Can we do better than Agrobacterium ? pdf

tumefaciens là loài vi khuẩn đất có khả năng chèn gene của mình vào thực vật và sau đó sử dụng bộ máy thực vật để biểu hiện các gene này dưới dạng hợp chất dinh dưỡng cho chúng.. Hơn th

Can we do better than

Agrobacterium ?

Các phương pháp để đưa gene mới vào tế bào thực vật có thể chia làm 2 loại: phương

pháp vật lý như bắn gen hay điện biến nạp

(electroporation) và phương pháp

tự nhiên, sử dụngAgrobaterium

Phát kiến về việc Agrobaterium

tumefaciens có khả năng chuyển

gene vào thực vật đã biến loài này trở thành một trong những công cụ quan trong nhất của Công nghệ

sinh học thực vật

A tumefaciens là loài vi khuẩn đất có

khả năng chèn gene của mình vào

thực vật và sau đó sử dụng bộ máy

thực vật để biểu hiện các gene này

dưới dạng hợp chất dinh dưỡng cho

chúng A tumefaciens sẽ tạo ra các

khối u thực vật gần điểm tiếp nối giữa

rễ và thân, gây ra những nốt sần ở cây (bệnh mụn cây-crown gall disease)

Thập kỷ 70 là thời gian của hàng loạt

nghiên cứu quan trọng về A

tumefaciens, tạo cơ sở cho phát minh

về chuyển gene thực vật sau này

Người ta phát hiện ra bộ gene của các

tế bào khối u ở thực vật có gắn 1 đoạn DNA từ vi khuẩn Hơn thế, các DNA được chuyển vào tế bào thực vật này

(gọi là T-DNA: tranferred DNA) là 1

phần của một phân tử DNA nhỏ nằm ngoài NST của vi khuẩn Phân tử

DNA vi khuẩn này được gọi

là Ti (tumor-inducing) plasmid (1,2)

Thực vật bị thương sẽ ứa ra các hợp chất phenol, kích thích sự biểu hiện

của gene vir(virulence gene) nằm trên Ti-plasmid (3).Gene vir mã hóa cho

các protein thực hiện việc cắt, chuyển

và gắn T-DNA vào genome thực

vật Một số gene nằm trên vùng

T-DNA có khả năng điều khiển sự tổng

hợp các hormone sinh trưởng như

auxin, cytokinin và phytohormones, dẫn đến sự phân bào nhanh chóng ở các tế bào chuyển gene (4), đây chính

là lý do tế bào phát triển thành khối u (hay nốt sần)

Đầu thập kỷ 80 có thể coi là "thời đại hoàng kim" của chuyển gen

bằng Agrobacterium khi người ta phát

hiện ra rằng:

- T-DNA, 1 đoạn của Ti plasmid, sẽ tạo ra khối u thực vật và sự phát triển của khối u này sau đó không phụ

thuộc vào sự có mặt của agrobacteria nữa

- T-DNA được xác định bởi 2 đầu

khoảng 25 bp gọi là vùng biên

(T-DNA borders), phần còn lại ngoài

vùng biên sẽ không có chức năng gì trong quá trình chuyển gene Nhờ vậy,

có thể loại bỏ khả năng gây hại của T-DNA bằng cách thay các gen tạo khối

u (oncogenes) nằm trong 2 đầu vùng biên bằng các gene mong muốn Khi các o ncogene bị loại bỏ, tế bào hoặc

mô thực vật chuyển gene sẽ phát triển bình thường và trong hầu hết các

trường hợp, cho cây hữu thụ (5,6)

- Các nghiên cứu về việc vận chuyển T-DNA vào tế bào thực vật trở nên dễ dàng hơn nhiều nhờ việc sử dụng các marker có thể chọn lọc và kiểm tra

được cho quá trình xác định tế bào

chuyển gen

Các nghiên cứu về Agrobactrium và

khả năng tự nhiên của chúng trong

việc biến đổi vật chất sinh học của các

tế bào thực vật bị nhiễm đã giúp các nhà khoa học thiết kế được những

phân tử giúp chuyển gene mong muốn vào tế bào thực vật Các phân tử DNA

kỹ thuật di truyền này được gọi chung

là các vector Một hệ thống chuyển

gen bằng Agrobacterium thuờng bao

gồm:

- Một chủng Agrobacterium mang

vùng vir và một T-DNA có chứa gen muốn chuyển Vùng vir và T-DNA có

thể nằm trên cùng 1 vector hoặc trên các vector riêng biệt

- T-DNA được chuyển vào tế bào

hoặc mô thực vật và sau đó được gắn vào genome thực vật

- Gene chuyển biểu hiện trong tế bào thực vật

- Các tế bào hoặc mô chuyển gene tái sinh thành cây hoàn chỉnh

Agrobacterium vẫn được coi là giống

vi khuẩn duy nhất có khả năng chuyển gene vào thực vật cho tới khi công

trình của Broothaerts và cộng sự được

công bố trên Nature tháng 2 năm

2005 (7) Trong thời gian làm việc tại Viện CNSH, công việc hàng ngày của tôi là chuyển gen, chuyển gen và

chuyển gen Thêm nữa hầu hết các

vector sử dụng đều

của CAMBIA (Center for the

Application of Molecular Biology to International Agriculture), vì vậy khỏi phải nói tôi đã hứng thú thế nào khi

có cơ hội tham dự buổi seminar của Richard A Jefferson, trưởng nhóm

nghiên cứu trên của CAMBIA, hỏi

han và trao đổi thêm với ông những ngày sau đó

Trước đây, người ta đã từng chuyển Ti-plasmid vào các vi khuẩn khác để xem thử nó có khả năng tạo khối u

hay không Khi được đưa vàoE

coli hay Pseudomonas aeruginosa,

Ti-plasmid không có khả năng tạo

khối u ở thực vật, nhưng khi được

chuyển vào các vi khuẩn có quan hệ

rất gần với Agrobacterium như họ

Rhizobiaceae, Ti-plasmid vẫn mang khả năng này (8) Tương tự như các kết quả đó, hệ thống chuyển gene nhờ

vi khuẩn hoạt động tốt nhất khi sử

dụng các vi khuẩn gần gũi

với Agrobaterium

Nhóm tác giả đã tạo ra được 1 hệ

thống chuyển gen ổn định cho 3 loài thực vật: thuốc lá, lúa

và Arabidopsis khi sử dụng 3 chủng

vi khuẩn thuộc 2 họ, Rhizobium sp

NGR234, Sinorhizobium

meliloti và Mesorhizobium loti Họ

thu được rất nhiều cây thuốc lá, 1 cây

lúa và một vài cây A thaliana chuyển

gene Kỹ thuật lai Southern cho thấy T-DNA đã được gắn vào genome cây thuốc lá khi sử dụng cả 3

chủng,A.thaliana và lúa khi sử

dụng Sinorhizobium Các cây này có

chứa 1-3 bản sao T-DNA và các phân tích ở thế hệ sau cho thấy sự di truyền

ổn định của gene GUS và kiểu hình

kháng hygromycin Để chứng tỏ rằng việc chuyển gene không phải do bị

nhiễm tế bào Agrobacterium(họ

chuyển gen cả bằng Agrobacterium để

so sánh), các thí nghiệm đối chứng đã được thiết lập bao gồm: PCR đặc hiệu

loài và sử dụng vector thứ cấp (tagged binary vector) (unpublished data)

Còn hiệu quả của hệ thống chuyển

gene này ra sao? Dựa trên số lượng

các điểmb-glucuronidase dương tính,

hiệu suất chuyển gene bằng các vi

khuẩn khác ở thuốc lá khoảng 10-30% (so với 95-100% khi sử dụng Agro), 0,6% ở lúa (so với 50-80% khi sử

dụng Agrobacterium), và ở A

thaliana, bằng 1/10 hiệu suất chuyển

gen nhờ Agrobacterium với cùng quy

trình Tuy nhiên, hiệu suất chuyển

gene này có thể được cải thiện bằng việc phối hợp các chủng vi khuẩn và loài thực vật hay loại tế bào sao cho phù hợp cũng như hiệu chỉnh điều

kiện nuôi cấy Ví dụ, hiệu suất này

được cải thiện rõ rệt ở lúa khi thay đổi môi trường ủ, ở thuốc lá khi thay đổi

tuổi mô và ở Arabidopsis khi thay đổi

môi trường ngâm để nhiễm hoa

với Sinorhizobium

Vậy ý nghĩa của công trình này là gì? Nhiều loại cây lương thực quan trọng rất khó chuyển gene

bằng Agrobaterium, khó tái sinh từ

những mô mẫn cảm hoặc dễ bị thay đổi kiểu hình và di truyền khi sử dụng

hệ thống chuyển gene này Chuyển

gene bằng Agrobacterium vào thực

vật đòi hỏi rất nhiều giấy tờ, chứng

chỉ phức tạp và hiện vẫn đang bị hạn chế ở rất nhiều nước Lý do chính

là Agrobacterium vẫn bị coi là nguồn

bệnh (pathogen) thực vật do đặc tính bám và lây nhiễm rất mạnh của

nó Agrobacterium gây ra các phản

ứng nhiễm bệnh điển hình ở thực vật, gây stress, chết hoại và các hậu quả di truyền khác cho cây Trong khi đó,

các vi khuẩn khác ở thực vật, bao gồm

cảSinorhizobium,

Rhizobium và Mesorhizobium tương

tác với các loại tế bào khác nhau, ở

các thời kỳ khác nhau, như những

sinh vật cộng sinh hay biểu sinh lành tính có thể gây ra các phản ứng khác nhau ở thực vật Nhờ vậy, chúng ta có thể dựa trên các kiểu tương tác đa

dạng khác nhau mà tìm ra phương

pháp chuyển gene thích hợp hơn cho các loài, các mô hay các loại tế bào

thực vật khó chuyển gene Và hơn hết, trái ngược với những đòi hỏi ngày

càng phức tạp phức tạp về việc cấp

phép, bản quyền khi sử hệ thống

chuyển gene bằngAgrobacterium, rào

cản lớn cho việc cộng tác nghiên cứu hay cho việc thương mại hóa các sản phẩm tạo ra nhờ nghiên cứu chuyển gene, công nghệ mới này được các

nhà khoa học ở CAMBIA cung cấp

hoàn toàn miễn phí dưới dạng nguồn

mở tại http://www.bios.net (9)

Tuy nhiên, công trình nghiên cứu này vẫn còn những tồn tại cần xem xét và giải quyết Như Mary-Dell Chilton đã

phân tích trên Nature

Biotechnology số tháng 3 năm 2005

(10): Về mặt ứng dụng, việc khai thác các vi khuẩn này trong dự án thực tế cho những loài cây lương thực khó

chuyển gene dường như không khả thi khi mà ở 2 loài cây 2 lá mầm "dễ"

chuyển nhất (thuốc lá và A.thaliana)

và loài cây 1 lá mầm dễ nhất (lúa),

hiệu suất chuyển gene vẫn thấp hơn

đáng kể so với sử dụng Agrobaterium

Chủng vi khuẩn hoạt động hiệu quả

nhấtRhizobium lại rất gần

với Agrobaterium như lời các tác giả

thừa nhận Điều này khiến người ta

đặt ra câu hỏi liệu chủng này có thật

sự khác biệt với Agrobacterium, đặc

biệt là khi vẫn còn đang tranh cãi về mặt phân loại của những thuật ngữ

này Do vậy, dường như có vẻ "an

toàn" hơn nếu tập trung nghiên cứu

vào Sinorhizobium và Mesorhizobium,

cố gắng cải tạo hiệu suất chuyển gen vốn còn thấp của chúng