Phương pháp phân tích vi sinh vật part 8 ppt

Khi mẫu được cho vào giếng, nếu có sự hiện diện của vi sinh vật mục tiêu, kháng nguyên tiên mao của vi sinh vật sẽ tạo phức hợp với kháng thể cố định trên giếng và kháng thể tự do có gắn

„ ta

Để biết mật độ của vi sinh vật, so sánh trị số ánh sáng đo được với một đường chuẩn tương quan giữa lượng ánh sáng phát ra và mật độ tế

bào vi sinh vật đã được biết trước

2 PHƯƠNG PHÁP ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) Những tiến bộ kỹ thuật trong vài thập niên vừa qua thúc đẩy sự phát triển của nhiều kỹ thuật chẩn đoán huyết thanh nhanh nhạy, chính

xác các bệnh truyền nhiễm Mặt khác, sự phát triển của những kỹ thuật

tự động cho phép đơn giản hóa các thao tác thực hiện Nguyên tắc của phương pháp miễn dịch là phản ứng kết hợp giữa một tế bào (kháng nguyên) với một kháng thể đặc hiệu Tín hiệu của phản ứng miễn dịch có thể nhận biết thông qua sự ngưng tủa hay kết dính của kháng nguyên — kháng thể hoặc bằng cách sử dụng những kháng thể đã được đánh dấu (bằng chất nhuộm phát huỳnh quang, đồng vị phóng xạ hay enzyme)

Trong số các phương pháp phân tích miễn dịch, phương pháp hấp phụ miễn dịch dùng enzyme (enzyme-linked immunosorbent assay — ELISA hay enzyme immunosorbent assay — EIA) được quan tâm nhiều do

có tính đơn giản và hiệu quả cao Phương pháp này có thể được sử dụng

cho hâu hết các loại kháng nguyên với độ nhạy và độ đặc hiệu cao

Nguyên tắc kỹ thuật ELISA là sử dụng kháng thể đơn dòng phủ bên ngoài những đĩa giếng (microplate) Nếu có sự hiện diện của kháng

nguyên mục tiêu trong mẫu, kháng nguyên này sẽ được giữ lại trên bể

mặt giếng Các kháng nguyên này sẽ được phát hiện bằng cách sử dụng

kháng thể thứ cấp có gắn với enzyme như horseradish peroxidase hay

alkaline phosphatase Khi bổ sung một cơ chất đặc hiệu của enzyme vào giếng, enzyme xúc tác phản ứng thủy phân cơ chất để tạo ra các sản

phẩm có màu hay phát sáng Bằng cách theo dõi sự đổi màu, có thể phát

hiện sự hiện diện và định lượng lượng kháng nguyên (Hình 6.3.)

Cơ chất

Khang thé

enzyme đánh dấu Ñ “Sandwich” Tạo màu

Hình 6.3 Nguyên tắc phản ting ELISA

169

ELISA đã được sử dụng rộng rãi dưới dạng các bộ hóa chat (kit) thương mại (phát hiện Sœửmonelia, E coli gây bệnh, Listeria, độc tố

Staphylococcus, thuốc trừ sâu ) và có thể được cái tiến để tự động hóa ELISA có thể sử dụng phát hiện và định lượng vi sinh trong thực phẩm

trong thời gian vài giờ sau khi tăng sinh Kỹ thuật này có độ nhạy

phát hiện khoảng 10#CFU/ml (một số báo cáo cho rằng giới hạn này có

thể đạt được 10) Tuy nhiên trong phương pháp này vẫn cần thực hiện bước tăng sinh và tăng sinh chọn lọc trước khi thực hiện các phản ứng miễn dịch

Transia Sœnonella (Difhamb AB, Sweden) là một bộ kit phát hién nhanh Salmonella spp dua trén nguyén tée ELISA sandwich Khi mẫu được cho vào giếng, nếu có sự hiện diện của vi sinh vật mục tiêu,

kháng nguyên tiên mao của vi sinh vật sẽ tạo phức hợp với kháng thể cố

định trên giếng và kháng thể tự do có gắn enzyme peroxidase tạo thành

một phức hợp kép (sandwich) Sau đó, các kháng thể gắn enzyme ở dạng

tự do không tạo phức hợp sandwich sẽ bị rửa khỏi phản ứng Phức hợp

sandwich được phát hiện nhờ sự bổ sung cơ chất cia phan ứng (ure

peroxide và tetramethylbenzidine) Enzyme peroxidase sẽ thủy phân cơ

chất tạo sản phẩm có màu xanh dương Phản ứng được kết thúc bằng

cách bất hoạt enzyme bằng dung địch kết thúc làm acid hóa môi trường

và chuyển màu xanh thành màu vàng Sự hình thành màu vàng chứng minh sự hiện diện của kháng nguyên mục tiêu hay sự hiện điện của vi

sinh vật mục tiêu và mật độ của vi sinh vật có thể được xác định bằng

cách đo cường độ màu bằng máy so màu

Một ví dụ khác về sản phẩm ELISA thương mại là quy trình phát hiện độc tố đường ruột và định danh độc tốế (loại A đến E) của

Staphylococci trong thuc phẩm, Quy trình này có thời gian ngắn (4 giờ),

nhạy (lng/ml hay mg) và có thế phát hiện đồng thời sự hiện diện của

nhiều loại độc tố của Sfaplyloeoeeus (nhưng không thể phân biệt các loại

độc tố) Phản ứng ELISA được thực hiện dựa trên kỹ thuật “sandwich”

Bộ kit nay c6 tén thuong mai 1a TECRA™ (TECRA Diagnostic, Roseville,

2069, Australia, Hình 6.4.), là sản phẩm đầu tiên được chứng nhận bởi AOAC

170

ese

we

Hinh 6.4 BO hoa chất TECRA'M

3 PHUONG PHAP LAI PHAN TU (Hybridization)

Từ những năm 1980, nhiều nghiên cứu được tiến hành nhằm ứng

dụng các thành tựu của kỹ thuật di truyền, sinh học phân tử vào lĩnh vực

thực phẩm Hiện nay, nhiều hệ thống đã được thiết lập dựa trên DNA

để định lượng vi sinh vật và độc tố Tuy nhiên, chỉ có phương pháp lai phân tử (hay còn được gọi là phương pháp mẫu dò, probes), phương pháp PCR (polymerase chain reaction) là được thương mại hóa dưới dạng các bộ kit phát hiện vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm (Bảng 6.2) Phương

pháp sử dụng mẫu dò để phát hiện vi sinh vật trong thực phẩm được dựa

trên sự phát hiện một đoạn gen đặc trưng của vi sinh vật Cơ sở của việc

sử dụng mẫu đò là quá trình lai phân tử Quá trình này bao gồm sự tách

rời hai mạch đôi của chuỗi xoắn kép DNA khi nhiệt độ vượt quá nhiệt độ nóng chảy (T„) của phân tử DNA và sự tái bắt cặp giữa các đoạn DNA có trình tự nueleotide bổ sưng khi nhiệt độ trở lại bình thường Một trong hai mạch DNA bổ sung (gọi là DNA mục tiêu là DNA của tế bào

vi sinh vật) được cố định trên một giá thể rắn hoặc nằm ngay trên tế bào

hay mô Sự lai phân tử xảy ra khi đoạn mồi có trình tự nueleotide bổ sung

với một vùng trình tự trên DNA mục tiêu gặp nhau do chuyển động nhiệt

và khi nhiệt độ môi trường thấp hơn T„ ít nhất vài độ Sự lai phân tử

còn có thể xảy ra giữa DNA và RNA Quá trình lai phân tử chịu ảnh hưởng rất nhiều bởi các yếu tố: nồng độ DNA trong môi trường, nhiệt

độ và thời gian phản ứng, kích thước các trình tự lai và lực ion -của

môi trường

171

Một ví dụ về hệ thống phát hiện bằng mẫu dò là hệ thống Gen-trak

(Framingham, USA) (Hình 6.5) Hệ thống này sử dụng que thử với mẫu

dò để phát hiện 1/séeria trong mẫu bơ sữa và mẫu môi trường Mẫu dò là những đoạn oligomer DNA đánh dấu bằng hóa chất phát quang Quy

trình phân tích có thể được chia thành 6 bước: (1) phá vỡ tế bào thu nhận

rRNA; (2) mau dd DNA c6 dudi oligodeoxyadenylic nucleotide (dA) va mẫu

dò phat hién (reporter probe) chtfa fluorescein isothiocyanate (F) 6 dau 5’

và 3' của phân tử được đặt vào phản ứng; (3) que thử được bao bọc bởi

polydeoxythymidine (dT) để gắn được với oligodA của mẫu dò; (4) que thử được đặt vào ống đo chứa mẫu dò phát hiện được đánh dấu bằng enzyme;

(ð) sau khi rửa loại phần enzyme thừa, que thử được đặt vào ống đo chứa

cơ chất tạo màu; (6) sau khi ủ để hiện màu, màu được phát hiện ở bước

sóng 450 nm

<tr

4

HRP

ject điển 1] xẻ

6

A

pi

Hinh 6.5 So d6 quy trinh phat hién Listeria với mẫu dò phát quang

172

ae 10

Bảng 6.2 MOT SO BO KIT THUONG MAI DUA TREN KY THUAT PHAN TiCH

NUCLEIC ACID DUNG TRONG PHAT HIỆN VI KHUAN GAY BENH

TRONG THUC PHAM*

| Déi tugng Tén thuong maij Phuong phap | Nha san xudt

Clostridium botulinum |Probelia PCR BioControl

Escherichia coli GENE-TRAK probe GENE-TRAK

Staphylococcus aureus | AccuProbe probe GEN-PROBE

Yersinia enterocolitica |GENE-TRAK probe GENE-TRAK

" Nguén trich din: Feng, P., App.I, FDA Bacteriological Analytical Manual, 8A ed

* Polymerase chain reaction

” Bacterial Ice Nucleation Diagnostics

“ Hệ thống được AOAC chính thức chấp nhận

4 PHUGNG PHAP PCR (Polymerase Chain Reaction)

Phuong phap PCR (Polymerase Chain Reaction) 14 mét phuong pháp

in vitro dé téng hop DNA dua trén khuôn là một trình tự đích DNA ban

đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp môi (primer) đặc hiệu cho đoạn DNA này Eÿ thuật này do Karl Mullis và cộng sự (Mỹ) phát minh vào năm 1985 Hiện nay, kỹ thuật này được sử dụng rộng rãi

để phát hiện, tạo ra các đột biến gen, chẩn đoán bệnh, phát hiện các

mầm bệnh vi sinh vật có trong thực phẩm

Tất cả các DNA polymerase đều cần những môi chuyên biệt để

tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn Mạch khuôn thường là

173

một trình tự DNA của gen (gọi là trình tự DNA mục tiêu) đặc trưng cho

loài vi sinh vật mục tiêu hoặc là gen quy định việc tổng hợp một loại

độc tố chuyên biệt của vi sinh vật này Mỗi là những đoạn DNA ngắn,

có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn và nhờ hoạt

động của ĐNA polymerase đoạn môi này được nối dài để hình thành

mạch mới Phương pháp PCR được hình thành dựa trên đặc tính này

của DNA polymerase Khi có sự hiện điện của hai mỗổi chuyên biệt bất

cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự DÑA trong phản ứng PCR, ở

điều kiện đảm bảo hoạt động của DNA polymerase, đoạn DNA nằm giữa

hai mỗổi sẽ được khuếch đại thành số lượng lớn bản sao đến mức có thể

thấy được sau khi nhuộm bằng ethidium bromiđe và có thể thu nhận

được đoạn DNA này cho các mục đích tái thao tác trên gen Như vậy, để

khuếch đại một trình tự DNA xác định, cần phải có những thông tìn tối

thiểu về trình tự của DNA, đặc biệt là trình tự base ở hai đầu đoạn

DNA đủ để tạo các môi bổ sung chuyên biệt Các môi này gồm một mồi

xuôi (sens primer) và một mổi ngược (antisens primer) so với chiểu

phiên mã của gen

Phan ứng PCR là gồm nhiều chu kỳ lặp lại nối tiếp nhau Mỗi chu kỳ

gồm ba bước (Hình 6.6) là:

— Bước 1 (bước biến tính, denaturation): trong mot dung dich phan img

bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA được

biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tạ của phân tử, thường là ở 94 - 95°C trong

vòng 30 - 60 giây Mạch đôi DNA tách ra thành dạng mạch đơn

— Bước 2 (bước lai, anealalion} trong bước này, nhiệt độ được hạ thấp

hơn T„ của các môi cho phép các mỗi bắt cặp với mạch khuôn Trong thực

nghiệm nhiệt độ này dao động trong khoảng 40 - 70°C, tùy thuộc Tạ của

các mỗi sử dụng và kéo dài từ 30 - 60 giây

— Bước 3 (bước tổng hợp, elongation): nhiệt độ được tăng lên đến 72°C

giúp cho DNA polymerase (vốn là polymerase chịu nhiệt) hoạt động tổng

hợp tốt nhất Thời gian của bước này tùy thuộc độ dài của trình tự DNA

cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút

Trong phản ứng PCR một chủ kỳ bao gềm ba bước trên sẽ được lặp

đi lặp lại nhiều lần, mỗi lần lại làm tăng gấp đôi lượng mẫu của lần

trước Đây là sự khuếch đại theo cấp số nhân Theo tính toán sau 30 đến

40 chu kỳ, sự khuếch đại sẽ cho ra khoảng 10Ê bản sao (Hình 6.7 và Đảng

6.3) Sau phản ứng PCR, các DNA được nhuộm bởi ethidium bromide và

có thể quan sát thấy thông qua việc điện di sản phẩm PCR trong gel

agarose và quan sát dưới tia UV (bước sóng 312 nm)

174

3%, v2; fo,

‘eg dc

Nhiệt độ (độ ©)

70 ; ; + — mẫu N N N ¿' Tổng hợp - : Ñ ` `

cặp

10 É

Thời gian (phú?)

Hình 6.6 Cac bude cla phan tng PCR Hiện nay có nhiều ứng dụng của phản ứng PCR trong các bộ kit thương mại dùng để phát hiện đặc hiệu các chủng vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm hoặc những loài khó nuôi cấy Một số ưu điểm chính của phương pháp PCR dùng trong phát hiện vi sinh vật gây bệnh là:

~ Thời gian cho kết quả nhanh;

- Có thể phát hiện được những vi sinh vật khó nuôi cấy Việc nuôi tăng sinh là đơn giản hơn và đôi khi không cần thiết;

- Hóa chất cần cho phản ting PCR đễ tìm và đễ tổn trữ hơn so với trường hợp huyết thanh học Không cần dụng cụ và môi trường chẩn đoán phức tạp, có thể thực hiện ở biện trường;

- Ít tốn kém về mặt nhân sự, có thể được tự động hóa để làm giám

chỉ phí phát hiện các vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm

Mặc dù vậy phương pháp PCR vẫn còn một số nhược điểm cần khắc

phục:

- Sự ức chế hoạt tính của Tøq DNA polymerase bởi thành phần của mẫu vật do mẫu thực phẩm thường có những thành phản phức tạp Tuy nhiên, việc chiết tách và tỉnh chế DNA từ thực phẩm hay môi trường

trước khi thực biện phương pháp PCR thường cho phép loại bỏ những hợp

chất ức chế

175

Chu ky 0

Trình tự cần khuếch đại

Chu kỳ 1

Biến tính và bắt cặp

o_O Tổng hựp

(trên mạch khuôn là DNA SSS need đoạn DNA mới

CARES ee Biến tính và bắt cặp

€YA“TLrrrtrtrrrrrrrnNNNNNESEO——⁄»⁄® Đoạn khuếch đại

"` bit SE OR ngắn - chiếm ưu thế)

Tổng hợp

(đoạn dài)

Chu ky 4 ip (hoặc hơn)

Hình 6.7 Sơ đồ phản ứng PCR

176

“ae %

- Mật độ vi sinh vật gây bệnh hiện diện trong mẫu thực phẩm thường thấp, nên trong đa số trường hợp cẩn có bước nuôi cấy làm giàu

để có được mật độ đủ để phát hiện bằng PCR;

- Phương pháp này không phân biệt được tế bào sống với tế bào

chết, do vậy có thể dẫn đến trường hợp dương tính giả do DNA từ tế bào

chết Ngược lại phương pháp này cho phép phát hiện bào tử, dạng tiêm sinh hay tế bào đã chết của các vi sinh vật gây bệnh hoặc gây ngộ độc

Bảng 6.3 MOT 86 UNG DUNG PCR PHAT HIEN VI SINH VẬT GÂY BỆNH

TRONG THỰC PHẨM TRÊN THẾ GIỚI

Thời gian

5 tang sinh

¬¬ | Gen Miu Ang sinh Độ nhạy

Vi sinh vật muc | uc © nấm | trước khi b hát bo

tiêu vo phả tách chiết | P#! tiện

; Ì Camphylobaeter løg | Dah 18 giờ, 12,5CFU véi “hia ver

| coli, C Jejuni, C nhiên và bị mật độ ý hiền

| lari rRNA | Buena gay nhiém 500CFU/B | 1w 1mOptyy điện của Escherichia coli

nhiệm, - Rau diếp bị - | thiết khi gây | thời điểm ngay

Shigella boydii, | Genial | TU SP na an

Sa t 8 gây nhiễm nhiễm ở mức | sau khi gây

flexneri va S

sonnei

| (tạo độc tố đường | Gen LT ây nhiễ 24 giờ sau khi gây

ruôt) Bay nhiem nhiém 3 CFU

i tobacill BS rRNA

! fae — , của vi | Bia đã khử Không tăng wee

i Mã ‘ khuẩn | trùng Pasteur | sinh, tach | 30CFU/ 250ml

Saccharomyces | oh acid | bi gay nhiém | chiét truc tiép

cerevisiase) :

lactic

Pho mai

monocytogenes hlyA xã lách, đùi hộ mai mềm ng

lợn muối,

! xúc xích,

10CPU/mẫu

ng Xúc xinh nấu | iy api vọi | đối với xúc

monocytogenes | C&R HA | chín và sữa | 5 áo Tộc | xích) hay 10 tế xú °

bị gây nhiễm 0 X06 XS" Í bào/ 10ml đối

với sữa)

Au thi

on ca Mẫu thịt tăng | 2 sCPU/ml

Salmonella one ave ` sữa; 2x10

thịt bò bị phát hiện typhimurium gây nhiềm een | CFU/ml thit

trực tiếp trên ỳ đồng nhất a a mẫu sữa

aureus tuột C„ | SÂY nhiễm đường | SA Bảy bị ” my, _ Khi | 105CEU/m) gây nhiễm

Thúy sản

G (hau, thit 10CFU/g hau;

Vibrio cholerae O, ctgaB cua), rau diếp, | 6-8giờ Ì †CFU/IQg rau

nhiễm

Gen độc

Vibrio vulnificus | tổ tế bào | Hầu bị gây lam tan | nhiễm 24 giờ 10°CFU/g hau

mau

Một giải pháp chung đối với các nhược điểm trên là kết hợp một

bước tăng sinh ngắn và một bước ly tâm loại bỏ thành phần môi trường

nuôi cấy và rửa tế bào trước khi tiến hành phần ứng PCR Việc phát hiện

các mắm bệnh vi sinh vật đơn lẻ trong thực phẩm bằng phương pháp

PCR thường gây tốn kém Do đó, các nhà nghiên cứu đang tìm cách làm

giảm chỉ phí pháp bằng cách sử dụng đồng thời nhiều cặp môi trong một

phản ứng PCR (gọi la phan tng multiplex PCR) dé có thể phát hiện đồng

thời nhiều vi sinh vật gây bệnh khác nhau

Tại Việt Nam đã có một số nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR

trong việc phát hiện vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm thực hiện

tại Trung tâm Khoa học và Công nghệ Sinh học và Phòng thí nghiệm

Công nghệ Sinh học Phân tử, Trường DH Khoa học tự nhiên, Đại học

Quốc gia TP HCM (Bảng 6.4) Dựa trên kết quả nghiên cứu trên một số

đốt tượng vi khuẩn gây bệnh, một quy trình chung cho việc phát hiện vi

khuẩn gây bệnh trong mẫu thực phẩm bằng phương pháp PCR được dé

nghị như sau:

178

et