phân loại vi sinh vật bằng sinh học phân tử (tt) pot

Kỹ thuật lai ADN đã được sử dụng rộng rãi cho các nghiên cứu xác định typ của nhiều đối tượng vi sinh vật.. không thể thực hiện được với nhiều loài vi sinh vật hay virút hoặc trong các t

2.3 Nhân gene và kỹ thuật giải trình tự ADN

Kỹ thuật lai ADN đã được sử dụng rộng rãi cho các nghiên cứu xác định typ của nhiều đối tượng vi sinh vật Nguồn ADN đích đôi khi chỉ có số lượng ít trừ khi các tiến

hành nuôi cấy vi sinh vật Trong

một số trường hợp việc nuôi cấy

không thể thực hiện được với nhiều loài vi sinh vật hay virút hoặc trong các trường hợp khác cần thời gian dài nuôi cấy vi sinh vật để có đủ

ADN cho các kỹ thuật lai hay định typ Khó khăn này được khắc phục bằng cách làm tăng nguồn ADN

đích một cách nhanh chóng bằng

kỹ thuật nhân gene PCR

a Kỹ thuật nhân gene

PCR (Polymerase Chain

Reaction)

Việc nhân ADN cho phép làm tăng số lượng gấp hàng triệu hoặc nhiều hơn nữa đối với đoạn ADN hay ARN nghiên cứu Có nhiều

phương pháp khác nhau để phân

tích nguồn ADN khuyếch đại theo cách này Phương pháp đơn giản

nhất là sử dụng điện di để xác định kích thước sản phẩm của phản ứng PCR Có thể xác định độ nhạy và tính đặc hiệu cao hơn nếu sản phẩm PCR được lai với mẫu dò đặc hiệu

đã được đánh dấu Phương pháp

đưa lại thông tin nhiều nhất là xác định được trình tự ADN và ARN của sản phẩm PCR Việc xác định được sai khác của chuỗi ADN sẽ

cho phép xác định và định typ

chính xác nhất các đối tượng vi

sinh vật nghiên cứu Kết quả xác

định trình tự ADN còn cho phép

xác định mối liên hệ tiến hoá và

dịch tễ học của các chủng vi sinh vật

- Đôi nét về phản ứng chuỗi PCR:

Phản ứng chuỗi PCR nhằm khuyếch đại ADN lần đầu tiên

được Saki (1985) giới thiệu và đây được coi là một trong những tiến

bộ khoa học quan trọng nhất về

sinh học trong thập kỷ 80 Phản

ứng PCR sử dụng enzym chịu nhiệt tạo ra nhiều phiên bản theo hàm số

mũ Có thể ví dụ, chỉ cần 1 sợi

ADN sau vài giờ có thể nhân lên

1011 phiên bản ADN tương đương với 100 ng ADN Sau khi thực hiện phản ứng PCR thì cần tiến hành

một số kỹ thuật để xác định sản

phẩm, đơn giản nhất là điện di và xác định kích thước của sản phẩm PCR Trong các nghiên cứu chẩn đoán thì kết quả này rất có ý nghĩa,

nó chứng tỏ sự có mặt của ADN

đích trong mẫu nghiên cứu Có thể nhận được tính đặc hiệu và độ nhạy cao hơn khi sử dụng kỹ thuật RFLP với sản phẩm PCR hoặc lai với

mẫu dò đặc hiệu Tuy nhiên, thông tin đầy đủ nhất vẫn là kết quả xác định trình tự ADN của sản phẩm

PCR

Ngay từ khi được giới thiệu thì PCR đã được xem là phương

pháp đưa lại kết quả khá nhạy trong việc xác định và phát hiện vi sinh

vật Tính ưu việt của nó thể hiện ở chỗ có thể chỉ cần một hạt virus

hay một tế bào vi khuẩn nào đó

cũng đủ cho phản ứng xảy ra và

khuyếch đại tới mức có thể phát

hiện được trong thời gian ngắn Kỹ thuật PCR còn được dùng để nhân ADN từ khuôn RNA sau khi đã

được chuyển thành cDNA sau phản ứng phiên mã ngược (RT) Phương pháp này nhanh chóng được chú ý

và trở lên phổ biến cho các nghiên cứu phát hiện vi khuẩn hay virus ở nồng độ thấp trong các mẫu môi

trường và bệnh phẩm Ví dụ việc phát hiện mẫu máu nhiễm HIV có nghĩa là phát hiện phần nhỏ ADN của virus trong hệ gene người có

kích thước gấp 100 000 lần Mặt

khác khi dùng kỹ thuật miễn dịch với kháng thể thì phải cần tới 8

ngày mới có đáp ứng miễn dịch

trong máu, trong khi đó với kỹ

thuật PCR thì toàn bộ quy trình

phát hiện chỉ mất vài giờ (đối với nguồn ADN hay RNA) Lợi thế của

kỹ thuật PCR được tận dụng cho

việc chuẩn bị ADN làm mẫu dò với

số lượng lớn cho các phép lai ADN

đã trình bày ở trên Các mẫu dò có thể được đánh dấu bằng phóng xạ hay phi phóng xạ khi tiến hành

phản ứng khuyếch đại Mẫu dò

đánh dấu với kỹ thuật PCR có ưu thế hơn các phương pháp đánh dấu truyền thống bằng kỹ thuật tổng

hợp các mạch đứt gãy (nick

translation) hay đánh dấu với mồi ngẫu nhiên (rADN random primer labeling) Các ưu thế này có thể kể đến, cụ thể như là cần lượng nhỏ

sợi ADN khuôn, có thể tiến hành

đánh dấu với các mẫu dò có kích

thước ngắn, chuẩn bị mẫu dò không cần tinh sạch ADN khuôn Bảng

1.7 dưới đây liệt kê một số ví dụ

ứng dụng kỹ thuật PCR cho phát

hiện nhiều đối tượng vi sinh vật

khác nhau Rất nhiều các kết quả

nghiên cứu như vậy được trình bày trong các tạp chí chuyên ngành

như: ành như: ành như: ành

như: Journal of Clinical

Microbiology, Applied

Environmental Microbiology

Bảng 1.7 Một số ví dụ về ứng dụng

kỹ thuật PCR trong xác định vi sinh vât

Vi sinh vật Tài liệu

Acanthamoeba sp

Bordetella pertussis

Borrelia burgdorferi

Brucella sp

Candida albicans

Carnobacterium spp

Vokin et al (1992)

Houard et al (1989)

Marconi ADN Garon (1992)

Chlamydia

trachomatis

Clostridium difficile

Coxiella burneti

Cryptosporidium

parvum

Cytomegalovirus

Dengue virus

Epstein-barr virus

Erwinia amylovora

Escherichia coli

Frankia spp

Gaeumannomyces spp

Herman an Derider

(1992)

Miyakawa et

al (1992) Brook et al (1992)

Hayes et al (1992)

Gumerlock

et al (1991) Stein an

Raoult (1992) Laxer et al

Helicobacter pylori

Hepatitis C virus

Human

immunodeficiency

virus (HIV)

Influenza virus

Leptospira spp

Litsteria

monocytogenees

Luteovirus

Mycobacterium

leprae

Mycobacterium

tuberculosis

(1991) Gozlan et al (1991)

Henchal et al (1991)

Samoszuk (1991)

Bereswill etal (1992) Jackson

(1992)

Simonet et al (1990)

Henson (1992)

Neisseria meningitis

Papillomavirus

Parvovirus

Plsmodium

falciparum

Pneumocystis carini

Polio virus

Pseudomonas

solanacearum

Rickettsia spp

Rotavirus

Salmonella spp

Staphylococcus spp

Claton et al (1992)

Okamoto et

al (1992)

Dawood et al (1992)

Claas et al (1992)

Merien et al (1992)

Niederhauser

et al (1992)

Robertson et

al (1991) Hackel et al

Toxoplasma gondii

Treponema pallidum

Trichomonas

vaginalis

Trypanosoma cruzi

Vibrio vulnificus

Yersinia

(1990) Altamirano

et al (1992) Maiden et al(1992) Charlotte et

al (1993)

McOmish et

al (1993) Barker et al (1992)

Olsson et al (1993)

Yang et al (1991)

Seal et al

(1992a)

Gage et al (1992)

Taniguchi et

al (1992)

Rahn et al (1992)

Murakami et

al (1991)

Vanevan et

al (1991)

Grimprel et

al (1991)

Riley et al

(1992) Breniere et

al (1992) Hill et al (1991) Nakajima et

al (1992)