nhiều lần từ mẫu trắng

 S o : độ lệch chuẩn của mẫu trắng (mẫu có mật độ gây nhiễm thấp)

GIớI HạN PHÁT HIệN (LOD) VÀ GIớI HạN ĐịNH LƯợNG (LOQ)– PP ĐịNH

LƯợNG

 Giới hạn định lượng:

 là mật độ vi sinh vật thấp nhất trong đơn vị mẫu mà phương pháp cho phép định lượng có

độ chính xác đạt yêu cầu của PTN

Thông thường LOQ được xác định bằng công thức tương ứng với hệ số biến động CV ≤ 10%

LOQ = Xo + 10 So

CÁCH XÁC ĐịNH CÁC THÔNG Số

LC, LOD, LOQ

 Xác định gián tiếp

Phân tích lặp lại nhiều trên mẫu trắng để xác định So

Lặp lại ít nhất là 6 lần, thông thường là 10 lần/ đối

Tính độ lệch chuẩn So từ các kết quả nhận được

Tính Xo: nếu thực hiện song song với pp tham chiếu

khác

(X o là kết quả trung bình nhiều lần lặp lại bằng PP tham chiếu)

CÁCH XÁC ĐịNH CÁC THÔNG Số

LC, LOD, LOQ

 Xác định trực tiếp

 Thực hiện phân tích với các mật độ khác nhau: 3, 10, 30,

100 … CFU/đơn vị mẫu Mỗi nồng độ nhiễm lặp lại 6 lần.

 Xác định mật độ nhiễm có tỉ lệ phát hiện khoảng 50%/đơn

ĐỘ TUYẾN TÍNH

Là khả năng của phương pháp khi phân tích trên một nền mẫu biết trước cho kết quả phù hợp với giá trị hiện diện trong mẫu, khi gia tăng hàm lượng đối tượng phân tích thì gia tăng kết quả một cách tương ứng

Là khả năng suy đoán kết quả phù hợp với hàm lượng vi sinh vật hiện diện trong mẫu trong qua các độ pha loãng khác nhau

PHƯƠNG TRÌNH TUYếN TÍNH

hồi qui tuyến tính

trong đó

Y: kết quả suy đoán X: Giá trị biết trước m: hệ số tuyến tính (giá trị mong muốn =1) b: Độ lệch gốc (giá trị mong muốn = 0)

Đồ THị BIểU DIễN MốI TƯƠNG

QUAN GIữA CÁC ĐạI LƯợNG

Phương pháp tham chiếu

XÁC ĐịNH Độ TUYếN TÍNH

CủA PHƯƠNG PHÁP

Pha loãng với các nồng độ khác nhau

Phân tích bằng phương pháp xác định

So sánh với giá trị biết trước trong mẫu

Tính toán mức độ hồi qui tuyến tính

Ưu điểm: dể dàng xác định được giá trị biết trước

 Nhược điểm:

 Không đại diện cho tất cả các loại mẫu

 Không xác định được sự ảnh hưởng của nền mẫu lên kết quả phân tích

XÁC ĐịNH Độ TUYếN TÍNH CủA

PHƯƠNG PHÁP

chiếu

 Chọn các mẫu có mật độ VSV mục tiêu khác nhau

 Có thể chọn mẫu nhiễm tự nhiên hay mẫu gây nhiễm (Ưu tiên lực chọn mẫu gây nhiễm tự nhiên)

 Thực hiện đồng thời giữa phương pháp tham chiếu

THIếT LậP QUI TRÌNH XÁC ĐịNH Độ

TUYếN TÍNH

 Đối với mỗiloại mẫu

 Xác định với các mật độ khác nhau bao phủ tất cả các khoảng mật độ VSV đích có thể hiện diện trong mẫu

 Thông thường lựa chọn ít nhất 5 khoảng mật độ để so sánh

LựA CHọN MẫU Để ĐÁNH GIÁ

Độ TUYếN TÍNH CủA

PHƯƠNG PHÁP

 Phương pháp áp dụng cho tất cả các loại thực

phẩm: chọn 5 loại mẫu (Annex B, ISO

16140:2003)

 Có thể sử dụng <5 loại mẫu theo mục đích đánh giá của PTN

NGUYÊN TắC CHUNG

Biểu diễn sự biến thiên của kết quả phương pháp thay thế theo kết quả phương pháp tham chiếu - hàm y(x)

LựA CHọN HÀM TUYếN TÍNH

 Gọi

 S r (x): độ lặp lại của phương pháp tham chiếu

 S r (y): độ lặp lại cửa phương pháp thay thế

) (

)

(

x Sr

½<R<2: tính theo hàm hồi qui tuyến tính thông thường

(Ordynary least–squares linear regression - OLS)

CÁC KÝ HIệU TRONG CÔNG

THứC TÍNH

 i: Mật độ vi sinh vật trong mẫu (i=1q)

 q: số lượng mức độ gây nhiễm(thường q = 5)

 j: lần lặp lại với một mức độ lây nhiễm i (j = 1 n)

 n: số lần lặp lại ứng với một mức độ lây nhiễm I (thường n=5)

 N: tổng số mẫu đã thực hiện (N=qn)

CÁC CÔNG THứC TÍNH HồI QUI TUYếN TÍNH THÔNG THƯờNG

y

y N

Vy

CÁC CÔNG THứC TÍNH HồI QUI TUYếN TÍNH THÔNG THƯờNG

(OLS)

y x

xyV V

V r

.

) (

)

( 1

i

xy x x y y

N V

Hàm trong Excel

Tính r: dùng hàm CORREL({x};{y}) Tính Vxy: dùng hàm COVAR({x};{y})

CÁC CÔNG THứC TÍNH HồI QUI TUYếN TÍNH THÔNG THƯờNG

(OLS)

x

y x

xy

S

S r V

V

ax y

CÁC CÔNG THứC TÍNH HồI QUI TUYếN TÍNH THÔNG THƯờNG

N k

k k

x

K=1 N; N=qn

Hàm trong Excel Tính Sy:x: dùng hàm STEYX({y};{x})

GIÁ TRị TớI HạN CủA Hệ Số GÓC A

 Độ lệch chuẩn của hệ số góc

x

x

y a

V N

S S

) 1 (

GIÁ TRị TớI HạN CủA - Hệ Số

LệCH GốC B

 Độ lệch chuẩn của hệ số góc

x

x y b

V N

x N

S

S

)1(

MứC CHấP NHậN

 Giá trị chấp nhận của hệ số góc a và độ lệch gốc b

 p(t)≤p(a-1)=p(0) hoặc p(t)≤p(b)=p(0)

 p(0) tương ứng với giá trị tới hạn 0,05 (tương đương độ chính xác 95%) và bặc tự do ứng với từng thí nghiệm

 Tóm lại:

0,95 ≤ a ≤ 1,05 0,95 ≤ b ≤ 1,05

MứC CHấP NHậN

 Giá trị chấp nhận của hệ số lack-of-fit (F)

2

) 1 (

) /

S

N

Với vnum=q-2; vden= q(n-1)

Tra bảng Snedecor F-table, p(F,vnum,vden)

Chỉ số chấp nhận p(F)≤0,05

Hàm trong Excel Tính p(t): dùng hàm FDIST(F;df1;df2;tails)

trong đó: df1=q-2; df2 = q(n-1)

tails=2 (hệ số mở rộng)

PHƯƠNG PHÁP ĐịNH TÍNH

 Cách thực hiện (xác định LOD50 cho mẫu 25g)

Chuẩn bị 50 mẫu trắng mỗi mẫu 25g

Chuẩn bị một dãy nhị phân chủng chuẩn mà tại

nồng độ đầu có mật độ khoảng 25CFU/ml (20, 2-1, 2

CÔNG THứC TÍNH LOD50 - PP ĐịNH TÍNH

 LOD 50: Giới hạn phát hiện của phương pháp

 L: Log của số lượng tế bào được spike vào thấp nhất mà tại đó 100%

phép thử cho kết quả dương tính.

 d: Hệ số của nồng độ pha loãng

 P i: Tỉ lệ phản ứng dương tính (50%  Pi 100%) đối với nồng độ pha loãng thứ i

 Um : Ước lượng sai số của m

Um= d2(Pi(1- Pi)/(n-1))

 n: Số lần lặp lại đối với nồng độ pha loãng thứ i

Độ ĐặC HIệU – PHƯƠNG PHÁP ĐịNH

TÍNH

 Định nghĩa

 Độ đặc hiệu là khả năng của phương pháp thay

thế cho kết quả phân tích âm tính ở những mẫu

mà phương pháp tham chiếu cũng cho kết quả âm tính

 Là khả năng phát hiện những mẫu âm tính trong

số những mẫu âm tính thật

 Ý nghĩa

 Đánh giá khả năng chuyên biệt của phương pháp

lên đối tượng phân tích.

 Khả năng không bị nhiễu bởi nền mẫu của phương

pháp

ĐỘ CHÍNH XÁC TƯƠNG ĐỐI (RELATIVE ACCURACY)

ĐỘ NHẠY TƯƠNG ĐỐI (RELATIVE

SENTIVITY)

 Định nghĩa nh ngh a: ĩa

thể phát hiện được so với phương pháp

tham chiếu

 Ý nghĩa:

tiêu của phương pháp

 Chọn ít nhất 30 mẫu cho mỗi loại thực phẩm,

phân tích bằng cả hai phương pháp để có ít nhất

60 kết quả

 Tốt nhất nên chọn mẫu tự nhiên

 Mẫu gây nhiễm: điều chỉnh mật độ VSV mục tiêu

để có một số ít mẫu cho kết quả dương tính với 1 trong 2 phương pháp

CÁC BƯớC XÁC ĐịNH Độ ĐặC

HIệU

 Thực hiện phân tích với 2 phương pháp tham

chiếu và PP mới

 Có ít nhất 60 kết phân tích cho một loại thực

phẩm với cả 2 phương pháp, trong đó kết quả âm tính và dương tính tương đương khoảng 50% cho mỗi phương pháp

PP tham chiếu(+) PP tham chiếu(-)

%100

PP tham chiếu(+) PP tham chiếu(-)

% 100







ND PA

PA SE

ĐỘ NHẠY–PP ĐỊNH TÍNH

Độ nhạy (SE)

Giới hạn cho phép: SP ≥ 98% (MMC- Canada)

PP tham chiếu(+) PP tham chiếu(-)

% 100

ĐỘ CHÍNH XÁC–PP ĐỊNH TÍNH

Độ chính xác (AC)

Giới hạn cho phép: AC ≥ 94% (MMC- Canada)

n = PA + NA + ND + PD

Độ CHọN LọC - PP ĐịNH TÍNH

 Độ chọn lọc bao gồm: độ chọn lọc dương và

độ chọn lọc âm

Độ chọn lọc dương: khả năng phương pháp

phát hiện các VSV mục tiêu trong số các VSV mục tiêu

Độ chọn lọc âm: là tỉ lệ phát hiện sai các vi

sinh vật không phải mục tiêu của phương pháp

XÁC ĐịNH Độ CHọN LọC – PP ĐịNH TÍNH

 Chủng vi sinh vật

Lựa chọn các chủng phong phú về nguồn gốc

Phải biết nguồn gốc của chủng

Các chủng được lựa chọn phải được xác định

đặc điểm sinh hóa, huyết thanh, di truyền …

CÁCH THựC HIệN

 Thực hiện với chủng thuần/dịch pha loãng chủng

 Mật độ VSV trong mỗi lần phân tích: 10-100 lần

PP tham chiếu PP thay thế

Chủng mục tiêu 1

…

Chủng khác 1

) (

%

100 )

(

) ( )

AR

AR

ER EX

AR: kết quả thực tế ER: kết quả mong đợi

) (

AR

ER IN

%

100)

(

)()

ER

AR ref

ER EX

Độ chọn lọc âm (PP tham chiếu) (EXRef)

ER IN

%

100)

(

)()

ER

AR

ER EX

Độ chọn lọc âm (PP thay thế) (EXAlt)

CHỉ TIÊU CHấP NHậN-PP ĐịNH TÍNH

 Độ chọn lọc tương đối

Độ chọn lọc dương: IN ≥ 98%

Độ chọn lọc âm: EX ≤ 10%

(Theo MMC Canada)