Nghiên cứu phương pháp chiết xuất định lượng Norfloxacin trong sinh học

Nghiên cứu phương pháp chiết xuất định lượng Norfloxacin trong sinh học.

Chủ nhiệm dé tài: TS PHÙNG THỊ VINH

Cơ quan chủ trì : VIÊN KIỂM NGHIỆM - BỘ Y TẾ

Cấp quản lý : BỘ Y TẾ

Mã số:

Thời gian thực hiện: Từ tháng 01/2003 đến tháng 12/2005

Tổng kinh phí thực hiện đề tài: 200 triệu đồng Trong đó: kinh phí sự nghiệp: 200 triệu đồng

Hà nội 2005

604.2

BA IYI

BÁO CÁO KẾT QUÁ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP BỘ

1 Tên đề tài Nghiên cứu phương pháp chiết xuất và định lượng

Norfloxacin trong dich sinh hoc

2 Chủ nhiệm đề tài:

TS Phùng Thị Vinh

3 Cơ quan chủ trì đề tài

VIEN KIEM NGHIEM, BO Y TE

Điện thoại: (84-4) 8255 791 Fax: (84-4) 8 256 911 Địa chỉ: 48 Hai bà Trưng, Hà Nội

4, Cơ quan quản lý để tài: Bộ Y tế

5 Thư ký để tài: DS Tạ Mạnh Hùng

6 Phó chủ nhiệm để tài hoặc ban chủ nhiệm

7 Danh sách những người thực hiện chính

PGS TS Trinh Van Quy

NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG BAO CAO

STT lChữviếttắt | Nội dung

6 Tmax _} Thời gian đạt nồng độ thuốc tối đa

7 AUC Diện tích dưới đường cong

14 RSD Độ lệch chuẩn tương đối (relative standard deviation)

16 T.B.A.H Tetrabutylamoni hydroxid

17 HS Hiéu suat

3, Đánh giá thực hiện đề tài đối chiếu với để cương nghiên cứu

đã được phê duyệt

2.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước liên quan đến đề tài

2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước liên quan tới đề tài 11

3.1.1 Nghiên cứu khảo sát sơ bộ phương pháp phân tích ‘3

4.1.1 Khảo sắt và xây dựng phương pháp định lượng 20

4.1.2.1 Phương pháp tạo tủa protein 27

4.2.1 Đánh giá phương pháp phân tích norfloxacin trong 43

huyết tương

4.2.1.1 Tỉnh đặc hiệu và tương thích của hệ thống 43

4.2.1.3 Xác định giới hạn định tính, định lượng của phương pháp 46 4.2.1.4 Khảo sát độ chính xác của phương pháp 47

4.2.1.6 Khảo sát độ ổn định của norfloxacin trong huyết tương 50 4.2.2 Đánh giá phương pháp phân tích norfloxacin trong 51

nước tiểu

4.2.2.1 Tinh đặc hiệu và tương thích của hệ thống 51

4.2.2.3 Xác định giới hạn định tính, định lượng của phương pháp 52 4.2.2.4 Khảo sát độ chính xác của phương pháp 53

4.2.2.6 Khảo sát độ ổn định của norfloxacin trong nước tiểu 35

đánh giá TĐSH trên chó nhà

4.3.1 Nghiên cứu kỹ thuật thao tác thí nghiệm trên chó nhà 56

4.3.2 Đánh giá khả năng đáp ứng 59

PHẦN A TÓM TẮT CÁC KẾT QUẢ NỔI BẬT CỦA ĐỀ TÀI

4 KẾT QUÁ NỔI BẬT CỦA ĐỀ TÀI

a, Đóng góp mới của để tài

- Dé tài đã góp phần phát triển phương pháp nghiên cứu phân tích thuốc trong dịch sinh học nói chung và đối với dược chất norfloxacin nói riêng

- Đã xây dựng được phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học tin cậy, đơn

giản, phù hợp với hoàn cảnh của phòng thí nghiệm trong nước Điều đó làm củng cố

thêm sự tin cậy vào năng lực nghiên cứu của các cán bộ làm công tác phân tích trong các viện, trung tâm nghiên cứu của Việt Nam

- Đề tài đã để xuất một kỹ thuật thao tác an toàn và phù hợp khi dùng giống chó nhà

để khảo sát tương đương sinh học trong quá trình phát triển sản phẩm cũng như áp dụng thử nghiệm khi cần thiết

+ Chiết pha rắn: dùng loại cột SPE, khảo sát trên 3 loại cột đều có khả năng chiết tốt, mức độ theo thứ tự: (1) LiChrolut TSC (Mixed mode, 300mg/ 3ml), (2)

LiChrolut EN (C18 polymeric Sorbent 2, 200mg/ 3ml) va (3) Strata (C18, 200mg/ 3ml) Phương pháp có thể được áp dụng để xử lý đối với cả mẫu huyết tương và mẫu nước tiểu, Với mẫu huyết tương, nếu sử dụng phương pháp chiết pha rắn, chi phí cao và mất nhiều thời gian hơn Với mẫu nước tiểu, đây là kỹ thuật xử lý tốt nhất Mặc dù chỉ phí

cao, nhưng các phương pháp xử lý khác không đáp ứng được yêu cầu

- Xây dựng được qui trình định lượng norfloxacin trong dịch sinh học Phương pháp

phân tích đã được thẩm định theo các chỉ tiêu qui định, và đều đáp ứng yêu cầu của

dược điển và các tài liệu chuyên ngành Định lượng norfloxacin trong huyết tương và nước tiểu bằng HPLC với các điều kiện sắc ký

* Cột: Altima C18, 5um, 250 x 4mm Nhiệt độ cột : 40°C

* Pha động : MeCN - MeOH - Đệm phosphat pH 3.0 - Acid tricloracetic 0,5%,

tilệ 5: 18:72: 5 WA)

* Tốc độ dòng: 1,25 ml/phút

* Detector: 278nm

* Thể tích tiém mau : 100p

Khi phân tích mẫu nước tiểu, tuỳ thuộc vào từng trường hợp cụ thể, điều chỉnh pha động nếu cần

- Phương pháp phân tích đã được thẩm định đạt các chỉ tiêu qui định cho phép phân tích dịch sinh học: đặc hiệu, độ đúng, chính xác và ổn định

- Bằng thực nghiệm, đã xây dựng được kỹ thuật thao tác an toàn trên động vật (giống

chó nhà), kỹ thuật cho uống thuốc, lấy mẫu máu với 2 kỹ thuật có bộc lộ và không bộc

lộ tĩnh mạch Xây dựng tiêu chuẩn chuồng, điều kiện để có thể lưu giữ theo thiết kế của thử nghiệm TĐSH, đảm bảo khả năng sử dụng động vật thay thế khi cần thiết trong đánh giá TĐSH cũng như các loại thí nghiệm khác cần thiết

- Đánh giá tính ổn định hấp thu của giống chó nhà Thực hiện theo qui trình thử nghiệm đã xây dựng, giống chó nhà có đáp ứng tương đối phù hợp để sử dụng trong khảo sát TĐSH Qua mô hình đánh giá TĐSH trên cùng một chế phẩm có chứa Nofloxacin, kết quả cho thấy là tương đương với cả giá trị Cmax va AUC

c, Hiệu quả về đào tạo

- Đào tạo cho cán bộ của phòng Dược lý, viện Kiểm nghiệm về kỹ thuật xử lý mẫu, bảo quản và phân tích thuốc trong dịch sinh học Các cán bộ đã tham gia đề tài đã có

cơ hội để học tập, thực hành về kỹ thuật phân tích, thẩm định phương pháp và thiết kế nghiên cứu, Hiện nay tất cả đều đã có năng lực làm việc trong lĩnh vực này

- Phương pháp đã được sử dụng làm thao tác kỹ thuật mẫu cho lớp tập huấn của Tổ chức Y tế thế giới trong triển khai mô hình mẫu đánh giá TĐSH Lớp tập huấn chủ yếu cho các cán bộ của Viện Kiểm nghiệm và Phân viện kiểm nghiệm, ngoài ra còn một

số cán bộ của trường đại học Dược, doanh nghiệp cũng tham dự

- Một phần kết quả và kinh nghiệm thực hiện của đề tài đã được sử dụng trong 2 lớp tập huấn về Sinh khả dụng và Độ hòa tan của Viện Kiểm nghiệm tổ chức cho các cán

bộ của Trung tâm kiểm nghiệm và một số doanh nghiệp

- Cán bộ của viện Kiểm nghiệm sau khi tham gia đề tài đã có được những kinh nghiệm nghiên cứu nhất định trong lĩnh vực này, có thể tham gia vào đào tạo cho các cán bộ của Trung tâm kiểm nghiệm hoặc các học sinh sau đại học

d, Hiệu quả về kinh tế

Kỹ thuật phân tích sẽ được áp dụng trong các nghiên cứu về dược động học, tương

đương sinh học và theo dõi điều trị

Việc thử nghiệm và sử dụng thành công giống chó nhà trong khảo sát TĐSH thay thế

cho giống chó thí nghiệm Beagle mà hiện nay chúng ta chưa thể nhập của nước ngoài (mà với giá thành rất cao) sẽ giảm chỉ phí nghiên cứu cho ngành công nghiệp dược

e, Hiệu quả về xã hội

Phương pháp phân tích có khả năng áp dụng trong các thử nghiệm về TĐSH cũng như những nghiên cứu về dược động học, theo dõi điều trị Khi đó, góp phần vào việc nâng cao chất lượng thuốc, nâng cao hiệu quả và chất lượng điều trị Người bệnh sẽ

được dùng những thuốc có chất lượng cao hơn, được hưởng những điều trị có chất

lượng hơn Đó thực sự là một trong những mục tiêu lớn mà chúng tôi mong đợi

2, ÁP DỤNG VÀO THỰC TIẾN SẢN XUẤT VÀ ĐỜI SỐNG XÃ HỘI

- Các kỹ thuật phân tích được áp dụng cho việc nghiên cứu xây dựng phương pháp và đánh giá các phương pháp phân tích

- Qui trình phân tích sẽ được áp dụng cho việc theo dõi dược động Học của các

cơ sở điều trị Tạo điều kiện thuận lợi cho các thầy thuốc áp dụng phương thức điều trị

mới, phù hợp và hiệu quả với từng trường hợp bệnh nhân

3, ĐÁNH GIÁ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI ĐỐI CHIẾU VỚI ĐỀ CƯƠNG NGHIÊN CỨU ĐÃ

ĐƯỢC PHÊ DUYỆT

- Kéo dài thời gian nghiên cứu

Giai đoạn cuối năm 2005, do phải tập trung thực hiện một số công việc chuyên môn đột xuất khác của Viện, nên việc tổ chức nghiệm thu chưa được kịp thời

- Thực hiện được các mục tiêu nhưng không hoàn chỉnh

- Chỉ thực hiện được một số mục tiêu đề ra

- Những mục tiêu không thực hiện được

Ngoài mục tiêu được ghi trong để cương, mục tiêu riêng của cơ sở đặt ra khi thực hiện

đề tài cũng đã đạt được như mong muốn, đó là đánh giá khả năng sử dụng động vật trong nghiên cứu khảo sát TĐSH ở Việt nam

c, Các sản phẩm tạo ra so với dự kiến của đề cương

- Tạo ra đầy đủ các sản phẩm dự kiến trong đề cương

- Chất lượng sản phẩm đạt yêu cầu như đã ghi trong đề cương

- Tạo ra đầy đủ các sản phẩm nhưng chất lượng có sản phẩm chưa đạt

- Tạo ra đầy đủ các sản phẩm như tất cả đều chưa đạt chất lượng

- Tạo ra được một số sản phẩm đạt chất lượng - Những sản phẩm chưa thực hiện được

d, Các tài liệu có liên quan tới kết quả của đề tài đã công bố

1 Xây dựng phương pháp định lượng Norfloxacin trong huyết tương bằng HPLC

(Tạp chí Kiểm nghiệm, số 4 2004)

2 Khảo sát khả năng sử dụng chó nhà để đánh giá sinh khả dụng và tương

đương sinh học (Tạp chí Kiểm nghiệm, số 4 2005)

e, Đánh giá việc sử dụng kinh phí

- Tổng kinh phí thực hiện dé tài: 250 triệu đồng

- Trong đó: kinh phí sự nghiệp 200 triệu đồng

- Kinh phí từ nguồn khác 50 triệu động (hoạt động thường xuyên của

Viện, khấu hao máy móc thiết bị, điện nước.)

- Toàn bộ kinh phí của đề tài đã được quyết toán

- Chưa thanh quyết toán xong : Không

- Kinh phí tồn đọng Không

4 CÁC Ý KIẾN ĐỀ XUẤT

- Hàng năm, việc tổ chức xem xét và tuyển chọn các đề tài nghiên cứu nên được thực

hiện sơm hơn, có thể tiến hành vào cuối năm trước, để đầu năm sau có thể bắt đầu

thực hiện được ngay

- Việc cấp kinh phí cho các đề tài nghiên cứu cũng nên được cấp theo tiến độ của đề

tài đã đăng ký.

PHAN B NOI DUNG BAO CAO CHI TIET

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP BO

1 ĐẶT VẤN ĐỀ:

1.1 Tính cấp thiết của để tai

Nhu cầu về nghiên cứu sinh khả dụng, tương đương sinh học cũng như tương dương điều trị ở Việt Nam ngày một tăng thêm, Để thực hiện được những loại nghiên cứu này, một trong những nội dung quan trọng là kỹ thuật chiết tách thuốc ra khỏi các

loại dịch sinh học (máu, nước tiểu, dịch não tuỷ ) và xây dựng qui trình định lượng

Quá trình phân tích các thuốc trong dịch sinh học thường gặp nhiều khó khăn do thuốc sau khi vào cơ thể thường bị chuyển hoá Các chất chuyển hoá nói chung là những dẫn chất cùng nhóm nên việc tách được riêng và định lượng đòi hỏi phải lựa chọn những điều kiện phân tích thích hợp Hơn nữa, nồng độ thuốc trong các dịch sinh học thường rất thấp, lượng mẫu thử ít (1 — 2ml) môi trường dịch sinh học phức tạp cũng đã

gây không ít khó khăn cho các nhà phân tích Theo qui định chung về phân tích thuốc

trong dịch sinh học, phương pháp phân tích phải được thẩm định và đánh giá về tính

đặc hiệu, độ chính xác, độ đúng, xác định được khả năng phát hiện và giới hạn định

lượng đối với từng hoạt chất Ngoài ra, để đáp ứng được số lượng mẫu rất nhiều và cấp thiết về mặt thời gian trong thử nghiệm TĐSH, mẫu thử phải được nghiên cứu độ

ổn định khi bảo quản ở những điều kiện khác nhau

Theo các hướng dẫn về đánh giá tương đương sinh học (TĐSH) in vivo, tuỳ thuộc vào

mục đích đánh giá, đặc tính của thuốc người ta có thể ứng dụng một số mô hình thử Thử nghiệm trên người cho kết quả phù hợp nhất, nhưng phức tạp do phải tuân thủ qui chế về y đức và chỉ phí tốn kém Hơn nữa, đặc tính giải phóng dược chất của các chế phẩm giải phóng kéo dài đang nghiên cứu chưa đảm bảo an toàn cho người sử dụng

Thử nghiệm trên động vật cũng đã được nêu trong hướng dẫn [32] Trong các loài động vật, chó được xem là loài thích hợp hơn cả do đặc điểm đường tiêu hoá tương tự,

có thể cho uống thuốc và lấy mẫu Tuy nhiên, ở Việt Nam chưa có nơi nào cung cấp loài chó thí nghiệm, và khả năng mua từ nước ngoài sẽ hạn chế do giá thành cao Liệu giống chó nhà có thể sử dụng thử nghiệm thay thế trong nghiên cứu khảo sát hay không ? Cần thiết phải có những đánh giá qua thực nghiệm để khẳng định khả năng thao tác kỹ thuật cho uống thuốc và lấy mẫu máu sao cho đáp ứng yêu cầu, an toàn, giữ con vật khoẻ mạnh để tiến hành thử nghiệm chéo, đồng thời xem xét mức độ ổn định trong hấp thu thuốc của giống chó trong nước

Trước những nhu cầu đó, Bộ Y tế đã để xuất chủ đề nghiên cứu với mục tiêu chủ yếu

để giải quyết vấn dé kỹ thuật phân tích Chính vì vậy, Viện Kiểm nghiệm đã được Bộ Y

tế giao nhiệm vụ nghiên cứu để tài:

“Nghiên cứu phương pháp chiết xuất và định lượng Norfloxacin

trong dịch sinh học”

1.2 Giả thiết nghiên cứu của đề tài

- Mẫu huyết tương được xử lý bằng 3 phương pháp chiết: tạo tủa, chiết lỗng — long va chiết pha rắn Mẫu nước tiểu: khảo sát xử lý bằng cách pha loãng (như các tài liệu giới thiệu) và phương pháp chiết pha rắn

- Định lượng norfloxacin trong dịch sinh học được giả thiết bằng phương pháp HPLC,

detector diod array Cột pha đảo với các loại thông thường đang lưu hành, pha động

gồm có acetonitril, methanol và một số dung dịch đệm để điều chỉnh dung dịch đệm

có các pH khác nhau

- Động vật dùng trong khảo sát thử nghiệm là chó, không dùng thỏ vì theo tài liệu cho

thấy thỏ có đường tiêu hóa rất khác hệ tiêu hóa của người, và qua khảo sát thực nghiệm cho thấy không phù hợp Dùng một chế phẩm Noroxin để thử nghiệm trên 2 nhóm động vật trong 2 giai đoạn lấy mẫu máu và phân tích để tính kết quả xem 2 nhóm có cho kết quả tương đương không 2

1.3 Mục tiêu nghiên cứu

1 Xây dựng phương pháp chiết xuất Norfloxacin từ dịch sinh học

2 Xây dựng qui trình định lượng Norfloxacin trong dịch sinh học bằng sắc ký lỏng

hiệu năng cao (HPLC)

3 Đánh giá khả năng dùng động vật (giống chó nhà) trong nghiên cứu đánh giá

TĐSH ở Việt Nam

Theo thông báo của Bộ Y tế gửi các cơ sở nghiên cứu khoa học (2003), đề tài được đề xuất với nội dung nghiên cứu và mục tiêu phải đạt là đánh giá khả năng sử dụng động vật để thử TĐSH ở Việt Nam Dựa trên kế hoạch phát triển

của Viện, chúng tôi đã nhận thấy đây là một nội dụng nghiên cứu phù hợp với hướng phát triển về chuyên môn Do vậy, mục tiêu thứ 3 vẫn được nhóm nghiên cứu xác định là cần phải giải quyết, và một phần nội dung nghiên đã được chuẩn bị để thực hiện cho mục tiêu này

2 TONG QUAN DE TAI

2.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước liên quan đến đề tài

2.1.1 Nhu cầu nghiên cứu phương pháp phân tích trong dịch sinh học

Dược điển Mỹ (từ USP 23 — 1995 đến nay) đã giới thiệu chuyên luận “In vivo Bioequivalence guidance” Nội dung của chuyên luận là những hướng dẫn chung để

thực hiện một thử nghiệm tương đương sinh học Hướng dẫn bao gồm những nội dung khi thực hiện thử nghiệm, những chỉ tiêu cần phải đạt Bên cạnh đó, chuyên luận đã giới thiệu protocol phân tích cho một số loại thuốc cụ thể Số lượng protocol đã được tăng dần lên: USP 23 — xuất bản năm 1995, có 5 protocol; USP 24 — xuất bản năm

2003, số protocol tăng lên là 26 chủ yếu cho các loại thuốc dưới dạng viên nén và

viên nang, và một số thuốc tác dụng kéo dài [29] Trong các protocol này, những qui

định và hướng dẫn chủ yếu về phương pháp thử nghiệm độ hoà tan (để xem xét cho miễn thử in vivo), thiết kế nghiên cứu, tính thống kê kết quả Phần phương pháp phân tích, các protocol chỉ đưa ra qui định là các phép phân tích phải đạt các chỉ tiêu thẩm

định theo yêu cầu, hoàn toàn không có hướng dẫn phương pháp phân tích cụ thế Chính do đặc điểm của mẫu phân tích trong những nghiên cứu này thường rất phức tạp, nên qui định một phương pháp cụ thể trong protocol sẽ hạn chế vì ít khả thi Mac

dù khi đã có protocol phân tích, nhưng áp dụng vào từng trường hợp, qui trình phân tích cần điều chỉnh để phù hợp với từng điều kiện phòng thí nghiệm để có thể lựa chọn được điều kiện phân tích tối ưu, khả thi

Dược điển Trung Quốc 2000 [15], trong chuyên luận Hướng dẫn nghiên cứu

sinh khả dụng và tương đương sinh học của thuốc đã qui định khá rõ ràng về các chỉ tiêu cần thẩm định đối với phương pháp phân tích áp dụng cho mẫu thử sinh học Đồng thời, hướng dẫn thử nghiệm trong lĩnh vực này của các quốc gia cũng có những qui định về phương pháp phân tích, như Hướng dẫn về thẩm định phương pháp phân tích dùng trong sinh học của cơ quan quản lý thuốc và thực phẩm Mỹ [30] hoặc hướng dẫn của khối Asean [14] Các hướng dẫn đều có qui định chung về các chỉ tiêu cần phải thẩm định như: tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ đúng, độ chính xác (khả năng lặp lại trong ngày và khác ngày), độ ổn định

2.1.2 Tổng quan về Norfloxacin

Norfloxacin là một kháng sinh thuộc nhóm quinolon, công thức phân tử là C;¿H;„¿FN;O;, phân tử lượng 319.3 Norfloxacin dưới dạng bột kết tỉnh màu trắng hoặc vàng nhạt, khó tan trong nước, tan ít trong cồn hoặc aceton; hấp thụ tử ngoại trung bình UV„„„~ 274nm, A;„„' ~ 1109 (NaOH 0,1N) Khi định lượng bằng HPLC trên sắc

đồ peak norfloxacin thường bị doãng

Công thức cấu tạo của Nofloxacin:

Sau khi uống, Norfloxacin hấp thu nhanh nhưng không hoàn toàn từ đường tiêu hoá Thức ăn ở đường tiêu hóa có thể làm giảm sự hấp thu của thuốc Các thuốc antacid có chứa magnesi hydroxid hoặc nhôm hydroxid làm giảm sinh khả dụng của

Norfloxacin ở người lớn khoẻ mạnh, uống thuốc lúc đói, ít nhất 30 -50% liều uống norfloacin được hấp thu từ đường tiêu hoá, nồng độ đỉnh huyết tương thường đạt được 1-2 giờ sau khi uống Nồng độ đỉnh của norfloxacin trong huyết tương trung bình từ 0,75 — 1 mcg/ mi sau khi dùng liều đơn 200mg và 1,3 — 1,9 mcg/ mi sau khi dùng liều

400 mg Sau khi uống liều đơn 800 mg, 1200 mg hoặc 1600 mg, nồng độ dỉnh trong huyết thanh trưng bình là 2,4; 3,2 hoặc 3,8 mcg/ ml, tương ứng Nồng độ thuốc trong huyết tương hoặc huyết thanh có thể phát hiện được trong vòng 12 giờ sau khi uống thuốc Thuốc liên kết với protein khoảng 10 — 15% Thuốc đi qua nhau thai và vào cả dịch màng ối và máu thai nhị Chưa biết thuốc có vào sữa mẹ không

Nghiên cứu đa liều ở người lớn chức năng thận bình thường cho thấy rằng nồng

độ đỉnh huyết thanh của Norfloxacin không tăng lên sau khi uống liều nhắc lại, điều đó chứng tỏ thuốc không tích luỹ Nồng độ huyết thanh ở tình trạng ổn định đạt được sau

2 ngày điều trị Với người có chức năng thận bình thường, thời gian bán thải từ 2- 4 giờ,

tăng lên ở người cao tuổi, trung bình là 4 giờ [3]

Thuốc được chuyển hoá từng phần bằng thay đổi nhóm piperazinyl tạo thành 6

chất chuyển hoá được ký hiệu là M1, M2, M3, M4 — 1, M4-2 và M5 Một số chất

chuyển hoá có tác dụng kháng khuẩn nhưng đều kém thuốc mẹ Thuốc được thải trừ

ra khỏi cơ thể theo cơ chế lọc ở cầu thận và tiết qua ống thận, thuốc cũng được bài tiết qua phân dưới dạng không đổi Sau khi uống liều 400mg ở người lớn có chức năng thận bình thường, khoảng 25 - 40% liều được bài tiết ra nước tiểu dưới dạng không đổi, và khoảng 5 — 10% dưới dạng chất chuyển hoá trong vòng 24 — 48 giờ ít nhất khoảng 30% bài tiết qua phân trong vòng 48 giờ Thanh thải thận của norfloxacin

§

trung bình 234 - 296 ml/ phút ở người lớn có chức năng thận bình thường Nồng độ

norfloxacin trong nước tiểu nói chung 200mcg/ml trong 2 — 3giờ đầu, khoảng

30mcg/ml trong ít nhất 12 giờ sau khi uống thuốc Sau khi uống liều 400mg Ở người có chức năng thận bình thường, nồng độ thuốc trong nước tiểu đạt trung bình là 417

mcg/ml (1 -2 giờ); 46,9 mcg/ml (8 — 12 gid) va 22,5 meg/ml (12 — 24 giờ)

Nghiên cứu về hấp thu, phân bố và thải trừ của Norfloxacin sau khi uống cũng

đã được thực hiện trên một số loài động vật như chuột nhất, chuột cống, chó, thỏ, khỉ cho dùng Norfloxacin có đánh dấu phóng xạ Nói chung, trên động vật Norfloxacin được hấp thu không hoàn toàn sau khi uống Khoảng 10 -20% liều uống đã hấp thu được chuyển hoá thành chất ít có tác dụng kháng khuẩn hơn Thuốc cũng được thải trừ theo đường thận và đường mật Trên chuột cống, sau khi uống, 8% liều được tìm thấy trong nước tiểu, 75% dưới dạng không đổi Phần còn lại của liều được tìm thấy

Trên chó, khoảng từ 10 — 12% liểu norfloxacin được hấp thụ sau khi uống Néng độ đỉnh huyết thanh đạt được trong khoảng một giờ Thuốc liên kết với protein

huyết thanh khoảng 18% Hoạt tính phóng xạ tìm thấy trong nước tiểu và phân với tỷ lệ

39 và 53% liều, tương ứng, 85% thuốc tìm thấy trong nước tiểu ở dưới dạng không đổi

Trên thổ cho uống thuốc trong tình trạng không đói hoàn toàn, nồng độ đỉnh huyết thanh của các chất có tính kháng khuẩn đạt được là 1 — 2 giờ Liên kết với protein huyết thanh của thỏ là 18% Chỉ có khoảng 4,5% liều được tìm thấy trong nước tiéu [13]

2.1.3 Phương pháp phân tích

Để phân tích các chất trong dịch sinh học (huyết tương, nước tiểu, mô), thường phải sử dụng các phương pháp phân tích dụng cụ có khả năng phát hiện mẫu thử ở nồng độ rất thấp Các phương pháp thường được lựa chọn và giới thiệu: sắc ký lỏng

hiệu năng cao với detector tử ngoại, huỳnh quang, điện hóa, sắc ký khí khối phổ, sắc

ký lổng khối phổ Phương pháp sắc ký điện di mao quản vùng hiệu năng cao đang cớ

xu hướng được sử dụng để xác định các chất chuyển hóa Tuy nhiên, việc ứng dụng các phương pháp này còn tuỳ thuộc vào trang thiết bị hiện có của phòng thí nghiệm

Việt nam

Hermamn và các cs [ 23 ], đã nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định

nofioxacin trong huyết tương chủ yếu bằng HPLC, nhưng thường sử dung detector

huỳnh quang và phương pháp bơm mẫu tự động Với detector huỳnh quang có độ nhạy cao, giới hạn phát hiện có thể từ 10 - 30 ng/ml HPLC với detector UV cũng được

một số ít tác giả dùng để định lượng norfloxacin trong dịch sinh học [ 24 ] với khoảng

tuyến tính từ 0,1 - 2mcg/ ml Các phương pháp thường được dùng xử lý mẫu để loại

tạp và chiết mẫu là chiết lỏng - rắn, tủa protein, chiết lỗng — lỏng

Nghiên cứu phương pháp định lượng norfloxacin trong huyết tương (mẫu tự tạo

bằng cách hoà tan chuẩn trong huyết tương), các tác giả trên [23 ] dùng phương pháp tạo tủa protein với Acetonitril để xử lý mẫu huyết tương và pha loãng với nước để xử lý mẫu nước tiểu Dịch chiết cho thêm acid perclorric và triethylamin trước khi tiêm vào máy sắc ký Phân tích dùng hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector huỳnh

quang, cột C18, 80 x 4 mm, 3 nm Nucleosil, nhiệt độ cột 40°C Huỳng quang với bước

sóng kích thích 300nm, phát xạ ở 450 nm Khoang nồng độ khảo sát tuyến tính 31 —

2507 ngí ml (huyết tương) và 7,5 - 299 mcg/ ml (nước tiểu) Phép thử cho thấy có độ

đúng và đệ chính xác cao

Một số tài liệu khác đã giới thiệu định lượng norfloxacin bằng sắc ký lỏng hiệu

năng cao, loại protein bằng acetonitril Phân tích dùng chuẩn nội hydrochlorithiazid, cho giới hạn phát hiện 1 mecg/ ml Phân tích bằng phương pháp HPLC kết hợp các

detector huỳnh quang và tử ngoại cũng đã được nghiên cứu để xác định một số chất

thuộc nhóm fluoroquinolon như ciprofloxacin, norfloxacin, ofloxacin và pefioxacin [32]

Một số tác giả đã nghiên cứu phân tích thuốc trong nước tiểu [20], nhưng các phương pháp để chiết tách thuốc từ nước tiểu rất ít được giới thiệu hoặc giới thiệu phương pháp đơn giản là pha loãng với nước Tuy nhiên, xem xét về tính chất của nước tiểu người sau khi uống norfloxacin và một số nghiên cứu thăm dò, chúng tôi

thấy xử lý bằng phương pháp pha loãng với nước không phù hợp véi norfloxacin Norfloxacin sau khi vào cơ thể được chuyển hoá thành 6 chất chuyển hoá khác nhau,

do vậy việc xác định riêng norfloxacin trong nước tiểu là rất khó khăn và không thể xử

lý mẫu bằng phương pháp đơn giản như vậy được

Về phương pháp chiết xuất, có 3 phương pháp xử lý mẫu hay được sử dụng với các mẫu dịch sinh học: tủa protein với dung môi hữu cơ hoặc acid, chiết lổng — lỗng và chiết pha rắn

Tuỳ vào điều kiện của từng phòng thí nghiệm mà ưu thế dùng phương pháp nào Một

số phòng thí nghiệm của Hàn Quốc, Bangdung (Indonexia) hay sử dụng phương pháp chiết lỏng — lỏng; trong khi đó, phòng thí nghiệm của Malaysia thì áp dụng tất cả các phương pháp, kể cả chiết pha rắn

Phương pháp chiết pha rắn (solid phase extraction - SPE) ít được dùng phần lớn do giá thành, nhưng mức độ tinh khiết của dịch chiết cao Khi xây dựng phương pháp

SPE, cần tiến hành qua 5 bước

- _ Bước 1: Lựa chọn dung môi rửa giải cho cột: Hoà tan chất cần phân tích trong dung môi rửa giải và cho chảy qua cột SPE ở điều kiện xác định Đánh giá hiệu quả tìm lại chất trong dung môi chảy qua cột để biết lượng chất còn bị lưu giữ trên cột Nếu tỷ lệ đạt 90 — 100% thì được coi là phù hợp

-_ Bước 2: Đánh giá khả năng lưu giữ mẫu của cột SPE

- Bước 3: đánh giá khả năng tìm lại dược chất trong mẫu thử (nước tiểu hoặc huyết tương) so với khả năng tìm lại dược chất khi pha trong nước hoặc dung

môi hữu cơ

10

- Bước 4: Xây dựng đường chuẩn: thực hiện qui trình chiết với một dãy nồng độ cần nghiên cứu, xác định mức độ tuyến tính, hệ số đạt trên 0,95 là coi được chấp nhận

- Bước 5: Phân tích với mẫu có nồng độ chưa biết, so sánh độ lặp lại, độ chính xác với phương pháp trước

2.1.4 Đối tượng dùng trong thử nghiệm tương đương sinh học

Những nghiên cứu dược động học, sinh khả dụng hoặc TĐSH tốt nhất là thực

hiện trên người tình nguyện Trong một số trường hợp có thể thực hiện trên động vật

thí nghiệm (chó, thỏ, khi ) Với động vật thí nghiệm, mỗi loài thường có những ưu điểm và nhược điểm riêng Các tài liệu [32] giới thiệu phương pháp thường cho rằng chó là loài thích hợp hơn những loài khác khi thử TĐSH do đường tiêu hoá của chó có

cấu tạo gần giống với người Các loại thuốc dùng cho người đều có thể dùng cho chó;

có thể lấy máu và nước tiểu với thể tích đủ cho nghiên cứu; có thể lưu giữ cho nghiên cứu dùng đa liều hoặc nghiên cứu chéo Tuy nhiên, các tài liệu đều giới thiệu và

hướng dẫn sử dụng giống chó thí nghiệm (Beagle dog) Đây là giống chó thí nghiệm, hiền lành và sạch sẽ, nhưng ở Việt nam chưa có nơi nào sử dụng

Thỏ là một loài động vật hiển lành, dễ nuôi giữ, nhưng đường tiêu hoá của thỏ khác về cơ bản so với người Thỏ ăn cổ nên sự tiêu hoá tương tự ở loài động vật nhai lại, nhưng dạ dày thỏ lại đơn giản là một túi rộng có dung tích khoảng 80ml và không

có các vùng đặc biệt Thức ăn được trộn, lên men và thuỷ phân ở dạ dày, sau đó

chuyển xuống tá tràng Kinh nghiệm của những nhà nghiên cứu trên động vật cho

thấy rằng việc chuẩn bị được một dạ dày rỗng hoàn toàn với thổ thường rất công phu, hơn thế nữa, đường tiêu hoá của thỏ thường có nhiều khí Do vậy, các thuốc dùng qua đường tiêu hoá khi thử trên thỏ thì kết quả dao động nhiều Khi thí nghiệm trên thỏ, việc lấy máu được thực hiện khá dễ dàng nhưng thể tích máu của thỏ ít, lượng lấy mỗi lần hạn chế và thỏ có thể bị mệt nếu thời gian lấy máu kéo dài Hơn nữa thỏ khó uống được các loại thuốc ở dạng viên to nguyên vẹn Ngoài chó và thỏ, một số loài khác có thể dùng để thử nhưng thường có nhiều nhược điểm (chuột: quá nhỏ; khi, lợn: đắt) [32]

2.2 Tình hình nghiên cúu trong nước liên quan tới đề tài

Trên thị trường Việt Nam đang lưu hành một số chế phẩm của Norfloxacin với giá

bán rất khác nhau: Noroxin 400 (MSD) giá từ 8 - 10 nghìn đồng/ viên, trong khi đó một

viên Nor- 400 (Intas- Ấn độ) hoặc một sản phẩm của trong nước giá chỉ 4 - 5 trăm đồng/ viên Không biết rằng liệu sinh khả dụng của các sản phẩm này có chênh lệch nhau đáng kể như vậy không Nếu có kết quả đánh giá TĐSH, chúng ta sẽ có những

dữ liệu giúp thầy thuốc và bệnh nhân chọn được một thuốc rẻ tiền mà tác dụng tương đương, hoặc có cơ sở để buộc nhà sản xuất nào đó phải thay đổi công thức bào chế

Nghiên cứu về sinh khả dụng và TĐSH ở trong nước đang bắt đầu được quan tâm Vào thời điểm chuẩn bị cho nghiên cứu (2002 — 2003), những khái niệm này còn hầu-như khá mới mẻ ở Việt Nam Khi đó, những khái niệm này mới được cập nhật và chỉ một số các bộ ngành dược quan tâm tìm phương pháp nghiên cứu trên thực nghiệm Việc đánh giá chất lượng các loại thuốc mới ở nước ta cũng chỉ dựa trên tiêu chuẩn chất lượng sản phẩm do nhà sản xuất đăng ký và đánh giá chủ yếu bằng các phép phân tích hoá lý Trong khoảng 2 — 3 năm trở lại đây, những nghiên cứu về lĩnh vực này đã được quan tâm nhiều hơn Tuy nhiên, hầu hết các nghiên cứu cũng mới chỉ

dừng trong các trường đại học và viện để học tập và nâng cao năng lực Việc ứng dụng các qui trình phân tích cũng như tiến hành các đánh giá thử nghiệm theo nhụ

cầu của thực tế (doanh nghiệp, cơ sở điều trị) còn rất hạn chế Thực hiện các nghiên cứu về dược động học ở các cơ sở nghiên cứu và điều trị hầu như chưa khởi động, mặc dù một số nơi đã có thiết bị phân tích Nguyên nhân chính là do chưa có những cán bộ được đào tạo về kỹ thuật phân tích thuốc trong các mẫu sinh học để có thể phân bố về các cơ sở này

Cho tới tận bây giờ 3/2006), chưa có một qui chế nào qui định về việc thử nghiệm tương đương sinh học với các thuốc sản xuất trong nước cũng như các thuốc nhập khẩu ở các nước trên thế giới, những nghiên cứu, đánh giá đã được đưa vào qui chế bắt buộc trong phát triển sản phẩm và thực hiện thường xuyên từ mấy thập kỷ qua Do

vậy, sớm hay muộn, Việt Nam cũng phải thực hiện vì mục tiêu hội nhập kinh tế

Một khó khăn nữa khi thực hiện những nghiên cứu này là nồng độ thuốc trong các dịch sinh học thường rất thấp nên đòi hỏi các cơ sở nghiên cứu phải có đủ phương

tiện phân tích hiện đại, có độ nhạy cao, cán bộ phân tích có kinh nghiệm Cho tới nay, rất hiếm cơ sở tham gia nghiên cứu phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học

Một số đề tài cần xác định nồng độ thuốc trong dịch sinh học thường chỉ áp dụng

những phương pháp tham khảo trong tài liệu, thẩm định đánh giá phương pháp

thường chưa được thực hiện một cách đầy đủ

Trong một số nghiên cứu đã và đang thực hiện ở trong nước, thông thường chỉ áp dụng phương pháp xử lý mẫu bằng cho tủa protein với dung môi hữu cơ Các phương pháp chiết lỏng — lỏng và chiết pha rắn rất ít được sử dụng

Vấn đề thử nghiệm trên người cũng còn rất mới mẻ ở Việt Nam Tháng 12/ 2002, Bộ Y

tế lần đầu tiên ban hành “Quy chế về tổ chức và hoạt động của Hội đồng đạo đức

trong nghiên cứu y sinh học" (số 5129/ 2002 QĐ-BYT) [4] Tiếp theo đó, tháng 7/

2003, Hội đồng đạo đức cấp Bộ của Bộ Y tế được thành lập để xem xét đánh giá các

để tài nghiên cứu cấp Bộ có liên quan đến con người Nhưng trong năm 2003, việc xem xét cho các thử nghiệm trên người còn rất hạn chế Cũng chính vì vậy mà Bộ Y tế khi chuẩn bị yêu cầu thực hiện đề tài này phải để xuất khảo sát trên động vật Thực nghiệm trên chó khi đó cũng còn bị lo ngại về vấn đề thao tác an toàn nhiều hơn là hiệu quả

12

ở Việt Nam hiện nay chưa có nơi nào nuôi cung cấp loài chó thí nghiệm, khả năng

mua từ nước ngoài sẽ hạn chế do giá thành cao Thao tác trên chó thí nghiệm tương

đối đơn giản và an toàn, nhưng nuôi dưỡng để thực hiện nghiên cứu chéo đòi hỏi phải

có điều kiện chăm sóc đạt tiêu chuẩn

Giống chó nhà của Việt Nam cũng đã được dùng để tiến nành một số thí nghiệm dược

lý Với những thí nghiệm loại đó, chủ yếu là quan sát một số cấu tạo giải phẫu hoặc

sinh lý của con vật dưới những tác động của thuốc Chó thường được bắt và thí nghiệm sau khi gây mê, nên đảm bảo an toàn cho kỹ thuật viên Sau khi thí nghiệm,

chó được loại mà không cần lưu giữ, không cần giữ gìn sức khoẻ cho con vật

Những thử nghiệm sinh khả dụng và tương đương sinh học với thiết kế chéo, thử nghiệm được thực hiện lại trên chính đối tương đó để giảm mức độ sai khác cá thể, giữa 2 lần thử nghiệm cần khoảng thời gian rửa giải để cơ thể con vật thải trừ hết thuốc cũ Do vậy, quá trình thí nghiệm phải cố gắng giữ cho con vật vẫn được khoẻ mạnh, có khả năng lưu giữ đến thử nghiệm của giai đoạn sau Đối với giống chó ta,

những thí nghiệm kiểu này chưa được áp dụng thử nghiệm nhiều Hơn nữa, giống chó

ta thường được nuôi để giữ nhà nên dữ, khó thao tác Nếu muốn sử dụng làm thí nghiệm cần có dụng cụ bắt, nuôi giữ, cố định phù hợp, đảm bảo an toàn cho kỹ thuật viên Ngoài ra, việc chăm sóc, nuôi giữ cũng cần phải xem xét trong một điều kiện thích hợp, khả thi

Củng thời gian chúng tôi thực hiện đề tài, trường Đại học Dược cũng đã sử dụng động

vật trong một số nghiên cứu TĐSH Một số ít sử dụng thỏ, một số khác dùng chó, nhưng do kỹ thuật và điều kiện nuôi giữ không đâm bảo nên rất khó khăn khi thực hiện thiết kế thử nghiệm chéo Đôi khi con vật bị chết trước khi thử nghiệm giai đoạn hai

3, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thiết kế nghiên cứu

3.1.1 Nghiên cứu khảo sát sơ bộ phương pháp phân tích

Dựa vào các tài liệu tham khảo, chúng tôi thực hiện khảo sát 3 phương pháp chiết suất norfioxacin từ mẫu thử, Mẫu thử được sử dụng là mẫu huyết tương và nước tiểu

- Phương pháp chiết xuất

+ Phương pháp tạo tủa protein

+ Phương pháp chiết lỏng — lỏng với dung môi hữu cơ

+ Phương pháp chiết pha rắn

- Phương pháp định lượng: Khảo sát định lượng bằng HPLC bằng thực nghiệm để xác địnhc ác điều kiện phân tích

3.1.2 Thẩm định phương pháp phân tích

Đánh giá phương pháp phân tích theo các chỉ tiêu qui định của Dược điển [6] áp dụng cho các phép phân tích trong dịch sinh học Những chỉ tiêu bao gồm:

- Tính đặc hiệu của phương pháp

- Đường chuẩn và khoảng tuyến tính

- Độ chính xác (độ lặp lại trong ngày và khác ngày)

- Độ đúng (% tìm lại thấy)

- Giới hạn định lượng

- Độ ổn định của mẫu thử

3.1.3 Khảo sát khả năng dùng chó ta trong nghiên cứu đánh giá TĐSH

- Phương pháp thí nghiệm trên chó ta trong điều kiện phòng thí nghiệm Việt Nam

- Khảo sát tính ốn định đáp ứng của động vật thí nghiệm với khả năng hấp thu

3.2 Chọn mẫu, cỡ mẫu và đối tượng nghiên cứu

+ Mẫu huyết tương người sau khi uống viên nén Noroxin 400mg (mẫu lấy từ một nghiên cứu khác của chúng tôi [8])

- Nước tiểu:

+ Nước tiểu trắng, thêm norfloxacin làm mẫu tự tạo để khảo sát phương pháp + Nước tiểu của người sau khi uống viên nén norfloxacin 400mg, lấy trong vòng 12 giờ sau khi uống (mẫu lấy từ một nghiên cứu khác của chúng tôi [8])

- Mẫu động vật dùng trong khảo sát là chó nhà (Canis familiaris L.), khỏe mạnh, màu vàng hoặc đen, chân ngắn, mõm ngắn, 1 — 2 năm tuổi, cân nặng khoảng 10 + 2 kg

3.2.2 Cỡ mẫu: Với các mẫu phân tích, số mẫu thử được dùng để khảo sát là 5 — 6 Với mẫu động vật (chó) dùng để khảo sát khả năng đáp ứng được dùng là 12, chia làm 2 nhóm, mỗi nhóm 6

3.2.3 Đối tượng nghiên cứu

- Dùng Norfloxacin chuẩn làm việc của Viện Kiểm nghiệm

- Mẫu viên nén Noroxin (viên nén norfloxacin 400mg), Số lô.: HW 02720, NSX:

03/2004, HD: 03/2007; Số đăng ký: VN - 6651-02 Nhà sản xuất: Merck Sharp & Dohme B.V Day la thuéc sang chế của dược chất norfloxacin

14

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.7 Chỉ tiêu nghiên cứu

- Phương pháp chiết xuất phải đảm bảo có khả năng tách được dược chất (norfloxacin)

ra khỏi dịch sinh học, ổn định, lặp lại, hiệu xuất cao, thời gian chiết ngắn, chỉ phí thấp

- Phương pháp định lượng phải đáp ứng các chỉ tiêu theo qui định trong các tài liệu về phân tích Ngoài ra phương pháp phải khả thi trong điều kiện phòng thí nghiệm của

Việt Nam hiện tại và trong tương lai gần Thời gian phân tích không kéo dài quá để

phù hợp với yêu cẩu trong phân tích đánh giá TĐSH, vì số lượng mẫu lớn và yêu cầu

về tính thời gian (cần phân tích nhanh sau khi lấy mẫu)

+ Tính đặc hiệu: phải chứng minh được rằng chất xác định được là dược chất hay chất chuyển hoá có tác dụng Sự phân tích mẫu không bị ảnh hưởng bởi các chất nội sinh và chất chuyển hoá có liên quan Báo cáo kết quả phải bao gồm cả sắc ký đồ của mẫu trắng (dịch sinh học), mẫu chất chuẩn pha trong dịch sinh học và mẫu thử thu được sau khi dùng thuốc

+ Đường chuẩn và khoảng tuyến tính: Mối quan hệ giữa đáp ứng với nồng độ của chất phân tích phải được đánh giá bằng phương trình hồi quy, thu được bằng phương pháp phân tích hồi quy (như phương pháp bình phương nhỏ nhất) Khoảng tuyến tính

là khoảng nồng độ từ thấp nhất đến cao nhất trong một đường chuẩn Trong khoảng này, phép phân tích phải thoả mãn các yêu cầu về độ đúng và độ chính xác theo qui

định

Đường chuẩn nên có ít nhất 5 nồng độ của chất chuẩn pha trong cùng một mẫu dịch sinh học Khoảng tuyến tính phải bao gồm toàn bộ khoảng nồng độ của các mẫu cần phân tích Không xác định nồng độ mẫu thử dựa trên điểm ngoại suy của khoảng tuyến tính

Thông thường, nồng độ tối đa khảo sát phải lớn hơn giá trị Cmax đã ghi trong các tài

liệu tham khảo (2mcg/ml) Trong trường hợp này, do giá trị Cmax trên chó có thé cao hơn so với giá trị Cmax trên người, nên chỉ tiêu giá tri cao nhất là 8mcg/ml Nồng độ

thấp nhất là giới hạn định lượng, thông thường được tính ít nhất phải bằng 1/20 — 1/10 giá trị Cmax, chỉ tiêu (0.1mcg/ml - 0,2mcg/ml) Trong khoảng nồng độ cần khảo sát, đường chuẩn phải tuyến tính và có hệ số tuyến tính ít nhất R = 0,998

+ Độ đúng và độ chính xác: được xác định cùng lúc bằng cách sử dụng 3 nồng

độ của mẫu cần kiểm tra, 1 nồng độ gần với giới hạn nhỏ nhất của phương pháp định lượng (LOQ); 1 nềng độ gần với điểm giới hạn trên của đường chuẩn và 1 nồng độ ở gần điểm giữa Mỗi nồng độ phải được xác định trên ít nhất 5 mẫu

Độ đúng có thể được biểu thị là độ lệch chuẩn tương đối (RSD) trong ngày và giữa các ngày, được xác định trên mẫu chuẩn đối chứng RSD khoảng 15%, riêng điểm gần giới hạn định lượng cho phép không vượt quá 20%,

Độ chính xác được biểu thị là khả năng tiến tới gần nồng độ thực nhất của chất phân tích trong mẫu sinh học Điều đó có thể được biểu thị bằng khả năng tìm lại tương đối, và phải nằm trong khoảng 85-115%, nhưng có thé chấp nhận 80-120% đối với điểm gần giới hạn định lượng Độ đúng cũng cần xác định ít nhất ở 2 khoảng nồng

độ, thấp nhất và cao nhất

+Giới hạn định lượng: Giới hạn định lượng, hay còn gọi là độ nhạy, là nồng độ thấp nhất của đường chuẩn có thể xác định được với độ đúng và độ chính xác cho phép Giới hạn định lượng ít nhất phải thoả mãn khả năng phân tích nồng độ của mẫu thử lấy ở thời điểm bằng 3-5 lần thời gian bán thải hoặc bằng 1/10 đến 1/20 giá trị

Cmax của norfloxacin

+ Độ ổn định của mẫu thứ Độ ổn định của mẫu sinh học có chứa norfloxacin cần được khảo sát khi bảo quản ở nhiệt độ phòng, đông lạnh trong khoảng thời gian khác nhau để xác định điều kiện bảo quản và thời gian bảo quản mẫu sau khi lấy Theo điều kiện hiện tại của phòng thí nghiệm, mẫu sinh học có chứa norfloxacin sẽ được đánh giá độ ổn định ở điều kiện bảo quản là - 20°C trong 30 ngày

- Thí nghiệm trên động vật: động vật dễ kiếm, thao tác được, an toàn cho kỹ thuật

viên Có khả năng nuôi giữ, chăm sóc trong điều kiện thí nghiệm Thí nghiệm phải đảm bảo tình trạng sức khoẻ giữa 2 lần thử nghiệm tương tự nhau, có nghĩa là động vật vẫn khoẻ mạnh sau giai đoạn 1 và được tiếp tục sử dụng trong giai đoạn 2

3.3.2 Phương pháp xác định các chỉ tiêu nghiên cứu

3.3.2.1 Khảo sát phương pháp phân tích

Tự tạo các mẫu thử sinh học bằng cách cho một lượng chất chuẩn Norfloxacin vào huyết tương trắng, sau đó tiến hành khảo sát các phương pháp tách norfloxacin

- Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng norfloxacin bằng sắc ký lỏng hiệu

năng cao Xác định các điều kiện phân tích: cột phân tích, dung môi pha động, phát hiện, thời gian phân tích Dùng phương pháp phân tích sơ bộ để định lượng xác định

nồng độ thuốc trong các mẫu Sơ bộ đánh giá hiệu xuất tách, thu hổi

- Các phương pháp chiết tách thông thường được áp dụng để khảo sát:

+ Loại tủa protein bằng methanol/ acetonitril và acid percloric Khảo sát tỷ lệ các chất tạo tủa Phương pháp này áp dụng cho mẫu thử là huyết tương

+ Chiết xuất lỏng — lỏng: khảo sát để lựa chọn một dung môi hữu cơ để tiến

hành chiết norfloxacin từ huyết tương và nước tiểu

+ Chiết pha rắn (rắn — lỏng): đây là một kỹ thuật chiết tách có ưu thế trong phân tích các mẫu thử có nồng độ thấp Lựa chọn loại cột thích hợp và dung môi rửa giải, dung môi loại tạp phù hợp để áp dụng vào qưi trình chiết Kỹ thuật chiết pha rắn được áp dụng để khảo sát khả năng chiét norfloxacin trong huyết tương

và nước tiểu

16

So sánh và lựa chọn phương pháp chiết có hiệu suất cao, phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm nhất để tiến hành đánh giá phương pháp

3.3.2 2 Đánh giá phương pháp

Đánh giá theo các chỉ tiêu Tiêu chuẩn được chấp nhận:

- Tính đặc hiệu: Bằng thực nghiệm, điều chỉnh và lựa chọn các điều kiện xử lý mẫu, định lượng sao cho pic của norfloxacin trên sắc đổ thu được phải nằm riêng rẽ, tách

riêng với các pic tạp khác có trong mẫu huyết tương trắng Có nghĩa là, việc nhận diện

norfloxacin không bị ảnh hưởng bởi các chất khác có trong mẫu thử Báo cáo kết quả

sẽ bao gồm cả sắc ký đồ của mẫu trắng (dịch sinh học), mẫu chất chuẩn pha trong dịch sinh học và mẫu thử thu được ở người tình nguyện sau khi dùng thuốc

- Đường chuẩn và khoảng tuyến tính: Chuẩn bị một dãy dung dịch chuẩn pha trong

huyết tương trắng có các nồng độ từ thấp đến cao Đánh giá sự đáp ứng với nồng độ của norfloxacin bằng phương trình hồi quy, bằng phương pháp phân tích hổi quy (như phương pháp bình phương nhỏ nhất) Khoảng tuyến tính là khoảng nồng độ từ thấp nhất đến cao nhất trong một đường chuẩn

Đường chuẩn nên có ít nhất 5 nồng độ của chất chuẩn pha trong cùng một mẫu dịch sinh học Xác định độ tuyến tính trong khoảng nồng độ khảo sát

- Độ đúng và độ chính xác: Độ đúng và độ chính xác được xác định cùng lúc bằng cách sử dụng 3 nồng độ của mẫu cần kiểm tra, 1 nồng độ gần với giới hạn nhỏ nhất của phương pháp định lượng (LOQ); 1 nồng độ gần với điểm giới hạn trên của đường chuẩn và 1 nồng độ ở gần điểm giữa Mỗi nồng độ phải được xác định trên ít nhất 5 mẫu

Với độ chính xác, xác định bằng phương pháp "thêm", tức là thêm chính xác một lượng chuẩn đã biết trước nồng độ vào một mẫu thử pha trong dịch sinh học (tổng

lượng norfloxacin thêm vào và lượng có trong mẫu "thử' giả định phải nằm trong khoảng nồng độ khảo sát Tiến hành xử lý mẫu và định lượng các mẫu đã chuẩn bị theo qui trình phân tích đã chọn, tính kết quả Kết quả được biểu thị bằng khả năng tìm lại tương đối, và phải nằm trong khoảng 85-115%, nhưng có thể chấp nhận 80 - 120% đối với điểm gần giới hạn định lượng

Độ đúng (xác định độ lặp lại): biểu thị là độ lệch chuẩn tương đối (RSD) trong ngày và

giữa các ngày, được xác định trên mẫu chuẩn đối chứng Nói chung, RSD không nên

vượt quá 15%, riêng điểm gần giới hạn định lượng cho phép không vượt quá 20%

Chuẩn bị ít nhất 3 mẫu thử có nồng độ khác nhau (cao nhất, trung bình và thấp nhất) Tiến hành xử lý mẫu và định lượng các mẫu đã chuẩn bị theo qui trình phân tích đã chọn, mỗi mẫu làm lặp lại ít nhất 5 lần, tính kết quả Làm như vậy trong 1 ngày và tiến hành tương tự trong ít nhất 5 ngày khác nhau Tính độ lặp lại của các kết quả định

lượng

- Giới hạn định lượng: Giới hạn định lượng là nồng độ thấp nhất của đường chuẩn có

thể xác định được với độ đúng và độ chính xác cho phép Giới hạn định lượng ít nhất

phải thoả mãn khả năng phân tích nồng độ của mẫu thử lấy ở thời điểm bằng 3-5 lần

thời gian bán thải hoặc bằng 1/10 đến 1/20 giá trị Cmax của norfloxacin

- Độ ổn định của mẫu thử Độ ổn định của mẫu sinh học có chứa norfloxacin cần được khảo sát khi bảo quản đông lạnh trong khoảng thời gian khác nhau để xác định điều kiện bảo quản và thời gian bảo quản mẫu sau khi lấy Theo điều kiện hiện tại của

phòng thí nghiệm, mẫu sinh học có chứa norfloxacin sẽ được đánh giá độ ổn định ở

điều kiện bảo quản: - 20°C trong 30 ngày

3.3.2.3 - Khảo sát tính ổn định đáp ứng của chó nhà với khả năng hấp thu:

Tiến hành như một thử nghiệm đánh giá TĐSH trên động vật thí nghiệm Thiết kế chéo, mù đơn, 2 giai đoạn Sử dụng 1 mẫu thử nhưng cho uống lặp lại chính mẫu thử

đó trong giai đoạn 2 nhằm đánh giá tính ổn định hấp thu của giống chó nhà Lấy mẫu

máu chó tại các thời điểm trước khi cho uống thuốc và 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3; 4; 6; 8;

12; 24 và 30 giờ sau khi uống thuốc Thời gian nghỉ giữa 2 giai đoạn là 1 tuần

Các mẫu máu được tách lấy huyết tương càng sớm càng tốt và bảo quản ở ~ 20°C cho đến khi phân tích Thời gian bảo quản chờ phân tích tuỳ thuộc vào kết quả nghiên cứu

độ ổn định đã khảo sát để đảm bảo mẫu thử được phân tích khi chưa bị ảnh hưởng Định lượng các mẫu huyết tương chó bằng phương pháp phân tích đã được thẩm định Mỗi mẫu thử có thể phân tích 1 lần hoặc lặp lại khi cần kiểm tra Mẫu của mỗi cá thể (chó), được bố trí định lượng đồng thời trong một lần phân tích, thiết lập một đường chuẩn mới để phân tích song song trong cùng điều kiện

Phân tích các thông số dược động học để so sánh với kết quả nghiên cứu trên người (từ một nghiên cứu khác) nhằm đưa ra nhận xét và đề xuất khả năng áp dụng

3.3.3 Các công cụ nghiên cứu cụ thể

Mẫu thử dùng trong nghiên cứu

- Chuẩn Norfloxacin có số kiểm soát 010203

- Mẫu thử: Noroxin (viên nén norfloxacin 400mg), Số lô.: HW 02720, NSX: 03/2004, HD: 03/2007; Số đăng ký: VN — 6651-02

Huyết tương dùng trong nghiên cứu:

- Dùng huyết tương trắng của người: huyết tương mua của Viện Huyết học và Truyền máu Trung ương Chọn các lô huyết tương không có nhiều pic lạ rải rác trong khoảng

thời gian 4 — 10 phút

18

- Huyết tương của chó trước khi cho uống thuốc (huyết tương trắng)

- Huyết tương của người sau khi cho uống viên Noroxin 400mg

- Huyết tương của chó sau khi cho uống viên Noroxin 400mg

Dụng cụ hoá chất dùng trong nghiên cứu phương pháp chiết xuất và định lượng

- Thiết bị phân tích: Máy sắc ký lỗng hiệu năng cao Merck — Hitachi, detector diod —

aray

- Dung môi, hoá chất:

+ Methanol, acetonitril loại dùng cho sắc ký;

+ Acid tricloroacetic, acid formic, acid percloric , acid phosphoric

+ Kali dihydro phosphat

Tất cả các loại dung môi, hoá chất đều đạt loại tinh khiết phân tích

- Cột chiết pha rắn các loại

+ Cột LiChrolut EN (C18 polymeric Sorbent2, 200mg/ 3ml)

+ Cột Strata (C18, 200mg/ 3ml)

+ Cdt LiChrolut TSC (Mixed mode, 300mg/ 3ml)

Nguyên vật liệu dùng trong nghiên cứu ứng dụng phương pháp

- Động vật thí nghiệm: giống chó nhà, màu vàng hoặc đen, chân ngắn, mõm trung

bình, khỏe mạnh, cân nặng khoảng 10 + 2kg, cả 2 giống

- Chuồng nhốt, bàn cố định chó;

- Các dụng cụ tiểu phẫu, kim và bơm tiêm dùng trong lấy mẫu máu

- Máy ly tâm để tách huyết tương

- Tủ bảo quản mẫu 6 — 20°C

3.4 Phương pháp xử lý số liệu

Các số liệu được xử lý thống kê theo qui định:

- _ Giá trị trung bình, độ lệch chuẩn (SD), độ lệch chuẩn tương đối (RSD), khoảng tin cậy, phương trình hồi qui, hệ số tương quan hồi qui xác định bằng chương trình phần mềm Excel 2000

- _ Các thông số dược động học: Cmax, Tmax lay trực tiếp từ số liệu thực nghiệm,

sau đó tính giá trị trung bình cho mỗi “mẫu thuốc"; đường cong dược động học (AU©) tính theo phương pháp hình thang, dựa trên nồng độ thuốc đo được theo thời gian theo hướng dẫn tính thống kê trong dược học [27]

Thống kê đánh giá TĐSH: dùng phương pháp hai test t một phía (two one - side

tests) để so sánh thông số InAUC, LnCmax của mẫu thử giả định với độ tinh

cậy 90% (P= 0,10) Phương pháp cho phép so sánh tỷ số 2 giá trị trung bình, từ

đó tính được giới hạn trên và dưới của khoảng tin cậy Chỉ tiêu đánh giá tương

tự như trong đánh giá TĐSH qui định trong dược điển Mỹ Hai mẫu thử được coi

là tương đương sinh học khi tỷ số các giá trị trung bình của Cmax và AUC (đã

chuyển đổi logarit) nằm trong khoảng 0,8 — 1,25

20

4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

4.1 Xây dựng phương pháp phân tích

4.1.1 Khảo sát và xây dựng phương pháp định lượng

4.1.1.1 Phân tích norfloxacin trong huyết tương

- Mẫu trắng : Huyết tương trắng không có chứa norfloxacin

- Mẫu thử: Huyết tương người tình nguyện sau khi uống norfloxacin

- Xử lý mẫu -

Khảo sát trên ba kỹ thuật xử lý mẫu trong các phương pháp phân tích dịch sinh học: + Tủa protein: bằng acid, dung môi hữu cơ hoặc muối vô cơ)

+ Chiết lỗng — lông: dung môi hữu cơ thích hợp

+ Chiết pha rắn: khảo sát trên 3 loại cột (pha tĩnh)

Trong ba kỹ thuật, tủa protein là phương pháp đơn giản nhất, thời gian chiết nhanh hơn nên được chọn để xử lý mẫu trong giai đoạn thăm dò phương pháp phân tích

- Tiến hành: Lấy 1,0 mì mẫu chuẩn/ mẫu thử hoặc mẫu trắng (huyết tương) Thêm 0,5 mi

acid perchloric (1/5), vortex 30 giây, ly tâm 15.000 vòng/phút x 10 phút Lấy dịch nổi, lọc qua giấy lọc 0,45um Dùng dung dịch này để chạy sắc ký

- Xác định điều kiện sắc ký

Tiến hành sắc ký trên hệ thống sắc ký HPLC Merck — Hitachi (D-7000 Interface, L-

7100 pump, L-7455 Detector Diode Array) với các điều kiện sắc ký khác nhau:

+ Cột phân tích: Khảo sát trên ba loại cột pha đảo C18 hoặc C8 của các hãng

khác nhau: Merck (LiChrospher 250 x 4,6mm, 5um), Inertsil (ODS 2 150 x 4,6mm;

5um) va Alltech (Altima 250 x 4,6mm)

+ Nhiệt độ cột: thay đổi từ nhiệt độ phòng đến 50°%C

+ Pha động: khảo sát trên các pha động là dung dịch đệm acetat, đệm

phosphat có thành phần, tỷ lệ và pH khác nhau

+ Thể tích tiêm mẫu: từ 20 - 100ul

Bằng thực nghiệm, lựa chọn để thu được điều kiện sắc ký đáp ứng yêu cầu của phép phân tích, Điều kiện sắc ký đã chọn lựa được như sau:

+ Cột : Altima C18, 5um, 250 x 4mm Nhiệt độ cột ; 40°C

+ Pha động : MeCN - MeOH - Đệm phosphat pH 3.0 - Acid tricloracetic 0,5%, tỉ

lệ 5: 18:72: 5 (WAN)

+ Tốc độ dòng: 1,25 ml/phút

+ Detector : ở 278nm

+ Thể tích tiêm mẫu : 1001

Sắc ký đồ của mẫu chuẩn và huyết tương trắng được trình bày ở hình 1 và 2,

Narain Vil | Blank «Best Crom

Coren: Daa Paty: CSWINDLAPPHISM Resear DAT AGE (01

Da Desc DAD Exyaced Bes Coromatogran

W@Wehrl InRubtrl tkNmeilai

eter sos Tome [xin

Hình 1: Sắc ký đồ huyết tương trắng Hình 2' Sắc ký đồ mẫu chuẩn (nồng

độ ~ 1ug/ml)

Khi tăng tỉ lệ MeOH trong pha động, thời gian lưu (tạ) của norfloxacin giảm và

không tách khỏi các pic tạp có trong mẫu trắng Khi tăng tỉ lệ MeCN trong pha động, pic norfloxacin bị doãng và mức độ đáp ứng giảm Phối hợp T.E.A và T.B.A.H với tỈ lệ thích

hợp trong pha động (có trong thành phần của đệm phosphat pH 3,0) làm cho pic norfloxacin can déi (W,, = 0,1527 phút, Asym = 1,0216, N > 8500); Với sự có mặt của acid tricloracetic, mức đệ đáp ứng của pic norfloxacin tăng lên

22

Norfloxacin là một dược chất khi vào cơ thể được chuyển hoá khá nhiều, có tới 6 chất chuyển hoá vì vậy để kiểm tra xem điều kiện sắc ký đã được lựa chọn có khả năng phan tach norfloxacin khỏi các chất chuyển hoá hay không Chúng tôi tiến hành khai triển sắc ký với mẫu thử là huyết tương NTN có sử dụng norfloxacin Kết quả cho thấy, với điều kiện sắc ký mà chúng tôi lựa chọn phù hợp với cả loại mẫu huyết tương lấy từ

người tình nguyện sau khi uống viên nén Noroxin (hình 3) Pic của norfloxacin tách riêng khỏi các pic tạp khác có trong mẫu thử

Do vậy, điều kiện sắc ký này được sử dụng để tiếp tục khảo sát phương pháp định lượng norfloxacin trong nước tiểu, trong khảo sát phương pháp chiết tách xử lý mẫu

cũng như trong thẩm định phương pháp phân tích

4.1.1.2 Phân tích norfloxacin trong nước tiểu

Mẫu chuẩn: Lấy một thể tích xác định dung dịch chuẩn gốc, bốc hơi dung môi thu lấy cắn (nhiệt độ 50°C, khí N;) Hòa tan cắn trong nước tiểu trắng (vortex 2500 vòng/ phút

x 10 phút) để được dung dịch chuẩn có nồng độ xác định

Mẫu trắng: Nước tiểu của người tình nguyện khoẻ mạnh bình thường, không sử dụng

Mẫu thử : Mẫu nước tiểu của người sau khi uống norfloxacin, lấy trong vòng 24 giờ

Xử lý mẫu nước tiểu để tiêm vào hệ thống sắc ký theo ba phương pháp: pha

- loãng, chiết lỏng — lỏng và chiết SPE

+ Pha loãng: 1 ml nước tiểu + 9 mi pha động Lọc qua màng lọc có kích thước

lỗ lọc 0,45um Dùng dịch lọc để chạy sắc ký

+ Chiết lổng — lổng: 1 ml nước tiểu, điều chỉnh đến pH phù hợp với điều kiện chiết Chiết với dung môi hữu cơ (xem phần 4.1.2.2) Bốc hơi dụng môi thu cắn (50°C, thổi khí nite) Hoà tan cắn trong 1 ml pha động Lọc qua màng lọc có kích thước lỗ lọc 0,45um Dùng dịch lọc để chạy sắc ký

+ Chiết SPE: Chuyển 1ml nước tiểu lên cột chiết SPE phù hợp đã được hoạt hoá Rửa giải norfloxacin lưu giữ trên cột SPE bằng hệ dung môi thích hợp (xem phần 4.1.2.3) Bốc hơi dung môi thu cắn (40°C, thổi khí nitơ) Hoà tan cắn trong 1 ml pha động Lọc qua màng lọc có kích thước lỗ lọc 0,45um Dùng dịch lọc để chạy sắc ký Điều kiện sắc ký : Áp dụng điều kiện sắc ký đã thăm dò ở trên để đánh giá khả năng định lượng norfloxacin trong nước tiểu (có điều chỉnh để phù hợp với loại mẫu) Khai triển sắc ký các mẫu nước tiểu trắng, chuẩn và thử đã được xử lý theo ba phương pháp pha loãng, chiết lỏng — lỏng, chiết SPE, kết quả thu được như sau:

+ Với mẫu nước tiểu xử lý bằng phương pháp pha loãng, khi khai triển sắc ký không tách được norfloxacin khỏi các thành phần tạp có trong mẫu (hình 4 và 5), thời gian lưu của norfioxacin khoảng 7 phút Vì vậy không thể sử dụng điều kiện sắc ký đã nêu ở trên để xác định nồng độ norfloxacin có trong nước tiểu khi chỉ sử lý mẫu bằng phương

Tneensey

norfloxacin khoảng 5 — 6 phút và norfloxaoin được tách khỏi các thành phần tạp có

trong mẫu (hình 6,7,8 và 9) Vì vậy có thể sử dụng điều kiện sắc ký như đã nêu trên

để xác định nồng độ Norfloxacin có trong mẫu nước tiểu khi xử lý mẫu bằng phương

pháp chiết lỏng — long hoặc chiết SPE phù hợp

Recencion Time {mis} Retention Time (min)

Hình 4: Sắc ký đồ mẫu nước tiểu trắng Hinh 5: Sdc ky d6 mau norfloxacin chuén

xử lý bằng phương pháp pha loãng trong nước tiểu trắng, xử lý mẫu bằng

phương pháp pha loãng

25

phương pháp chiết SPE

Kết quả khảo sát cho thấy với điều kiện sắc ký mà chúng tôi đã thực nghiệm cho phép tiến hành định lượng Norfloxacin có trong huyết tương và Norfloxacin trong nước tiểu khi xử lý mẫu theo phương pháp chiết lỗng — lổng hoặc chiết SPE

Kết luận: _Từ những kết quả khảo sát trên thực nghiệm, chúng tôi quyết định chọn các phương pháp khảo sát như sau:

-_ Khảo sát xử lý mẫu bằng 3 kỹ thuật:

+ Kết tủa protein (áp dụng cho mẫu huyết tương) + Chiết lỏng —- lỏng: khảo sát với cả 2 loại mẫu: huyết tương và nước tiểu

+ Chiết pha rắn: khảo sát với cả 2 loại mẫu huyết tương và nước tiểu

- _ Điều kiện sắc ký dùng để định lượng:

+ Cột : Altima C18, 5um, 250 x 4mm Nhiệt độ cột : 405C

+ Pha động: MeCN - MeOH - Đệm phosphat pH 3.0 - Acid tricloracetic 0,5%, tỉ lệ 5 : 18 : 72 : 5 (v/v/V/)

+ Tốc độ dòng: 1,25 mi/phut

+ Detector : ở 278nm

+ Thể tích tiêm mẫu : 100ul

26

4.1.2 Khảo sát phương pháp chiết xuất

4.1.2.1 Phương pháp tạo tủa protein

Mẫu chuẩn: Lấy một thể tích xác định dung dịch chuẩn gốc, pha loãng trong pha động

để có mẫu chuẩn có nồng độ xác định Mẫu chuẩn này được dùng trong định lượng và khảo sát chọn cột và chọn dung môi

Mẫu trắng: Huyết tương của người tình nguyện khoẻ mạnh bình thường, không sử dụng thuốc Norfloxacin

Mẫu thử tự tạo: Lấy một thể tích xác định dung dịch chuẩn gốc, bốc hơi dung môi thu lấy cắn (nhiệt độ 50°C, khí N;) Hòa tan cắn trong huyết tương trắng (vortex 2500 vòng/ phút x 10 phút) để có mẫu thử tự tạo có nồng độ đã biết tương tự nồng độ của

dung dịch chuẩn Những mẫu này được dùng trong đánh giá hiệu suất chiết

Qui trình xử lý mẫu huyết tương

Tủa protein theo ba kỹ thuật:

+ Tủa bằng acid: Khảo sát với 2 loại acid: acid tricloacetic, acid percloric với các

tỷ lệ khác nhau

+ Tủa bằng dung môi hữu cơ: Khảo sát với 2 loại dụng môi: methanol,

acetonitril với các tỷ lệ khác nhau

+ Tủa bằng muối: amoni sulphat khan

Qui trình xử lý mẫu nói chung được tiến hành như sau: Lấy 1ml mẫu huyết tương Thêm tác nhân gây tủa Lắc, trộn đều bằng cách vortex trong 5 phút Ly tâm ở tốc độ

cao (15000 vòng/ phút) trong 10 phút Thu dịch nổi, lọc qua giấy lọc 0,45um Dịch lọc

dùng để chạy sắc ký Riêng mẫu chiết với dung môi hữu cơ, loại dung môi hữu cơ trong dịch nổi sau khi ly tâm bằng cách để trên cách thuỷ ở 50°C, dưới luồng khí nitơ

trong 30 phút

Qui trình chiết được tóm tắt qua sơ đồ 1

Triển khai sắc ký, theo điều kiện đã được lựa chọn Đánh giá các quí trình xử lý mẫu dựa trên các sắc ký đổ (hình dạng pic và kha nang tach norfloxacin khỏi các tạp có trong mẫu)

và khả năng áp dụng của các kỹ thuật, chúng tôi thu được kết quả như sau:

+ Với kỹ thuật tủa protein bằng acid: Chỉ cần một thể tích nhỏ (tỷ lệ 4:1) dung dịch acid cũng có thể tủa được protein có trong mẫu thử, dịch lọc thu được trong Khi tiêm dịch lọc vào cột sắc ký, áp suất của cột ít bị thay đổi (< 20 bar) Trên sắc ký đồ thu được cho thấy, norrfloxacin tách được khỏi các thành phần tạp (hình 10, 11)

Mẫu thử

(im)

Acid percloric 1/10 Methanol/ Acetonitril Amoni sulphat

Ly tam Ly tam Ly tam

| 2, 2, Ỷ 2,

Loại dung môi

Sơ đồ 1: Các bước xử lý mẫu bằng phương pháp tạo tủa

Khảo sát tủa protein bằng một số loại acid với thành phần và tỷ lệ khác nhau kết quả cho thấy:

-_ Sắc đồ của mẫu xử lý bằng acid trifloacetic có đường nền thường bị âm;

- _ Sắc đồ của mẫu xử lý bằng acid tricloacetic có thời gian lưu của norfloxacin thay đổi theo hướng làm giảm khả năng phân tách của norfloxacin

Do đó chúng tôi lựa chọn acid percloric làm tác nhân gây tủa trong sử lý mẫu

Khảo sát tỷ lệ acid dùng để xử lý mẫu thử, kết quả cho thấy với 1ml huyết tương (mẫu chuẩn, thử hoặc trắng), dùng 0,25 ml acid percloric 1/10 (v4) là đáp ứng yêu cầu đủ để

tạo tủa Hơn nữa, với tỷ lệ này dịch lọc thu được với số lượng đủ lớn để tiêm sắc ký Khi

tiêm áp suất của cột ổn định, trên sắc đồ norfloxacin tách khỏi các thành phần tạp có trong mẫu

28

mẫu Kết quả xác định % tìm lại hoạt chất được ghi trong bảng 1

Kết quả cho thấy qui trình sử lý mẫu mà chúng tôi sử dụng có tỷ lệ % tìm lại hoạt chất tốt,

trung bình ~ 100%, với RSD < 10 % Vì vậy có thể áp dụng qui trình này để xử lý mẫu khi

định lượng norfloxacin trong huyết tương

+ Với kỹ thuật tủa protein bằng dung môi hữu cơ: dịch lọc thu được khi tiêm vào hệ

thống sắc ký ít gây ra sự thay đổi áp suất của cột phân tích Sắc ký đồ thu được cho thấy

có khả năng tách norfloxacin khỏi các thành phần tạp có mặt trong mẫu thử Tuy nhiên, tỷ

lệ dung môi dùng so với mẫu thử thường lớn (> 2:1) và tủa không hoàn toàn

29

Bảng 1: Tỷ lệ thu hồi norfloxacin của qui trình xử lý mẫu tủa protein bằng acid percloric

Kết luân: Đánh giá kết quả qua thực nghiệm, chúng tồi lựa chọn qui trình tủa protein bằng acid percloric (pha loang 1⁄10, tỷ lệ 0,25 ml cho † ml huyết tương) dùng cho xử lý mẫu huyết tương

4.1.2.2 Phương pháp chiết lồng — lỏng

Khảo sát phương pháp chiết trên hai loại mẫu: huyết tương và nước tiểu

Mẫu chuẩn: Lấy một thể tích xác định dung dịch chuẩn gốc, bốc hơi dung môi thu cắn (nhiệt độ 50°C, khí N;) Hòa tan cắn trong huyết tương trắng hoặc nước tiểu trắng (vortex 2500 vòng/ phút x 10 phút) để có mẫu chuẩn có nồng độ xác định

Mẫu trắng: Huyết tương, nước tiểu của người tình nguyện khoẻ mạnh bình thường, không sử dụng thuốc Norfloxacin

Mẫu thử tự tạo: Lấy một thể tích xác định dung dịch chuẩn gốc, bốc hơi dung môi thu lấy cắn (nhiệt độ 50°C, khí Nạ) Hòa tan cắn trong huyết tương hoặc nước tiểu trắng (vortex 2500 vòng/ phút x 10 phút) để có mẫu thử tự tạo có nồng độ đã biết tương

đương với nồng độ dung dịch chuẩn Những mẫu này được dùng trong đánh giá hiệu

ml dịch nổi, bốc hơi dung môi ở 50°C, dưới luồng khí Nitơ Hoà tan cắn thu được trong

1ml dung môi pha động Lọc qua màng lọc 0,45um Dịch lọc dùng để chạy sắc ký

Chú ý: Khi chiết với dung môi hữu cơ, dùng các ống nghiệm thủy tinh trưng tính, có nắp xoáy chịu được dung môi

Quá trình chiết xuất có thể tóm tắt trong sơ đồ 2

|

Ly tâm (4000 vòng/ phút x 10 phút)

Sơ đồ 2: Qui trình chiết lỗng — lỗng bằng các dung môi

Để đánh giá hiệu suất chiết (tỷ lệ % norfloxacin tìm lại) của mỗi qui trình chiết, tiến hành sắc ký theo điều kiện đã được lựa chọn trên các mẫu thử tự tạo có nồng độ

norfloxacin tương ứng là 2 và 10:g/ mÌ huyết tương; 5 và 20 u¡g/ mÍ nước tiểu Xác định nồng độ norfloxacin có trong các dung dịch chạy sắc ký So sánh lượng norfloxacin chiết được trong các mẫu thử tự tạo và lượng norfloxacin trong mẫu chuẩn tương ứng

32

pha trong pha động, xác định hiệu suất chiết của mỗi qui trình Kết quả khảo sát hiệu suất chiết của mỗi qui trình được trình bày ở bằng 2

Bảng 2: Hiệu suất chiết norfloxacin trong huyết tương bằng phương pháp lỗng - lỗng