Bài giảng Thí nghiệm vi sinh vật

Dựa vào tính chất vật lý, người ta có thể phân biệt thành các loại môi trường dinh dưỡng sau đây: - Môi trường lỏng: được dùng để nuôi tăng sinh, thử nghiệm các đặc tính sinh lý và sinh

1

THÍ NGHIỆM VI SINH

BÀI 1 CÁC QUI TẮC AN TOÀN TRONG PHÒNG

THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT

Sinh viên tham gia thực tập vi sinh cần tuân thủ một số qui tắc sau để đảm bảo an toàn:

1 Mặc áo blouse trong thời gian thực tập

2 Lắng nghe và thực hiện nghiêm túc các hướng dẫn của cán bộ phụ trách thực tập

3 Đọc kỹ tài liệu thực tập và nắm vững nguyên tắc, phương pháp thí nghiệm với vi sinh vật

4 Không ăn uống, hút thuốc trong phòng thí nghiệm Không đưa vật thể bên ngoài vào miệng khi đang thao tác với vi sinh vật

5 Chỉ mang những vật dụng tối thiểu cần cho thực tập (tài liệu thực tập, tập ghi, bút) vào chỗ làm thí nghiệm Tất cả các vật dụng cá nhân khác phải để ở vị trí cách ly riêng

6 Trước khi bắt đầu làm thí nghiệm, sinh viên cần sát trùng mặt bàn thí nghiệm bằng khăn giấy tẩm cồn 70o và để khô Thực hiện khử trùng tương tự cho 2 tay của người làm thí nghiệm Sau khi hoàn thành thí nghiệm, tắt đèn cồn, sau đó lặp lại việc sát trùng mặt bàn và 2 tay với cồn như trên

12 Khi lỡ tay làm đổ, nhiễm vi sinh vật lên bàn thí nghiệm, dùng khăn giấy tẩm cồn 70o lau kỹ mặt bàn

13 Khi làm vỡ dụng cụ thủy tinh, cẩn thận mang găng tay thu gom tất cả các mảnh vỡ vào một túi rác riêng

14 Tách riêng chất thải rắn và chất thải lỏng Tất cả chất thải rắn, môi trường chứa hoặc nhiễm vi sinh vật cần được hấp khử trùng trước khi thải bỏ Các dụng cụ, bình chứa nhiễm vi sinh vật cần được ngâm vào dung dịch chất diệt khuẩn trước khi rửa và tái sử dụng

15 Sát trùng và rửa tay sạch sẽ bằng xà phòng trước khi rời khỏi phòng thí nghiệm

16 Khi xảy ra tai nạn hoặc sự cố, cần báo ngay với cán bộ phụ trách thực tập để có biện pháp xử lý thích hợp, kịp thời

3

BÀI 2 MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY

1 Nguyên tắc:

Để phân lập, nuôi cấy và bảo quản các vi sinh vật, người ta sử dụng các môi trường dinh dưỡng đặc hoặc lỏng Môi trường dinh dưỡng cần chứa đầy đủ các thành phần về nguồn carbon, nguồn nitơ, khoáng đa lượng và vi lượng cần cho sự biến dưỡng vật chất và năng lượng của vi sinh vật quan tâm Ngoài các thành phần dinh dưỡng cần thiết, môi trường còn cần có hàm lượng nước thích hợp, độ pH xác định và có kết cấu lý tính thích hợp cho sự tăng trưởng của vi sinh vật mục tiêu

Người ta thường gọi tên các môi trường bằng cách dựa vào tên người tìm hoặc gọi theo nguồn chất dinh dưỡng chính của môi trường

Dựa vào tính chất vật lý, người ta có thể phân biệt thành các loại môi trường dinh dưỡng sau đây:

- Môi trường lỏng: được dùng để nuôi tăng sinh, thử nghiệm các đặc tính

sinh lý và sinh hóa, giữ giống và bảo quản giống…

- Môi trường rắn: được dùng để phân lập khuẩn lạc đơn, nghiên cứu các

đặc điểm hình thái khuẩn lạc, đặc điểm tăng trưởng, định lượng mật độ

vi sinh vật, cấy chuyền, giữ giống…

- Môi trường bán rắn: được dùng trong lên men vi sinh trong công

nghiệp

2 Vật liệu:

- Cốc thủy tinh

- Nồi hấp áp lực

- Các hóa chất pha môi trường

6

BÀI 3 PHƯƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG

- Năng lượng chiếu xạ ở bước sóng ngắn có khả năng ion hóa phân tử nước tạo gốc tự do tác dụng phá hủy DNA, màng lipid và protein trong tế bào; tia xạ có bước sóng dài hơn như tia tử ngoại không có tác dụng ion hóa nhưng có thể cảm ứng việc tạo thành dimer giữa các base pyrimidine trong nucleic acid, tạo nên đột biến, có thể gây chết tế bào

- Các dịch lỏng có thể được khử trùng bằng cách lọc qua màng lọc vô trùng, cho phép dịch lỏng đi qua và giữ lại tất cả các vi sinh vật có kích thước lớn hơn lỗ của màng lọc

- Nhiều hóa chất có thể kiểm soát sự tăng trưởng của vi sinh vật như: ethylen oxide, triethylen glycol, kháng sinh…

2 Vật liệu:

- Bình tam giác

- Ống nghiệm

Khử trùng bằng nồi hấp áp lực:

Phương pháp khử trùng bằng nồi hấp áp lực sử dụng nhiệt ẩm để tiêu diệt tế bào sinh dưỡng và bào tử của vi sinh vật, dựa trên nguyên tắc làm gia tăng nhiệt độ bằng hơi nước bão hòa dưới một áp suất lớn hơn áp suất bình thường của khí quyển

Trình tự các bước sử dụng nồi hấp áp lực như sau:

- Bổ sung nước ở đáy nồi đến vạch quy định

- Xếp dụng cụ và vật liệu cần khử trùng vào giá đặt, không xếp quá chặt để hơi nước lưu thông dễ dàng

- Đậy kín nắp nồi hấp Trường hợp nắp có nhiều ốc vặn, cần vặn ốc theo từng cặp đối xứng nhau

- Mở van thông hơi nước giữa hai nồi (trường hợp nồi hấp hai lớp)

- Bật công tắc điện, đun nồi hấp

- Khi nhiệt độ lên đến 80oC hoặc 0,5 atm, mở từ từ van xả để đuổi hết không khí ra khỏi nồi cho đến khi luồng hơi nước thoát ra liên tục, đóng van lại

- Khi áp suất nồi trong lên đến áp suất cần hấp, bắt đầu tính thời gian hấp

8

- Khi đủ thời gian khử trùng, tắt điện, chờ nhiệt độ và áp suất hạ xuống giá trị 0 mới được mở nắp để tránh gây tai nạn hoặc tránh áp suất thay đổi đột ngột làm hư môi trường

Sau khi hấp khử trùng xong, cần lấy sớm dụng cụ, bình chứa môi trường ra khỏi nồi hấp và làm nguội nhanh nhằm giảm thiểu tác dụng của nhiệt lên môi trường Các bình chứa môi trường có thể được làm nguội nhanh dưới vòi nước chảy

Các bình tam giác, chai lọ, ống nghiệm chứa môi trường trước khi được khử trùng bằng phương pháp nhiệt ẩm cần được đậy chặt, nhưng đảm bảo cho phép không khí và hơi nước thông qua bằng cách sử dụng nút bông không thấm nước, nắp nhôm, giấy nhôm…

Thông thường, các đĩa petri hoặc nút bông còn được bao gói bằng giấy hoặc giấy nhôm để giảm thiểu nguy cơ bị nhiễm sau khi khử trùng Sau khi hấp, các đĩa petri vô trùng cần được sấy khô trước khi dùng

9

BÀI 4 KỸ THUẬT THAO TÁC VÔ TRÙNG

1 Nguyên tắc:

Trong phòng thí nghiệm, vi sinh vật cần được nuôi cấy vào nhiều dạng môi trường khác nhau để tăng sinh, khảo sát đặc tính tăng trưởng và biến dưỡng, thử nghiệm sinh hóa, định danh… Việc cấy chủng cần được thực hiện sao cho không đưa vi sinh vật khác hay vi sinh vật tạp nhiễm vào môi trường Kỹ thuật thao tác vô trùng được sử dụng để loại trừ các vi sinh vật gây nhiễm

Môi trường, các dụng cụ chứa môi trường, dụng cụ nuôi cấy hoặc các dụng cụ cần thiết khác cần được khử trùng một cách thích hợp để có được trạng thái vô trùng trước khi sử dụng

Chủng có thể được cấy vào môi trường lỏng hoặc lên bề mặt môi trường rắn bằng một số dụng cụ sau:

- Que cấy thẳng

- Que cấy móc

- Que cấy vòng

- Ống hút thủy tinh

- Tăm bông vô trùng…

Các thao tác vô trùng được thực hiện trong không gian vô trùng tạo ra bởi ngọn lửa của đèn cồn trong tủ cấy vô trùng Ngọn lửa đèn cồn có tác dụng ôxy hóa không khí tạo không gian vô trùng; đồng thời còn được dùng

2 Vật liệu:

- Que cấy thẳng

- Que cấy móc

- Que cấy vòng

- Đèn cồn

- Mơi trường nuơi cấy

- Giống vi sinh vật

3 Thực hành:

a) Cấy giống từ môi trường lỏng sang môi trường lỏng:

- Sau khi khử trùng que cấy, dùng tay phải để mở nút bông, hơ nóng miệng ống nghiệm, xoay vài vòng qua ngọn lửa

- Đưa que cấy đã khử trùng vào bên trong ống nghiệm, làm nguội que cấy

- Thu sinh khối bằng cách nhúng que cấy vào môi trường lỏng, rút thẳng que cấy ra không để dính vào thành và miệng ống nghiệm

11

- Hơ nóng miệng ống nghiệm, đậy nút bông Đặt ống nghiệm vào giá đỡ Đầu que cấy có chứa vi sinh vật được giữ ở vùng không khí vô trùng gần ngọn đèn

- Dùng tay trái lấy ống nghiệm môi trường mới, mở nút bông, khử trùng miệng ống nghiệm, rồi đưa đầu que cấy vào bên trong môi trường Khuấy nhẹ que cấy, rút thẳng đầu lấy que cấy ra

- Khử trùng miệng ống nghiệm, đậy nút bông lại

- Khử trùng que cấy ngay sau khi cấy xong, trước khi trả về giá để que cấy

b) Cấy giống từ ống thạch nghiêng sang môi trường lỏng:

- Thu sinh khối từ ống giống bằng cách chấm nhẹ đầu que cấy lên khuẩn lạc trên bề mặt môi trường

- Chuyển giống vào môi trường lỏng bằng cách khuấy mạnh đầu que cấy trong môi trường lỏng để tách sinh khối ra khỏi đầu que cấy

c) Cấy giống từ môi trường lỏng sang ống thạch nghiêng:

- Thu sinh khối vi sinh vật

- Cấy giống lên bề mặt ống thạch nghiêng bằng cách đặt nhẹ đầu que cấy lên bề mặt môi trường ở đáy ống Dàn đều sinh khối ở phần đáy ống nghiệm Sau đó cấy từ đáy ống nghiệm lên đến đầu trên của mặt thạch nghiêng

12

BÀI 5 KỸ THUẬT TẠO KHUẨN LẠC ĐƠN

1 Nguyên tắc:

Phần lớn các phương pháp phân lập và làm thuần chủng vi sinh vật đều dựa trên một số kỹ thuật pha loãng kết hợp với điều kiện nuôi cấy chọn lọc tạo ưu thế tăng trưởng cho chủng quan tâm Dưới đây là một số phương pháp pha loãng:

- Phương pháp hộp ria: hỗn hợp vi sinh vật được trải và ria trên bề mặt

môi trường rắn trong đĩa petri sao cho các tế bào riêng biệt tách nhau

ra Sau khi được ủ, mỗi tế bào sẽ tăng trưởng thành khuẩn lạc đơn riêng biệt

- Phương pháp hộp trải hoặc hộp đổ: là phương pháp pha loãng liên tiếp

bậc 10 dịch chứa vi sinh vật thành các mức pha loãng khác nhau, chuyển 0,1 ml dịch ở các bậc pha loãng phía sau lên bề mặt đĩa môi trường rắn hoặc 1 ml dịch tương ứng vào môi trường rắn đun chảy Mỗi tế bào riêng biệt sẽ tăng trưởng thành khuẩn lạc đơn

- Phương pháp loạt ống agar mềm: là phương pháp pha loãng liên tiếp

một dung tích dịch chứa chủng trong các ống môi trường agar mềm và sau đó chuyển lên bề mặt môi trường nền trên hộp petri Mỗi tế bào riêng biệt ở những ống pha loãng phía sau sẽ tăng trưởng thành khuẩn lạc đơn

13

Để có được chủng thuần, cần tiến hành lặp lại nhiều lần các kỹ thuật pha loãng trên cho đến khi tất cả các khuẩn lạc xuất hiện trên môi trường đều đồng nhất

Trong thao tác tạo khuẩn lạc đơn cần lưu ý hạn chế thấp nhất nguy cơ

bị nhiễm bằng cách thực hiện nghiêm túc các yêu cầu của thao tác vô trùng

2 Vật liệu:

- Que cấy vòng

- Que gạt thủy tinh

a) Kỹ thuật hộp ria:

- Dùng que cấy vòng thao tác vô trùng thu giống

- Ria các đường trên đĩa petri chứa môi trường thích hợp Sau mỗi đường ria, đốt khử trùng đầu que cấy và làm nguội trước khi thực hiện đường ria tiếp theo

- Gói đĩa petri, ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp trong tủ ấm

b) Kỹ thuật hộp trải:

15

BÀI 6 QUAN SÁT VI SINH VẬT

1 Nguyên tắc:

Kính hiển vi là thiết bị cần thiết trong nghiên cứu hình thái và nhận diện vi sinh vật Kính hiển vi cho phép phóng đại và quan sát rõ, chân thật các đối tượng vi sinh vật, các nội bào quan khác nhau Dưới đây là một số kính hiển vi thường gặp:

- Kính hiển vi soi nổi: là dạng kính lúp có độ phóng đại thay đổi từ 10

lần đến 60 lần, thường dùng trong quan sát và thao tác trên những vật có kích thước tương đối lớn Nguồn sáng thường được chiếu trực tiếp từ phía trên xuống vật và phản xạ vào kính

- Kính hiển vi quang học: là hệ thống dùng để phóng đại vi sinh vật kích

thước nhỏ Độ phóng đại của kính có thể từ vài chục lần đến 2000 lần Cấu tạo kính gồm: thị kính, vật, thân kính, bàn mang mẫu vật, tụ quang, hệ thống chiếu sáng, nút chỉnh thô và nút chỉnh tinh Ánh sáng của kính chủ yếu truyền từ đáy lên, xuyên qua mẫu để vào vật kính Ánh sáng được điều chỉnh bằng cách nâng hoặc hạ tụ quang, đóng hoặc mở chắn sáng, tăng hay giảm ánh sáng hoặc xoay gương, dùng gương lõm hay phẳng

- Kính hiển vi huỳnh quang: kính được trang bị bộ nguồn các ánh sáng

kích thích có độ dài sóng khác nhau để kích thích tạo huỳnh quang Phần lớn các vi sinh vật không có khả năng phát huỳnh quang hoặc có

16

nhưng rất yếu Tuy nhiên, có thể nhuộm tế bào, các bào quan và các đại phân tử trong tế bào bằng các phẩm nhuộm huỳnh quang khác nhau, nhờ vậy có thể quan sát, theo dõi chuyên biệt bào quan hoặc phân tử đang quan tâm trong khi tế bào vẫn sống và tăng trưởng

- Mẫu vật được chuẩn bị trên phiến kính với một giọt nước

- Đặt lá kính lên giọt nước

- Đặt phiến kính lên bàn mang vật

- Hạ tụ quang, đóng bớt chắn sáng

- Chọn vật kính X10, dùng nút chỉnh thô hạ vật kính hoặc nâng bàn mang vật Chỉnh từ từ theo chiều ngược lại cho đến khi thấy ảnh vi sinh

17

vật trong thị trường của kính Dùng tay di chuyển phiến kính hoặc dùng bộ phận di chuyển bàn mang vật sao cho vùng muốn quan sát nằm ở giữa thị trường của kính

- Chuyển sang vật kính X40, điều chỉnh nút chỉnh tinh để tìm ảnh

b) Quan sát vi sinh vật với vật kính X100:

- Mẫu được cố định trên phiến kính và nhuộm màu Sau khi làm khô, nhỏ một giọt dầu cèdre lên vết nhuộm và đưa mẫu lên bàn mang vật

- Nâng tụ quang, mở chắn sáng

- Hạ từ từ vật kính X100 sao cho đầu vật kính chìm trong giọt dầu cèdre

- Dùng nút chỉnh thô nâng từ từ bàn mang vật cho đến khi thoáng thấy ảnh thì ngừng lại Sau đó, dùng nút chỉnh tinh chỉnh cho đến khi nhìn thấy ảnh rõ nét

18

BÀI 7 HÌNH THÁI VI SINH VẬT

1 Nguyên tắc:

- Vi khuẩn: là các vi sinh vật đơn bào, có nhiều hình dạng khác nhau: hình

cầu, hình que, hình xoắn… Các tế bào vi khuẩn có thể ở dạng tế bào đơn hoặc liên kết với nhau thành dạng đôi, dạng chuỗi, dạng cụm…

- Nấm men: là các vi sinh vật thường ở dạng đơn bào, có nhiều hình dạng

khác nhau: hình cầu, hình bầu dục, hình trụ… Một số loài nấm men có khả năng tạo khuẩn ty giả Nấm men thường sinh sản bằng cách nảy chồi

- Nấm mốc: có khuẩn ty phát triển thành hệ sợi nấm Khuẩn ty nấm mốc có

thể có vách ngăn hoặc không có vách ngăn

19

Sử dụng kính hiển vi quang học để quan sát các vi sinh vật

Mô tả hình dạng của các vi sinh vật khác nhau dưới kính hiển vi quang học

Vẽ hình dạng của các tế bào vi sinh vật khác nhau khi quan sát dưới kính hiển vi quang học

20

BÀI 8 NHUỘM VI SINH VẬT

- Các vi khuẩn Gram âm: không có khả năng giữ được phức chất tạo thành

giữa tím kết tinh và iốt, và bị mất màu khi xử lý bằng cồn

Phương pháp nhuộm Gram:

- Chuẩn bị tiêu bản: đặt một giọt nước chứa vi khuẩn lên phiến kính, dàn mỏng thành vết bôi, cố định nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn

- Nhuộm tiêu bản bằng tím kết tinh: 1 phút

22

BÀI 9 ĐẾM SỐ LƯỢNG VI SINH VẬT

1 Nguyên tắc:

Vi sinh vật có thể được định lượng bằng nhiều phương pháp khác nhau Sau đây là 2 phương pháp thông dụng:

a) Phương pháp đếm trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu:

Mật độ các vi sinh vật đơn bào có kích thước lớn có thể được xác định bằng cách đếm trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu Phương pháp này cho phép xác định nhanh chóng mật độ vi sinh vật trong mẫu, nhưng phương pháp này không phân biệt được giữa tế bào sống và tế bào chết và khó đạt được độ chính xác cao

Buồng đếm hồng cầu thường là một phiến kính dày 2 – 3 mm, có một vùng đĩa đếm nằm giữa phiến kính và được bao quanh bởi một rãnh Đĩa đếm thấp hơn bề mặt của phiến kính khoảng 1/10 mm, có hình tròn vì thế khi được phủ lên bằng một lá kính thì độ sâu của đĩa đếm sẽ đồng đều nhau Vùng đĩa đếm có diện tích 1 mm2

và được chia thành 25 ô vuông lớn có diện tích mỗi ô là 1/25 mm2 và 400 ô vuông nhỏ hơn có diện tích mỗi ô là 1/400 mm2

Đặt một giọt mẫu được pha loãng vào vùng đếm trên buồng đếm, đậy bằng lá kính Chỉnh kính hiển vi với vật kính X40, tìm mạng ô đếm ở khu vực buồng đếm Chỉnh thị trường sao cho một thị trường chứa trọn 1 ô lớn Đếm số

tế bào hiện diện trong 1 ô lớn Sau đó, chỉnh thị trường tìm 1 ô lớn khác Đếm số

tế bào của ít nhất 5 ô lớn, lấy trị số trung bình của 1 ô lớn

Mật độ tế bào của mẫu là:

N = 0,25 x a x 106 (tế bào/ ml) (a: số tế bào bình quân trong 1 ô lớn)