Phương pháp miễn dịch định lượng pps

ĐẶT VẤN ĐỀNgày nay, với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, có nhiều kỹ thuật định lượng miễn dịch mới được nghiên cứu và ứng dụng vào việc chẩn đoán và điều trị, nhất là các bệnh lý ác

MỤC LỤC

I/ MỤC LỤC trang 1

II/ ĐẶT VẤN ĐỀ trang 2 III/ DANH MỤC MỘT SỐ TỪ NGỮ VIẾT TẮT trang 2 IV/ NỘI DUNG trang 3

A PHẢN ỨNG KHÁNG NGUYÊN - KHÁNG THỂ trang 3

1/ Kháng nguyên: Định nghĩa – Tính đặc hiệu – Tính sinh miễn dịch

2/ Kháng thể: Định nghĩa – Phân loại

3/ Nguyên tắc phản ứng kháng nguyên – kháng thể

B KỸ THUẬT ĐỊNH LƯỢNG trang 6

1/ Kỹ thuật cạnh tranh

2/ Kỹ thuật không cạnh tranh

C CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG trang 8

1/ Miễn dịch ngưng kết (agglutination) trang 9 2/ Miễn dịch kết tủa (precipitation) trang 10 3/ Miễn dịch men (ELISA: enzyme linked immuno sorbent assay) trang 11 4/ Miễn dịch vi hạt (MEIA: micro-partide enzyme immuno assay) trang 13 5/ Miễn dịch huỳnh quang (FIA: fluoro immuno assay) trang 14 6/ Miễn dịch phóng xạ (RIA: radio immuno assay) trang 15 7/ Miễn dịch hóa phát quang (chemiluminescense immuno assay) trang 16

 Hóa phát quang trực tiếp (DCLIA: direct-chemiluminescense immuno assay)

 Điện hóa phát quang (ECLIA: electro-chemilumminescense immuno assay) V/ MỘT SỐ XN ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP MD ĐỊNH LƯỢNG trang 18 VI/ KẾT LUẬN trang 19

VII/ TÀI LIỆU THAM KHẢO .trang 19

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngày nay, với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, có nhiều kỹ thuật định lượng miễn dịch mới được nghiên cứu và ứng dụng vào việc chẩn đoán và điều trị, nhất là các bệnh lý ác tính Vấn đề là người làm xét nghiệm phải nắm vững các phương pháp kỹ thuật để thực hiện, cho ra những kết quả thật chính xác và các thầy thuốc sử dụng thật hiệu quả các xét nghiệm trong chẩn đoán và điều trị cho bệnh nhân

Trong phạm vi chuyên đề, chúng tôi chỉ giới thiệu một số kỹ thuật hiện đang áp dụng tại TPHCM và các tỉnh thành lân cận dựa trên các nguyên tắc và phương pháp định lượng trong xét nghiệm MD cũng như một số loại máy móc trang thiết bị được sử dụng trong lĩnh vực này

MỘT SỐ TỪ NGỮ VIẾT TẮT

KN : Kháng nguyên

KT : Kháng thể

MD : Miễn dịch

HT : Huyết thanh

HC : Hồng cầu

NỘI DUNG

A/ PHẢN ỨNG KHÁNG NGUYÊN KHÁNG THỂ

I KHÁNG NGUYÊN

1 Định nghĩa : KN là một vật lạ đối với cơ thể mà khi tiếp xúc với hệ MD

của cơ thể đó sẽ kích thích tạo nên MD đặc hiệu chống lại KN đó

2 Tính đặc hiệu : Tính đặc hiệu của KN là do những quyết định KN, gọi là

epitope, nằm trên bề mặt của KN tạo thành Một KN có thể có nhiều loại epitope, như vậy có thể có nhiều MD đặc hiệu chống lại nó

Ví dụ: KN A có 3 epitope: a , b , c Khi tiếp xúc với hệ MD một cơ thể sẽ kích thích tạo nên 3 MD đặc hiệu chống lại nó, đó là MD đặc hiệu chống lại epitope a (αa); MD đặc hiệu chống lại epitope b (αb); MD đặc hiệu chống lại epitope c (αc)

3

α a

α b

Hình 01 : Một KN với nhiều loại epitope sẽ tạo được nhiều MD đặc hiệu

3 Điều kiện để sinh miễn dịch của kháng nguyên :

 Trọng lượng phân tử (MW: Molecolar Weight): Trọng lượng phân tử tối thiểu là khoảng 10.000 Dalton.Trọng lượng phân tử càng lớn tính sinh

MD càng mạnh

 Cấu trúc phân tử: Cấu trúc phân tử càng phức tạp, tính sinh MD càng mạnh Xếp theo tính sinh MD từ mạnh đến yếu: mạnh nhất là protein; đến các KN có protein như gluco-protein, lipo-protein, nucleo-protein; kém nhất là polysaccharide Lipid, AND, ARN không sinh MD

 Tính lạ đối với cơ thể: một KN muốn sinh MD thì ít nhất KN đó phải mang một epitope lạ đối với cơ thể

II KHÁNG THỂ

Kháng thể có bản chất hóa học là globulin, nên còn gọi là các globulin miễn dịch (Ig) Cấu trúc cơ bản của KT gồm hai chuỗi nặng H (heavy chain) và hai chuỗi nhẹ L (light chain), có trọng lượng phân tử là 50.000 và 25.000, nối với nhau bằng cầu nối di-sulfur KT có hai đầu, một đầu gọi là Fab kết hợp đặc hiệu với một epitope KN, một đầu gọi là Fc , là thành phần có thể tinh hóa được

Về tính sinh KN, chuỗi L mang

KN kappa (k), hoặc lamda (λ), nghĩa

là trên một phân tử KT chuỗi L chỉ có

thể là kappa hoặc lamda, chứ không

thể vừa là kappa vừa là lam da

Chuỗi H thì tùy loại KT mà có thể là

γ , µ , α , δ , ε

Có 5 loại KT mang tên theo

(theo tên KN chuỗi H): IgG (γ), IgM

(µ), IgA (α),IgD (δ), và IgE (ε)

H

H

H

H

L

L

Fab

Fab Fc

Hình 02: Cấu trúc cơ bản của một phân tử kháng thể.

III NGUYÊN TẮC PHẢN ỨNG KHÁNG NGUYÊN – KHÁNG THỂ

Nguyên tắc: Dựa trên phản ứng đặc hiệu giữa KN và KT.

+ Đối với KN hữu hình : Kết quả phản ứng quan sát được bằng sự ngưng kết (Agglutination) giữa KN và KT

+ Đối với các KN hòa tan: Kết quả phản ứng quan sát được bằng :

1.Tạo KN hay KT hữu hình bằng cách gắn KN hay KT vào HC hay hạt

latex, ở đây HC hay hạt latex chỉ là cái giá cho KN.Khi KN có hình thù , phản ứng ngưng kết sẽ xảy ra

2.Hiện tượng kết tủa (Precipitation) của phức hợp KN-KT Hiện tượng xảy

ra khi một KN hòa tan tiếp xúc với KT trực tiếp chống lại nó Một kết tủa được hình thành có thể thấy được bằng mắt thường Quan sát hay đo lường được bằng máy

3.Dùng kỹ thuật đánh dấu KN hoặc KT :

 Các chất đồng vị phóng xạ như : I125 , Co63 …

 Các thuốc nhuộm huỳnh quang như: Fluorescein isothiocyanat (xanh lục), rodamin (đỏ gạch)…

 Các enzym như peroxydaza, glucoza-oxydaza…

5

B KỸ THUẬT ĐỊNH LƯỢNG

I/ Đối với các KN hữu hình (phản ứng ngưng kết): chủ yếu là bán

định lượng bằng cách pha loãng theo tuần tự

II/ Đối với hệ thống kháng nguyên-kháng thể hòa tan:

• Bằng cách đo độ đục của phức hợp KN-KT

• Bằng kỹ thuật “cạnh tranh” và “không cạnh tranh”

1.Kỹ thuật cạnh tranh

a)Nguyên tắc : KN không đánh dấu cạnh tranh với KN có đánh dấu, kết

hợp với KT

b)Phản ứng có hai giai đoạn:

+ Giai đoạn 1: Trong một dãy ống cho vào các thành phần:

 KN đã đánh dấu với lượng bằng nhau

 KN không đánh dấu với lượng tăng dần

 KT kháng KN với lượng bằng nhau

+ Giai doạn 2: Tách phần KN (gồm KN đánh dấu và KN không đánh dấu) đã

gắn KT và KN chưa gắn KT

 Đo hoạt tính phóng xạ của phần KN đã gắn KT (B)

 Đo hoạt tính phóng xạ của phần KN chưa gắn KT (F)

 Xác lập tỉ số B/F và vẽ đồ thị chuẩn biểu diễn mối tương quan giữa các tỉ số này với nồng độ của KN không đánh dấu cho vào mỗi ống

 Tỉ số B/F tỉ lệ nghịch với nồng độ KN không đánh dấu

Yêu cầu của phản ứng này là KT phải có tính đặc hiệu cao, KN dùng xác lập đồ thị tương quan chuẩn phải rất tinh khiết, kháng nguyên không mất hoạt tính sinh học sau khi đánh dấu.

2.Kỹ thuật không cạnh tranh

a)Kỹ thuật này được sử dụng rộng rãi trong định lượng KN hoặc

KT bằng phương pháp MD

b)Các bước thực hiện

+ Gắn KN (hay KT) lên pha rắn, rửa loại bỏ KN (hoặc KT) không gắn + Cho HT bệnh nhân, nếu có KT (hay KN),sẽ gắnđặc hiệu với KN (hay KT).Rửa bỏ chất thừa, cặn

+ Cho HT có kháng KT (hay kháng KN) đã đánh dấu với đồng vị phóng xạ hay enzym.Trong bước này sẽ xảy ra sự kết hợp giữa kháng KT (hay kháng KN) đánh dấu với KT (hay KN) Rửa loại bỏ kháng KT (hay kháng KN) thừa.Nếu kháng KT (hay kháng KN) được đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ thì sau đó đo lường hoạt tính phóng xạ, nếu đánhdấu bằng enzym thì dùng phản ứng sinh màu và đo bằng quang phổ kế

7

C.CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ĐỀ CẬP TRONG CHUYÊN ĐỀ

1.Miễn dịch ngưng kết (agglutination): Dựa trên nguyên tắc kết hợp KN

và KT, dùng hạt latex hay HC làm nền phản ứng.Bản chất của phương pháp này là định tính và suy luận bán định lượng bằng cách pha loãng tuần tự

2.Miễn dịch kết tủa (precipitation): Dựa trên nguyên tắc kết hợp KN và

KT tạo kết tủa trong môi trường thích hợp (như polyethylene glycol), nếu lượng

KT quá nhiều sẽ tạo thành độ đục và đo ở bước sóng UV (340nm)

3.Miễn dịch men (ELISA: enzyme linked immuno sorbent assay) : Dựa

trên nguyên tắc kết hợp KN và KT và phát hiện (định lượng ) bằng chất đánh dấu là một enzyme (vd: peroxidaza) Đây là phương pháp được áp dụng rộng rãi nhất hiện nay

4.Miễn dịch vi hạt: (MEIA: micro-particle enzyme immuno assay):

phương pháp cải tiến dựa trên ELISA

5.Miễn dịch huỳnh quang (FIA: fluoro immuno assay): Dựa trên nguyên

tắc kết hợp KN và KT và phát hiện (định lượng ) bằng chất đánh dấu là một chất phát huỳnh quang Phát hiện chất đo dựa trên môt quang kế huỳnh quang (fluorometer)

6.Miễn dịch phóng xạ (RIA: radio immuno assay): Dựa trên nguyên tắc

kết hợp KN và KT và phát hiện (định lượng) bằng chất đánh dấu là một chất phóng xạ (đồng vị phóng xạ của một nguyên tố như I 125 hay Co63 ).Phát hiện chất đo dựa trên một máy đếm phóng xạ (Geiger meter)

7.Miễn dịch hóa phát quang (chemiluminescanse immuno assay): Dựa

trên nguyên tắc kết hợp KN và KT và phát hiện (định lượng) bằng chất đánh dấu là một chất phát quang ; phát hiện chất đo dụa trên một ống nhân quang

(luminometer) Ưu điểm của phương pháp này là có độ nhạy khát tốt, phản ứng xảy ra nhanh (9-15 phút),dễ áp dụngtự động hóa xử lý hằng loạt.Dự trên phương pháp kích hoạt phát quang, mhóm này được chia ra 2 nhóm phụ:

-Hóa phát quang trực tiếp (DCLIA: Direct-chemiluminescense immuno

assay) kích hoạt phát quang bằng cách thay đổi pH môi trường từ acide sang kiềm

-Điện hóa phát quang (ECLIA: Electro-chemiluminescense immuno

assay) kích hoạt phát quang bằng cách tạo điện áp trong dung dịch phản ứng

I Thử nghiệm ngưng kết hạt latex trên lam kính để định tính và bán định lượng antistreptolysin O (ASO) trong HT (Latex agglutination slide test)

Những hạt latex polystyrene phủ KN streptolysin O đã được ổn định, những KN này sẽ phản ứng MD với những KT kháng stretolysin O thích ứng trong mẫu HT bệnh nhân hoặc HT kiểm chứng

Phản ứng dương tính: khi có sự ngưng kết rõ ràng của các hạt latex trong các ô trên tấm nhựa

Phản ứng âm tính: tạo một huyền địch lợn cợn, không có sự ngưng kết sau 2 phút

Thử nghiệm bán định lượng bằng cách pha loãng với dung dịch đậm glycin NaCl với tỷ lệ 1/ 2, 1/ 3, 1/ 4, 1/ 5,…đọc độ pha loãng cuối cùng còn có sự ngưng kết Kết quả : 200 IU/ml x độ pha loãng

Giá trị chẩn đoán:

Hiệu giá ASO tăng có liên quan đến sốt thấp khớp (Rheumatoid fever) và viêm cầu thận

Hiệu giá ASO tăng cao hơn 200 IU/ml trong trường hợp nhiễm Stertococcus cấp

Hiệu giá ASO nên được theo dõi 2 tuần / lần trong 4-6 tháng

9

II.Miễn dịch ngưng kết độ đục (immuno- turbidity)

Phương pháp này phù hợp cho các cơ chất có trọng lượng phân tử không quá nhỏ như: α-1 anti Trypsine, α-1 acid glycoprotein, Apo A1, Apo B, C3 , C4, CRP, Feritin, IgA, IgG, IgM, Microalbumine, Tranferine… Độ nhạy tiêu biểu của kỹ thuật này là 1 đến 20 mg/dl cơ chất đo

Kỹ thuật: thuốc thử là 1 huyền trọc KT trong dung môi có polyethylene

glycol, phản ứng xảy ra khi trộn đều với mẫu thử và ủ 10-20 phút ở nhiệt độ PTN hay 37oC, và đo độ hấp thu quang ở bước sóng 334,340 hay 365 nm Đường cong chuẩn được xác lập bằng cách đo 5-7 nồng độ chuẩn

Ưu điểm của phương pháp này là đơn giản, chỉ cần trang bị máy quang

phổ kế đo được bước sóng 340 nm và ủ nhiệt ở 37oC

Khuyết điểm là chỉ hạn chế trong 1 số thử nghiệm cho phép mà thôi, và

độ nhạy của cơ chất phát hiện khá thấp

III ELISA: enzyme linked immuno sorbent assay

Dựa trên nguyên tắc kết hợp KN và KT và phát hiện (định lượng) bằng chất đánh dấu là một enzyme, thường dùng alkaline phosphataze hoặc peroxidaza

ELISA thuộc hệ thống kỹ thuật MD enzym pha rắn (giá đỡ KN hay KT) Pha rắn là điều kiện cần thiết cho thành công của phản ứng, trên đó phản ứng MD được xảy ra Tùy theo yêu cầu kỹ thuật pha rắn có thể là:

Bề mặt polystyrol, polyvinylchlorid, các chất dẽo… Các thành phần phản ứng được hấp phụ vật lý

Cellulose, agarose… Các thành phần phản ứng được gắn bởi các liên kết hóa học

11

Máy đo quang

Kháng IgM

Kháng

nguyên

Cộng hợp

Cơ chất

Đo mật độ quang

3.Phản ứng gồm các giai đoạn cơ bản:

• Kết hợp KN và KT (giai đoạn 1)

• Kết hợp chất đánh dấu (conjugate enzyme) vào phức hợp KN và KT (g.đoạn 2)

• Giai đoạn hiện màu và đọc kết quả (giai đoạn 3) Giữa các giai đoạn đều yêu cầu rửa để loại trừ các chất còn dư không phản ứng Tùy thử nghiệm mà thời gian ủ mỗi giai đoạn yêu cầu từ 15 phút đến 1 giờ, ủ ở nhiệt độ phòng hay 37oC, có thử nghiệm yêu cầu lằc trộn liên tục trong khi ủ trên máy ủ chuyên dụng

Định lượng phản ứng bằng một cơ chất bị tác động đổi màu do hoạt tính của enzyme Kết quả so màu đọc trên máy đọc microplate hay máy đọc strip

ở bước sóng 405, 450 hay 492 nm Để định lượng vẫn cần vẽ đường cong chuẩn với 5-7 nồng độ chuẩn

Sai số có thể do: thiết bị hay thuốc thử không đồng bộ, thời gian và nhiệt độ ủ thay đổi, rửa không đạt yêu cầu.

Có thể áp dụng trên các hệ thống mở và hệ thống kín khác nhau:

Các hệ thống mở trên microplate 96 well được áp dụng rộng rãi nhất ở

VN

Ưu điểm: áp dụng cho nhiều thử nghiệm, nhiều hãng cung cấp nên giá thành thiết bị và thuốc thử tương đối thấp,thuận tiện cho những nơi có số lượng mẫu thử thấp

Khuyết điểm: Kỹ thuật gồm nhiều giai đoạn, thời gian lâu

Các hệ thống kín tự động hóa 1 phần các khâu ủ và rửa, làm giảm bớt thao tác thủ công, và sai số do ủ và rửa Khuyết điểm: giá thành cao, phụ thuộc vào nhà cung cấp

IV.Miễn dịch vi hạt : MEIA : micro-particle enzyme immuno assay

Cải tiến từ kỹ thuật ELISA: pha cứng (solid phase) của phản ứng (KN hay KT) được gắn trên các vi hạt treo lơ lững trong dung dịch, đem đến các ưu điểm sau :

Tăng diện tích tiếp xúc KN và KT, làm tăng độ nhạy, giảm thời gian ủ, giảm thời gian làm phản ưng

Giúp tự động hóa kỹ thuật rửa, giúp rửa sạch hơn

13

V Miễn dịch huỳnh quang (FIA: fluoro immuno assay)

Kỹ thuật thực hiện bao gồm các giai đoạn cơ bản như kỹ thuật ELISA, ngoại trừ 2 điểm sau:

Thay thế chất đánh dấu bằng chất phát huỳnh quang

Phát hiện (định lượng) chất đo bằng một quang kế huỳnh quang

(fluorometer)

Khuyết điểm cơ bản nhất là vấn đề nhiễu: chất phát huỳnh quang có thể hiện diện trong tự nhiên Do đó tín hiệu huỳnh quang phát ra phải cao hơn hẳn

so với nhiễu, nên độ nhạy của thử nghiệm này không cao

VI Miễn dịch phóng xạ (RIA: radio immuno assay)

Kỹ thuật thực hiện bao gồm các giai đoạn cơ bản như kỹ thuật ELISA, ngoại trừ 2 điểm sau:

Chất đánh dấu là một đồng vị phóng xạ của một nguyên tố như I125 hay

Co63

Phát hiện (định lượng) chất đo bằng một máy đếm phóng xạ (Geiger Meter)

Trong thực tế, phương pháp này có độ nhạy tốt, nhưng tốc độ phản ứng chậm và cần nhiều thời gian để đếm bức xạ phát ra Những vấn đề trang thiết

bị chuyên dùng và nhất là vấn đề quy định về an toàn vệ sinh môi trường và xử lý chất thải phóng xạ làm cho thử nghiệm này ít được phổ biến

15

VII.Miễn dịch Hóa phát quang trực tiếp (DCLIA:

Direct-chemiluminescense immuno assay)

Chất đánh dấu là một phân tử Acridinium Ester, có khả năng phát quang khi thay đổi pH môi trường Phức hợp KN-KT sau khi rửa sẽ thêm vào một chất acid, sau đó khi cho vào chất kiềm, trong vòng 2 giây phân tử Acridinium Ester sẽ phát quang

Để định lượng ánh sáng phát ra, cần dùng 1 buồng nhân quang (luminometer) trong buồng tối, lượng ánh sáng phát ra tỉ lệ với nồng độ vơ chất cần phân tích có trong mẫu thử

Trong các hệ thống MD hóa phát quang tự động, kỹ thuật vi hạt cũng được áp dụng rộng rãi: làm tăng diện tích tiếp xúc KN và KT lên khoảng 50 lần, làm tăng độ nhạy, giảm thời gian ủ Kỹ thuật này cũng giúp tự động hóa kỹ thuật rửa, giúp rửa sạch hơn, vào giai đọan rửa từ trường được áp vào cạnh của ống nghiệm phản ứng, giữ lại tất cả các vi hạt nhiễm từ

PP gắn trực tiếp

Kháng thể trên pha rắn gắn

vào KN trong HT bệnh nhân,

sau đó được gán vào chất liên

kết kháng thể mang acridium

PP gắn cạnh tranh

KN cần đo và chất đánh dấu mang acridinium gắn cạnh tranh vào KT trên pha rắn