Thí nghiệm công nghệ sinh học tập 2 thí nghiệm vi sinh vật học nguyễn đức lượng, phan thị huyền, nguyễn ánh tuyết

50.4 KhOa phân loạ؛ các loài nấm men50.5 Khóa phân loại các loài nấm men trong giống Saccharomyces 50.0 KhOa phân loại cắc loài nấm men trong giống phụ Saccharomyces Bai 51: Phânloạimộts

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ Hồ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG (Chủ biên)

THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ SINH HỌC

T Ậ P 2

THỈ NGHIỆM VI SINH VẬT HỌC

NHÀ XUẤT BÀN

^؛ ^ = D Ạ I HQC Q ٧ tfc GIA TP Hổ CHÍ MINH

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP H ồ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

N g u y ễn Đức LưỢng (Chủ biên)

Phan Thị Huyền ٠Nguyễn Ánh Tuyết

THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ SINH HỌC

ĐHOG.HCM-OÍB : 12ﺱ1.2006ﺭ75٠11 SV.GT.594-06 (T)

MỤC LỤC

Bài 2: Những dụng cụ١ trang thiết bị cơ bản cUa phOng thi nghiệm vi sinh vật học 12

4.8 Chuấn bi mỏi trương nuOi cấy dUng trong nhừng nghiên cứu về sinh ly,

49 Bài 8: Nghén cứu hinh thái nảm m١ea

9 :

؛

Ba

50 9.1

Giống Aspergillus

51 9.2

Giống Penicillium

53 9.3

Giống Alternaria

53 9.4

Giống Fusarium

54 9.5

Giống Cladosporium

55 10

: Nghỉén cứu hinh tha! tảo

؛

Ba

؟ 5 Bai 11: Nghièn cứu hlnh thai xạ hhuỉán

59 '

1 SINH ^Ậ

ng buOng đ٠ẽni h(')ng

؛ Bà! 12: Xác định trực tiep sỗ' lượng tế b٤٥o bà

0

ﺎﻋ.،

Bai 13: xac định gian tiep sO' lượng tie ba.0 bàmg cach đỉếnn so lưưug cáo khuan

62 trường thacbì

؛ è'n trẽn mồ

؛ phat tr

62 13.1

Nguvèn tồc

62

èn banh

؛ 13.2 each t

64 13.3

Gachdèni

65 Bài 14: D.inh lương vi S i n h vảt bàng phươmg pjbap doí một dọ quang

66 du،،g cu và n١ôỉ trường :nuĩối cay Ọu١

؛ 14.1 Vật l

Bài 16: Các thi nghiệm kiem tra kha nànỉg phiảỉ;i gtiai c;ổc hop clìàt hữu co

69

tơ cua vi sinh vặt

؛ khOng chưa n

69 16.1

Qua trinh lèn men rượu {Ethanoh

72 16.2

Qua trinh lén men lactic

73 16.3

Qua trinh lén men butvric

75 16.4

Qua trinh lèn men acetic

76 cellulose

؛ a

؛ 16.5 Quá trinh phần g

cắc hợp chat hừu cơ ؛

hàn gia

؛ 17 : cac thi nghiệm kiếm tra kha nầaig p

؛

Ba

77 chứa n it cUa vi sinh vật

77 17.1

Qua trinh amonium hỏa protein

79

٠

' 17.2 Qua trinh amoniUm hOa urea

80 17.3

Qua trinh nitrate hóa

17.4

Bai 18: Phưmtg phap phân lập va nuOi ca'y cồc nhóm vi sinh vật tham gia vảo

32

sự chuyến hOa cac chat khoáng

32 18.1

Vi sinh vột tham gia vầo sự chuyen h0)a ca(c hợR) chả.t luư hu۶nh

39 phospho

Vi khuấEi silicate

Chương 9: PHƯƠNG PHAP THU NHẬN VA XAC ĐỊNH HOẠT TINH ENZYM

Bui 26: Phương phap fhu nhíịn chè' phà'n١ enzyme vi sinh vẶt tho từ phương phdp

Bí'11 27: Phương phap thu nhận cho' phOm enzyme vi sinh vặt tho từ phương phap

Ba، '29: cac phươíig phap kiOm tra h.ạt tinh enzyme vi sinh v.t 112

Bài 30: Phương phap kiếm tra Escherichia coli và cắc collform khác 130

30.2 Phat hﺇện nhanh sự cỏ mặt cUa E.coỉi trong thực phẩm đống lạnh

Bài 37: Phương pháp kiểm tra Listeria 187

Bài 39: Phương pháp kiểm tra enterotoxin tạo bởi vi khuẩn Staphylococcus 197

50.4 KhOa phân loạ؛ các loài nấm men

50.5 Khóa phân loại các loài nấm men trong giống Saccharomyces

50.0 KhOa phân loại cắc loài nấm men trong giống phụ Saccharomyces

Bai 51: Phânloạimộtsốxạ'khuấ'n

51.1 KhOa phân loại xạ khuẩn cUa Krassilnikov

51.2 KhOa phân loại xạ khuầ'n cUa Waksman

Bài 52: Phán loại một số nấm mốc

52.1 KhOa phân loại nấm thường gặp

52.2 Bang phân loại dến nhOm

52,5 GiOng Pcìiicillium

Chương 13: MỘT SỐ MÒI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT

THƯỜNG SỬ DỤNG

A Mồi trường nuôi cấy vi khuẩn

B Môi trường nuối cấy nấm men

c Môi trường nuOi cấy nấm mồ'c (nấm sợi)

D Mói trường nuồi cấy xạ khuẩn

E Môi trưởng nuõỉ cấy tá.

Chương 14: DUNG DỊCH VẢ THƯỐC THƯ

Chư'ơng 15: CẮC CHẤT NHUỘM MÀU

269 290 291

ﻉﺁ

44 446 447 448

449

460 463

LỜI NÓI ĐẦU

Vi sinh udt học là môn khoa học nghìên cứa oề các qui luật cUa gìới sinh odt \)ô cUng nhồ bé Cdng nghệ oi sinh odt học Id khoa học Ung

rdt mạnh cUa cdng nghệ sinh học.

THÍ NGHIỆM VI SINH VẶT HỌC đuợc blèn ,'soạn nhdm glUp

cdng nghệ sinh học:

K5 ndng oè cOng nghệ ol sinh oật to n g phOng thl nghiệm.

" Cdc phương phdp nghlèn cứu thu nhận sàn phdm bdc 1, bậc 2;

-Đáỵ là tập 2 của bộ tai liệu THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ SINH

cda bqn đqc.

Mọi ﺩﺭ kiển dồng góp xin gửi về:

Bộ môn Công nghệ sinh học

Trường Đạỉ học Bách khoa ·ẳ Đại học Quốc gia TP Hồ Chi Minh

Tcl: 8 639 341 - 0913 742 766

Chủ bỉên

Chương 1

CÙA PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT HỌC

BÀ11: NỘI QUI PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT HỌC

Vi sinh vật là những cơ thế sống có kích thước vô cùng nhỏ bé mà mắt thường không

thẻ thấy được Bên cạnh những giống, loài vi sinh vật có ích cho cuộc sống con người là

nhừng giống, loài có khả năng gây bệnh và có hại đối với sức khỏe con người Chính vì thế

người làm thí nghiệm trong phòng thí nghiệm vi sinh cần phải tuân thủ các qui tắc cơ bản

sau đáy:

1- Phái chuân bị cho mồi buối thí nghiệm bằng cách đọc bài kỹ và làm quen với các

qui tắc và phương pháp có liên quan đến bài thí nghiệm, nhằm sử dụng thời gian một cách

hiệu quả đồng thời giảm thiểu tối đa các rủi ro có thế xảy ra trong khi làm thí nghiệm

2- Không án uống, hút thuốc, nói chuyện ồn ào khi đang tiến hành thí nghiệm

3- Phải luôn mặc áo blouse trong phòng thí nghiệm, tuyệt đối không để môi trường

hay vật phấm cổ vi sinh vật dấy lên quần áo, giấy tờ và dụng cụ cá nhản Đồng thời cQng

phải chủ ý bảo vệ da và quần áo khỏi bị dính hóa chất và thuốc nhuộm

4- Chi đem những đồ vật cho phép vào phòng thí nghiệm, như tài liệu hướng dẫn

thực hành, sổ sách ghi chép, và các vật liệu thí nghiệm khác Tất cả các thứ khác như áữ

khoầc túi xách, sách vớ phái đặt đúng nơi qui định, cách xa nơi làm thí nghiệm

5“ Trước lúc bắt đầu làm thí nghiệm, phải sát trùng bề mặt bàn thí nghiệm bằng các

hóa chất sát trùng đá chuẩn bị sẳn và lau khô bằng giấy vệ sinh Lặp lại công việc này lần

nừa sau khi đả hoàn thành thí nghiệm,

6 Tất cả các vật liệu và hóa chất thí nghiệm ngoài tên vật liệu, hóa chất còn phải ghi chính xác tên người làm thí nghiệm, tên lớp học và ngày làm thí nghiệm, dể tránh

nhầm lần khi sứ dụng và vứt bỏ vật liệu, hóa chất

7- Chú ý, phải hết sức thận trọng để không làm đổ, vỡ hư hóng các trang thiết bị và

dụng cụ

8- Phái chú ý cẩn thận khi sử dụng đèn cồn Không được đốt đèn cồn khi không sứ

dụng Thao tác cấn thận tránh làm bỏng tay và gây hỏa hoạn

9- Tất cá các vật liệu bị nhiễm bẩn cần phải được khử trùng trước khi vứt bỏ hoặc sử

dụng lại Các vật liệu cần khử trùng phải được đặt đúng nơi qui định

10- Khi kết thúc thí nghiệm, cần phải vệ sinh các thiết bị, dụng cụ đã sứ dụng theo

đúng qui trình và phái sắp xếp chúng vào đúng nơi qui định

1 1 Sau mỗi lần làm thí nghiệm, phải rửa tay sạch sè trước khi rời phòng thí nghiệm

12 Trong trường hợp nếu có tai nạn hay bị thương, lập tức báo cho cán bộ phòng thí

nghiêm đê có thể chữa chạy kịp thời

12 Chương 1

2.1 CÁC DỤNG CỤ THÔNGTTHƯỜNG

]· Các dung cụ thủy tinh

nút đậy bàng bông gOn bần hay nắp b^iig nhưa

nhựa hay klm loại Ngoai ra cùng cO lọ thuy tinh có nút bản hay nUt mài

dụng de' lố'y một thể tích nhá't dinh chat long nào do

4 ٥í'٥ Pcín (hộp longí: gOm một náp va một day nho hơn lóng dược va() nhau, thường dược sử d٧ng dể chưa mOi trương thach nuO؛ câ.y VI sinh vảt nghiOn cưu cac dồc diOm hinh

thai le bOo vi sinh ٧ạt

6- Quc củy\ cO bOn فا que cồ.y ٢٠ا ٠ ban:

trong C(1.V chuyOn ímòi trương long va ﻊﻟ va cấv ria 0٢ا í tạo vuch) V؛ sinh vột trén mOl

trường thach

٠ Qur ('Ii\ tlị(ĩỉig\ co dhy c(،'.v bằng kini ìoĩỊÌi hinh th٥ng٠ dược sư dụng dé cố'.v trich sáu

(trong thiich dưng) hay trích ly ví sinh vật trên m٥i trương dộc.

xạ khuẩn.

٠Quc ، نﺪﻟ trang (que gạt): dược sư dụng dè' phấn b٥' déu dاch chứa vi kh٧a'ji trèn bé

mặt m٥i trương thọch

nhiều dung tích khác nhau, dược sư dụng dè' chứa ch4٠t lOng m٥i trương hay dẻ' nuOi cồ.y,

nhản giOng vi sinh vẶt Một sơ' cO kha nống chịu nhiệt dược sư dụng đế' dun chả.t lOng

diế'm hinh thai, sinh hóa Iv cUa tế bảo vi sinh vặt,

10" Là kinlì ilamclì dUng de' dậy lèn vè't bOi trSn tiêu ban giup cho việc nghiên cứu,

quan sat vl sinh vật dưới kinh hièn vi

t.ư va dặc dỉểrn về sinh sdn cUa te hao vi sinh vật,

thước lơn như na.m bao tủ' níiin tao,

mật độ quang cùa dung dịch ch؛lỊ long

N hững n g u y ẽ n tâc cơ b ản cUa phOng th ؛ n g h ؛ệm vi sin h v ậ t h ọc 13

2· Một 8ố các dụng cựỳ th iết bị khác

1- Cân kỹ thuât: dùng dể cổn hốa châ't١ vật liệu vè cóc thành phẩn mối trướng nuO؛

cấy vi sinh vặt.

2- Cản phán tích: dUng dể cản hốa chất, vật liệu vồ cốc thầnh phần mói t٣'íờng nuôi

cấy vi sinh vật vdi lượng nhồ va cắn độ chinh xác cao.

3- Bếp điện: cắn thiê't dể dun nóng va chuẩn bị mOi trưởng nuOi cấy vi sinh vật.

4٠ Tủ lạnh: dược sứ dụng dế bảo quản vi sinh vật, hốa chất va mOl trường trong một

thdi gian ngắn

5- Tủ cấy vô trung: cO khOng gian vO trUng dược sư dụng dể cá'y vi sinh vật nhớ hệ

thOng den tư ngoại hay bộ phận thOi khi vO trUng.

6- Tủ ấm: cố chế độ ổn định nhiệt độ dược 6ﺉ dụng dể ủ vi sinh vật tại nhiệt độ thích

hợp cho sự sinh trưởng va phat triển cUa chUng.

'7٠ Tủ sấy: dược 5ﻥ dụng dể sá'y kho, khư trung cac dụng cụ thi nghiệm chịu dươc sức

nOng kho (chU yếu !à dựi)g cụ thuy tinh) sau khỉ rửa sạch va de thật ráo.

8٠ Nồi hấp tiệt trùng {autodavcr thiet Ъ] nay ca.p nhiOt bằng hơ؛ nước ơ Up suat

cao dược sử dụng dể hâ'p khử trùng mOi trương, một sO' các nguyên liệu và các loại dung

cụ thi nghiệm.

9٠ Nổi chưng cách thủy: cố kha nang chiu nhiệt thương dược 8ﻥ dụng dế dun cha.v thỉĩch.

10 Bc điểu nhĩột: thương chda nước và dươc cai dạt ở nhiệt độ nhat định dể'ổn dinh

nhiệt độ cho nhtog thi ngh ؛( m can sư On định về nhiệt độ.٠

11 Bc lắc ổri ìihict: sứ dung dt lác môi trương trong nuOi cấy vi sinh vật ơ một nhivl

độ thích hợp, nhằm ổn d؛nh nhiệt độ cán thiCt va dảm bảo tinh dOng nhat cua mOi trường

cho vi sinh vật sinh t^ỏng.

12- Mdy ly tám: thiè.t bị nầy dươc sư dung de tach các chat ỏ các pha ràn ٠ lOng ra

khOi nhau, như tach sinh khOi te' bào ra IthOl mOl trương nuOl ca'y٠ hay tach ^ac tiểu phần

trong các thanh phồn tè' bao cỏ độ láng khac nhau.

13ﺍ Máy do ﺹ: dược sừ dụng dế xac định nhanh độ pH cUa dung dịch hay mOi trương

nuOi cả'y vi sinh vật.

Ngoai СЙС dụng cụ thiết bị cơ ban trén١ phơng thi nghiệm vi sinh vệt cơn có thể cO

các dụng cụ thiết bỊ khác như k؟ p gắp dể lố'y mẫu, b٥p cao su sư dụng v٥i pipet,.,., kinh

hiển vi chụp ảnh» máy do mặt độ quang, mồy sác ky, diện di

Một sể T điểm cồn lưu ý khi sử dụng cốc th؛é't bị

sinh vặt hoặc u vi sinh vật, ngươi làm thl nghiệm cần phai lam dâ'u tèn va ngày thi

nghiệm lên những thư nảy đế' tranh gây nhảm lản mât mất va cần phai dạt chUng ngan

náp gọn gang dể hạn chè' đổ vỡ.

2٠ớ'؛ với ٥ ﺀﻻ cấy tổ trùng: dể dảm bdo vO trUng, dơn tư ngoại phải dược bặt sang lièn

tục chi tất trươc khi cả'y 1 giơ Sử dung chổi va giẻ rièng dể quGt và lau chUi tU cồ.y

14 Chương 1

vật dụng dề chảy như dây thun, nhựa Không dể tủ hoạt dộng khi không sứ dụng

cân Khi cân xong phải trả cân về vị tri 0 và khOa cân lại KhOng dược dể hất cứ vật gì trên cân khi không sử dụng cân

rât cẩn thận dể tránh bị bỏng Phải sử dụng găng tay bằng vải dày khi làm việc với nồi hâ'p và tuân theo các hướng dần sử dụng nồi hấp một cách nghiêm ngặt Thời gian, nhiệt

độ và áp suâ't sử dụng dể tiệt trUng bằng nồi hấp không giống nhau dô'i với các môi trường nuOl cấy dem khử trUng có cấc thể tích khác nhau Ví dụ: da số các môi trường nuôi cấy vi sinh vật trong phOng thi nghiệm khi dem hấp khử trUng trong ống nghiệm

10 ml và các binh tam giác 50 - 200 ml thi chỉ cần 15 phut ( I 2 1 ٧ c , latm), cOn trong các binh tam giác 500 ml: 20 phut, 1000 ml: 25 phUt ớ cấc diều kiện hấp khử trUng này, cả tê' bào sinh dưỡng lẫn bào tư vi sinh vật dều bị tiêu diệt

-,٠ ' " ﺫ ﺫ ﺍ : ﺉ

Các loai liộp lồng Petri

ﻢﺑ٠

N h ữ n g n g u y ê n tắc cơ b ả n c ủ a p h ò n g th í n g h iệm vi sin h v ậ t h ọ c 15

trong phòng thi nghiệm vi sinh

2.2 KÍNH HIỂN VI CÁC LOẠI

Các loại kính hiển vi được sử dụng trong nghiên cứu, quan sát tế bào vi sinh vật về các đặc điềm hình thái, sinh lý nhờ vào khả năng phóng đại của chúng Việc lựa chọn loại kính hiển vi để nghiên cứu phụ thuộc vào mục đích cụ thể của từng nghiên cứu Tuy vậy, kính hiển vi quang học nền sáng là loại kính được sử dụng phồ biến nhất và dễ sử dụng nhất trong các phòng thí nghiệm vi sinh cơ bản

i- Cấu tạo

Có rất nhiều loại kính hiển vi được sử dụng trong phòng thí nghiệm đế quan sát những mẫu vật có kích thước rất bé Tuy nhiên, việc lựa chọn kính hiển vi đế sử dụng phụ thuộc vào từng mục đích nghiên cứu cụ thể, chẳng hạn:

hình thái, cấu tạo và sinh lý nói chung của tế bào vi sinh vật, độ phóng đại có thề lên đến

1000 lần Đây là dụng cụ được sử dụng phổ biến nhất và dễ sử dụng nhất trong các phòng thí nghiệm vi sinh vật Tuy nhiên, không thể sử dụng loại kính hiển vi này để quan sát các mẫu vật có kích thước 0,2 pm

kính này có thể giiíp quan sát các câu trủc khó phân biệt của tế bào vi sinh vật nhờ vào câu trúc đặc biệt của bộ tụ quang với một đĩa chắn sáng ngán không cho ánh sáng

đi vào thấu kính một cách trực tiếp; ánh sáng phản xạ bởi mẫu vật di vào thấu kính của vật kính và vì thế mẫu vật xuất hiện màu sáng trên nền đen Kính này giúp quan sát tố٠t các vi sinh vật sô،ng nhưng không thể quan sát được bằng kính hiển vi nền sáng

và không dễ nhuộm

chỉ khác là câu tạo đặc biệt của tụ quang Bộ tụ quang được gắn với một màng chắn hình vòng khuyên cho phép ánh sáng xuyên trực tiếp qua tụ quang, hội tụ lên mẫu vật

16 Chương 1

và qua một bán nhiẻu xạ trong thấu kính của vệt kính.Vệt kính và thị kính có thể làm đổi pha dao động của ánh sáng chiếu vào, giUp quan sát rõ nét các câu trúc nhỏ như tién mao các lớp màng, không bào ty thể, Với loại kính hiển vi này mẫu vệt khỏng cần phải được nhuộm, và thường dược sử dụng để kiểm tra các cả.u trúc bên trong của

tế bào sống.

Kinh hiển vi soi nổi: loại này tưcmg tự như kính hiển vi đối pha, nhưng sử dụng hai

chùm sáng được phán tách khỏi nhau nhd một số các lăng kính và cho hình ảnh ba chiều Nhờ vậy mẫu vật có ảnh màu và không cần phải nhuộm.

Kinh hiển vi huỳnh quang: khác với bốn loại kính hiển vi trên, kính hiển vi loại

này không được chiếu với ánh sáng tráng mà là ánh sáng tử ngoại hay gẩn vùng tử ngoại, và tiéu bản đã được nhuộm màu bới các chất huỳnh quang Các cấu trúc khác nhau trén tế bào sè phát quang với các màu sác khác nhau, vi thế giúp quan sát và phán biệt chúng rõ ràng hơn.

Kinh hiển vi dồng ticu dicm: loai kính này sử dụng tia laser đé chiếu sáng một mặt

cua một mảu vặt riêng biệt Trong các ứng dụng y học, tế bào có thể được quan sát với kính hiển vi loại này với hình ánh hai chiéu hoặc ba chiều.

Kinh hiển vi điện từ: loại kính này sử dụng chùm tia điện tử với độ phán giải

cao có bước sóng ngán cho phép quan sát các mồu vật có kích thước nho hơn 0,2 pm

Có hai louỉ kinh hiển vi diện tứ cơ báni; kính hiển vi điện tử truyền suốt và kính hiển

VI difn tử quéx Loại thứ nhát cho íỉnh hai chiéu, thường dược sử dụng đé quan sát

virus hay các cáu trúc cưc nhó bén trong các phán mòng cùa tẻ bào Mầu vát khi dược quan sát với kinh hiển vi loai này cổ thể được phóng đại từ 10000 ٠ 100000 lần có khi lén đến 1000000 lần Loai thứ hai cho ầnh ba chiều, thường dược sử dụng để nghiẻn cứu đặc điếm bề một của tè bào và virus Mồu vệt có thể được phóng đại từ 1000 -

10000 lần.

Kính hiền vi quét có đầu dò bàng kim loại: giúp quan sát các chỗ lồi lôm trên bề

mật mẫu vật có độ phần giải cao hơn nhiều so với kinh hiển vi điện tử Kinh hiển vi loại này thường được sử dụng để quan sát các chip máy tính và các phản tử DNA.

Kính hiền vỉ áp lực nguyên từ có đẩu dò bàng kim loại và kim cương: có khả nàng ép

khi quan sổt dọc theo bề mặt mẳu vệt giúp quan sát chi tiết cấu trúc của các phán tử sinh học dưới hình ảnh không gian ba chiều.

Trong các phòng thí nghiệm vi sinh cơ bản nói chung, dể quan sát các tế bào vi sinh vật và hình thái của chúng, kính hiến vi quang học nền sáng là loại bước đầu được sử dụng nhiẻu nhất.

Kinh hiển vi nền sáng là loại kính hiển vi trong dó vùng quan sát có màu sáng còn mẫu vật có màu tối.

Kính hiển vi quang học nền sáng có cấu tạo cơ bản như sau (H.1.2)

N hừ n ^ n g u y ê n tắ c cơ b ả n c ủ a p h ò n g thí n g h iệm v i sin h v ậ t h ọ c 17

5- Vật kính 6- Bộ phần Chĩnh thô 9- Bộ p tó n chỉnh tinh 10- Ốc nang tụ quang 11- Tụ quang

12- Kẹp giữ tỉẻu bản 13- Cần điều chỉnh ánh sáng 14- Đèn chiếu sáng

chỗ dựa chủ yếu cho nhiều bộ phận khác như bàn kính, ống kính và trục mang ống kinh Bàn kính có thể chuyên động theo mặt phăng ngang nhờ các ốc vặn di chuyển bàn kính, nhờ đó có thể chuyển bất kỳ vị trí nào trên tiêu bản vào giữa thị trường Trên bàn kính.có các kẹp giữ tiêu bản Dưới bàn kính có một giá giữ bộ tụ quang., ống kính là một ống tròn (kính một mắt) hay hai ống tròn (kính hai mắt) có thể di động theo hướng diều chỉnh của ngiíời sử dụng Ông kính có khả năng di chuyển lên xuông nhờ các ốc điều chỉnh theo hai chiều ngược nhau: ốc chỉnh thô (di chuyển nhanh) được chỉnh để tìm ảnh của vật; còn ốc chỉnh tinh (di chuyển chậm) được chỉnh để có được ảnh rõ nét

thi kính, kính tụ quang và gương phản chiếu Trong đó, vật kính là phần quan trọng nhất،

hiến vi thông thường có bốn vật kính tiêu sắc x4, xio, x40 và xioo Vật kính xioo là vật kính dầu Khi quan sát các mẫu vật nhuộm màu với vật kính xioo thì cần nhúng chìm vật

kính vào dầu soi sử dụng cho vật kính hiển vi (có độ chiết quang tương đương với độ chiết quang của thủy tinh, do đó ánh sáng đi qua không bị khúc xạ mà chiếu thẳng vào vật kính)

hiển vĩ thường được sử dụng hiện nay là thị kính hai mắt; độ phóng đại xio Ảnh quan sát

18 Chương 1

dược dưới kính hiển vi quang học là ảnh ảo, ngược chiều với mẫu vật, với độ phóng đại bằng tích số giữa độ phóng đại của vật kính và thị kính dang sử dụng

diều chỉnh và có tác dụng để tập trung ánh sáng Bên dưới kính tụ quang là hệ thống chắn sáng cho phép điều chỉnh lượng ánh sáng chiếu vào

chùm tia sáng đi vào kính tụ quang, có thể quay được để thu nhận ánh sáng

Ánh sáng được truyền từ đáy thân kính, xuyên qua mẫu và vào vật kính Ánh sáng có thể được điều chỉnh bằng cách nâng hoặc hạ tụ quang, đóng hoặc mở chắn sáng, tăng hay giảm ánh sáng của đèn

Lưu ý:

- Cẩn thận khi nâng, hạ kính vì lá kính trên mẫu vật rất dễ bị vỡ

- Vật kính dầu (xlOO) sau khi sử dụng xong cần phải chùi tigay bằng loại giấy lau dành riêng cho nó Đặc biệt không được dùng cồn hoặc dùng giấy vệ sinh chùi vào vật kính

2- Cách sử dụng

Trước hết phải chuẩn bị tiêu bản có vi sinh vật, sau đó cần phải điều chỉnh nguồn ánh sáng và điều chỉnh vật kính

a- Điều chỉnh nguồn ánh sáng

- Đưa vật kính vào vị trí có thể nhận được nguồn sáng;

- Cắm điện và bật công tắc đèii, nếu dùng ánh sáng đèn;

- Mắt nhìn vào thị kính đồng thời sử dụng tay phải điều chỉnh gương phản chiếu dể tập trung nguồn sáng vào tâm điểm của thị trường quan sát Điều chỉnh sao cho lượng ánh sáng đi vào đạt tối đa

6- Điều chỉnh vật kịnh ụậ kính ịụ quQng

- Chuẩn bị tiêu bản chứa mầu vật rồi đặt vào bàn Iđnh, cố định bởi các kẹp tiêu bản

- Điều chỉnh kính tụ quang bằng tay trái: nâng kính lên ở mức hợp lý, tránh làm vờ tiêu bản

- Mở hệ thống chắn sáng tối đa và điều chỉnh để có ảnh rõ nét nhất

-Nhìn vào thị kính, điều chỉnh tiêu bản đe chọn được vùng cần quan sát

- Di chuyển vật kính xuống gần tiêu bản với khoảng cách hỢp lý để cố ảnh rõ, tránh làm vỡ tiêu bản

- Nhìn vào thị kính, thận trọng điều chỉnh các ốc chỉnh thô, ốc chỉnh tinh cho đến khi thấy được ảnh đẹp

- Khi quan sát, có thể điều chỉnh vị trí của tiêu bản để quan sát phần mẫu vật theo ý muốn

- Nếu sử dụng vật kính dầu, cần phải nhỏ một giọt dầu lên vị trí cần quan sát trên tiêu bản Sau đó, hạ từ từ vật kính dầu cho đến khi vật kính nhúng vào dầu, cẩn thận để không làm vỡ tiêu bản Điều chỉnh các ốc chỉnh thô và chỉnh tinh để có được ảnh rõ nét

3- Bảo quản kính hiển vi

a- Khi sử dụng xong

- Nâng vật kính lên cao, lấy tiêu bản ra

N hững n g u y ên tắc cơ b ản củ a p h ò n g thí n g h iệm vi sin h v ậ t h ọ c 19

- Nếu sử dụng vật kính dầu thì phải sử dụng khán hoặc giấy lau dành riêng cho vật kính dầu (hoặc sử dụng vải mềm lau hết dầu) sau đó thấm cylon hoặc xăng tốt lau thật sạch (chú ý lau nhẹ, tránh làm xước vật kính)

- Xoay đứng gương phản chiếu, hạ tụ quang xuống, xoay điểm giữa của hai vật kính gần nhau vào trục, xếp một miếng vải sạch đặt lên khay kính rồi hạ cho vật kính sát vào lớp vải này

- Cho kính vào hộp hoặc vào tủ kính

- Đế tiêu bản vào nơi qui định Nếu tiêu bản dính dầu, phải lau sạch dầu trước khi để vào nơi qui định

- Phải giữ kính hiển vi thật sạch sẽ ở nơi khô ráo để tránh nấm sợi phát triển và bụi bám vào

- Trong thời gian không sử dụng, có thể lấy thị kính ra và đậy nắp ống kính lại Để nguyên vật kính

- Nếu phần kính trên của thị kính bị bẩn, có thể sử dụng khán mềm lau sạch

- Khi vặt kính, thị kính bị nhiễm nhiều nấm sợi, nên nhờ cá٠c chuyên gia về quang học xử lý, không nên tự tiện lau chùi

- Khi di chuyển kính hiển vi, phải thao tác nhẹ nhàng, cẩn thận Một tay cầm thân kính, một tay giữ đế kính Chỉ nên di chuyển kính hiển vi khi thấy cần thiết

Chương 2

BÀI 3: CHUẨN BỊ DỤNG c ụ NUÔI CẤY

Quá trình chuẩn bị đụng cụ nuôi cấy gồm các công việc sau đây

- Đổ vào bên trong dụng cụ nước có pH = 7 (để kiểm tra độ trung tính)

-,Hấp khử trùng dụng cụ ở 121"C trong 15 phút bằng nồi hấp điện

- Lấy dụng cụ ra để nguội rồi kiểm tra pK của nước trong dụng cụ

- Nếu nước có pH kiềm thì tiếp tục ngâm dụng cụ vào dung dịch HCl 2؟؛ cho đến khi kiêm tra lại và thấy nước có pH 7 thì mới thôi

- Rửa kỹ bằng nưởc nhiều lần lí\ dùng được

b) Phương pháp rửa dụng cụ

Nhìn chung các dụng cụ làm bằng thủy tinh có độ bền hóa học, chịu được nhiệt độ cao, tấ t khác nhau về hình dạng và kích thước Do đó, các loại dụng cụ khác nhau cần có các phương pháp rửa khác nhau

Phiến kính

- Với phiến kính cũ (đã dùng làm tiêu bản)

٠ Chùi sạch mỡ hay vaseline trên phiến kính bằng miếng vải tẩm xilen hoặc ngâm tiêu bản vào dung dịch sulíurbicromate trong 48 giờ

• Ngâm tiêu bản vào nước xà bông và đun sôi trong 1 giờ

• Rửa nước, để ráo

٠ Ngâm tiêu bản vào cồn 90٧ trong 2 giờ

٠ Lau khô chúng bằng vải mịn rồi sây khô

- Với phiến kính mới: cần kiểm tra độ pH và xử lý để đạt độ trung tính

C huẩn bị m ôi trư ờ n g và đ iề u k iệ n n g h iê n cứ u vi sin h v ậ t 21

Ong nghiệm

Chưẩn bị các ^oại chổi khác nhan dể rửa các loại ống nghiệm

- Với các ống nghiệm cũ da bị nhiễm khuẩn:

٠ Hấp vô khuẩn ỏ 121.C trong 15 phut

٠ Lấy ra và đổ cắc vật phẩm trong ống nghiệm di

٠ Ngâm ống nghiệm vầo nưức ấm

٠ Rửa ống nghiệm bằng cấch:

+ DUng chổi chấm xà bống cọ xát vầo thầnh ống dều khắp nhiều lần

+ Rủa nưởc 2-3 lần

+ Up ống nghiệm cho thật rấo.nước và khô

+ Sấy khô trong tủ ấm ở 40.C

- Với các ống nghiệm khOng nhiễm khuẩn hay chứa cấc vi khuẩn không gây bệnh thi không phải hấp khử trUng vầ tiến hầnh rửa như trên

ĐXa Petri

٠ Bặt ngửa dĩa Petri trong lòng bàn tay trái

- Tay phải dì١١ng giẻ chấm tro cd xầ bông xát vầo hai mặt cUa dĩa, các khe ớ chân dĩa

vầ thầnh dĩa

- Rửa nước 2-3 lần

- Up nghiêng cắc dĩa trong rổ nhựa cho thật khô

Pipet

- BUng que hoặc dây thép nhồ rUt nUt bông ở dầu Idn pipet ra

- Khứ trUng pipet ở 121.C trong 15 phut

١ Ngâm vầo dung dịch sulfurbicromate trong 24 giở

- Xát kỹ hai dầu vầ phần ngoầi pipet bằng giẻ vdi nước xà bông

- DUng nước xả ngược đế' thông cặn pipet

- Cám pipet trên giá, dầu nhọn đế’ lên trên

- DUng giẻ với nước xà bOng dặc lác kỹ đế' rứa phần t١١ong dụng cụ

- Rửa nước nhiều lần cho thật sạch vầ đế' rấo

- Phân loại cấc dụng cụ này theo kích thước to, nhỏ tốt, xấu, sạch hay bấ'n

- Ngâm từng loại riêng vầo nước ấm (50 - 80"c) trong 3-4 giờ

- Rứa nước là nhiều lần

- Phoi nắng 2-3 giờ rồi câ't di dUng dần

3 2 ﺍ SAO ﺓ DỤNG c ụ 0 ﺍ

1- Ngu^ẽn tdc

٠ Dụng cụ dược bao gOi phải dảm bảo sạch và khô

- Bao gối phai thật kin và cẩn thận đế' dụng cụ sau khi khư trUng vẫn dảm bảo sự vô trUng trong lớp giấy gói và Iâ'y ra sử dụng dễ dàng

22 Chương 2

Việc ban gói đụng cụ gồm hai khâu:

٠" Cách làm nút bông

Với cấc ống nghiệm:

- Lấy một miếng bông không thấm nước cuộn lại

- DUng khUc tre ấn vào đoạn giữa cuộn bông

- X e u d ï ï

٠ NUt có kích thước, độ chặt vừa phải

٠ Đầu nUt trbn, phần ngoài lớn hơn phần trong ống nghiệm

٠ Lấy nUt ra hay dOng vào dễ dàng

Vdi cấc chai, lọ, binh tam giác có kích thước lớn: cấch lầm tương tự nhưng lượng bông

sử dụng phải nhiều hơn và bọc bằng một lớp vải gạc

Vói cấc pipet, dUng một sợi dây thếp nhỏ nhẻt một ít bông vào dầu lởn cUa pipet

b- Cách bao gối đ p g cự

Vói cấc dụng cụ sau khi làm nUt bOng, cần dược bao gỏi phần cố nUt bông bằng giấy dầu hay giấy bấo đế' khi hấp khử trUng nUt bông không bị ướt, dảm bảo diều kiện vô trUng tốt hơn Cổch lầm như sau:

- Cát các bâng giấy hlnh chữ nhật với kích thước tUy theo dụng cụ cần bao gOi

٠ Quấn bâng giấy quanh dầu cố nUt bOng

٠Gập ống giấy sốt vầo nUt bOng ở mặt trưởc và hai bên

- Gập nốt phần giấy cồn lại và câi sâu vầo trong

Yèu cảu\

- Phần giấy bao ngoằỉ phải chặt kin

- Bao bàng giấy dầu với dụng cụ hấp ưởt

- Bao bằng giấy bốo vdi dụng cụ sâ'y khô khi khử trUng

Vdi cốc dụng cụ như pipet, dĩa Petri, que gạt phdi dUng giấy bao kin toần bộ co thé' thay giấy bao bằng một hộp nhôm kin dựng tất cả các d١ing cụ trên dể khư trUng

1- Nguyên tắc

Sau khi khử trùng cần dắm bảo:

- Sự vô trUng tuyệt dối cho cấc vật phẩm và cấc dụng cụ

“ Không lầm thay dổi châ't lượng mầu vật

Bảo dảm an toần tuyệt dô'i cho con người

C huẩn b ị m ôi trư ờ n g và đ iề u k iệ n n g h iê n cứu v i sin h v ậ t 23

- Tính chất môi trường

- Số lượng tế bào vi sinh vật.

- Độ pH của vật định khử trùng

Do đó, để khử trùng bằng nhiệt có hiệu quả, cần xác định ngưỡng nhiệt độ thấp nhất

và khoảng thời gian ngắn nhất cần thiết để tiêu diệt toàn bộ vi sinh vật và các bào tử của chúng có trong dụng cụ cần khử trùng

Có thể khử trùng bằng phương pháp nhiệt khô hay nhiệt ướt

a- Khử trùng bằng sức nóng khô (nhiệt khô)

Dưới tác dụng của sức nóng khô, các cấu tử của tế bào vi sinh vật bị oxy hóa, tế bào

bị khô hoàn toàn và chết

• Nhiệt độ và thời gian mong muốn sẽ được duy trì nhờ bộ phận điều khiển tự động

٠ Tắt tú sấy, để nguội tới 60٥c mới mở tủ lấy dụng cụ Tránh mở tủ lấy dụng cụ khi nhiệt độ tủ đang còn cao sẽ làm các dụng cụ thủy tinh dễ bị nứt vỡ

• Các dụng cụ sau khi sây mà giấy bao có màu hơi vàng là đạt yêu cầu

Khử trùng bằng cá(h đổt qua lửa nung đỏ

٠ Phương pháp này dùng để khử trùng pipet, que cấy, đầu các ống nghiệm, miệng các bình tam giác sau khi lấy nút bông ra.

٥ ٠ Khử tỉ ung bằng sức nóng ướt

ĩ- Đun sôi trong nước

- Phưc١ig pháp này dùng khi cần khử trùng nhanh các dụng cụ: kim tiêm, kéo, kẹp, dao, côc thủy tinh, chai, lọ

- Cách khử trùng

٠ Dùng nước máy sạch đổ ngập dụng cụ

٠ Đun sôi từ 30 phút đến 1 giờ.

Phương pháp này chỉ có tác dụng diệt tế bào sinh dưỡng chứ không diệt được bào tử

vi sinh vật Để khắc phục hạn chế này, người ta pha thêm vào nước acid phenic 59(.

24 C hương 2

- P h ư ơ ؟ nháp تد) tiung dế khử trUng cóc thực phẩm dễ biến tinh ở nhiệt độ cao như sữa, bia, rượu,

- Cdch khử trùng: Đun ndng môi trường lên 60-75.C trong 15-30 phut hoặc dun aOng lên 80.C trong 10-15 phut

Phưmig phdp này chi cố khẳ năng ức chế cắc vi khuẩn khOng sinh bào tử.

- Phương phdp nầy dUng dể hấp khử trUng một số loại môi trướng nuôi cấy men banh

mi, men gia sUc, mốc lầm nưởc chấm vầ những vi sinh vật tạo bầo tử khấc

- each khử trUng:

٠ Hấp môi trường ở lOO.C tư 30-40 phut

٠ Lấy ra dể tủ ấm 24 giờ cho cấc bầo tử cUa vi sinh vật nảy mầm

٠ Hấp môi trưởng lần thứ hai ở I00"c trong 30-40 phut dể tiêu diệt cấc bào tử vừa nẩy mầm

٠ Lặp lại qua trinh nầy từ 3-4 lần.

- Kết quả: môi trường vừa dược vô trUng, vừa dảm bảo không bị biê'n dổi

- Phương phấp nầy dược thực hiện trong nồi hấp tiệt trUng ở ap suất cao Bó la thiê't

bị lầm bằng kim loại, chịu dược nhiệt độ vầ áp suất cao, cd khả nán٠> tự dộng diều chinh ấp suất vằ thdi gian tiệt trUng theo yêu cầu của người sử dụng

5- Nguvèn tdc hoat dộng

- Lầm gia tang nhiệt dể khử trUng cấc vật bầng hơi nưức bão hòa dưởi ap suất lơn hơn ấp suất binh thường của khi quyển Khi ấp suất hơi nươc tang thi nhiệt độ trong nồl cUng tang theo nhơ hệ thống van rất chặt che

- Mối quan hệ giữa ap suất ghi trẽn ap kế vơi nhiệt độ trong nồi biế'u hiện qua bảng

- Biều chỉnh kim dồng hồ di؛ n áp về chỉ số mong muốn

- Bỉều chỉnh kim dồng hồ thơi gian khử trUng về chỉ sO mong muốn

C huan b ị m ôi trư ờ n g và đ iề u k iệ n n g h iê n cứ u v i sin h v ậ t 25

- Đống kin van xả

- Bật công tắc khử trùng (hay nhấn nút start) сПа nồi hấp

- Nhờ sự điều khiển cUa hệ thống tự dộng, quá trinh hấp khứ trUng dlền ra và kê't thUc bằng còi báo hiệu

" Chờ kim ổp ke' trơ vế sô' 0 mới mở nắp nồi từ từ de’ nhiệt, độ hạ thá'p rồi lả'y dụng cụ١ vật hệu da khư trUng ra

- Kút phích diện (ĩigưng cung cấp diện cho nồi hấp)

- Dẩn nhàn ghi ngày, thấng, nấm khư trUng vầo dụng cụ hay nguyên vật liệu vừa khử trUng de' tiện việc sứ dụng

nghiệm cần phải

- Кіе'т tra lại nồi hâ'p trước khi sư dụng

- Thận trọng thực hiện dUng qui trinh dược chl dẫn

٠ Tránh cung cấp diện dột ngột đế' khOng gây vỡ dụng cụ, nguyên liệu hoặc gây nổ nguy hlé'm

- Trực tiê'p theo dồi quá trinh hâ'p khư trUng cho dến khi kết thUc vầ ngắt diện

- Định kỳ kiếm tra châ't lượng dồng hồ áp ke'

và van an toàn

Tdm lại phương phấp hấp khứ trUng bằng

hơi nước bão hOa ở áp suâ't cao là phương pháp phồ'

biê'n vầ hiệu quả nhâ't trong các phương pháp khứ

trUng nhờ khả nâng tiêu diệt, dược cả te' bào sinh

dưỡng lẵn bào tư cUa vi sinh vật

Gần dây, một sô' phOng thi nghiệm vi sinh

vật học cUa các viện vầ trường đã dược trang bị mơi

loại nồi hả'p ap suâ't cao dưới dạng tU hlnh khối chữ

nhật gọn, dẹp và tiện sử dụng hơn nhưng nguyên

tắc hoạt dộng vẵn giừ nguyên (Η.2.1)

c Khư tríuxg bũag cách tọc

Phương pháp nầy dUng đế' khư trUng các loại mOi trường khOng thích họ٠p với phương pháp khứ trUng ơ nhiệt độ cao (như mOi trương huyê't thanh, dung dịch albumin, doi khi cá môi trường dường) Ngoài ra, cO the' dUng biện pháp này dể' tách các vi sinh vật với cẩc sẩn phâ'm trao dổi châ't cUa chUng trong dung dịch nuOi câ'y

nhỏ hơn kích thước vi sinh vật cần lọc Nhơ do, dịch qua lọc dược vô trUng

binh lọc Seilz Câ'u tạo cUa nó gồm ba bộ phận:

٠ Bộ phận trên có hình trụ đế' chứa dịch lọc (Ong lọc)

- Bộ phận ở dưới dể chứa dịch dã qua lọc

- Bộ phận ơ giữa là màng lọc (quan trọng nhat)

Hình 2,1: Noi h r í p t ì ị í Ị t r ù ì ì ị *

26 C hương 2

Màng lọc bằng amiáng, hình tròn, dày khoảng 3-5 mm

Cả ba bộ phận trên liên kết với nhau nhờ các ốc vít

Bình lọc này có thê được nối với một bình tam giác có vòi hút chán khỏng dé tạo nên

sự chènh lệch áp suất giừa trên và dưới màng lọc do đó làm tăng tòc độ lọc

- Thời gian lọc không được kéo dài quá 30 phút

- Lọc xong, lấy một ít dịch lọc cấy vào môi trường thạch - nước thịt peptone đế trong

tù ấm 37 C Kiêm tra độ vô trùng của dịch đã lọc

٠ Bó màng lọc đi vì màng này chỉ được sử dụng 1 lần

d ‘ Tử cấy vô trùng

Thiết bị này dùng để thực hiện các thao tác phán phối môi trường vào C£C dụng cụ cáy chuyền, phân lập và tuyến chọn vi sinh vật

Cấy (nơi điển ra các thao tác Cấy chuyền, phân

lập ١) luôn luôn đảm báo được sự vô trùng hay

ít nhất cùng hạn chế tối đa sự tồn tại cùa các

vi sinh vật không mong muốn cũng như bào tử

cùa chúng

Cấu tạo

- Tủ kính có cửa đế đưa vào hay lấy ra các

dụng cụ

٠ - Hệ thõng bơm và lọc không khí bên

ngoài thành không khí vô trùng thôi vào tú

đồng thời với bộ phận hút khí ra để đảm bảo

sự cân bằng áp suất trong và ngoài tủ

(H.2.2)

thực hành trong tủ, cần chuyển ngay các hóa chất, dụng cụ nguyên vật li٥u ra khỏi tù,

vô trùng lại rồi mới tắ t các hệ thông bơm lọc khí cLÌa tủ

BÀI 4: CHUẨN B | MÒI TRƯỜNG NUÔI CẤY DÙNG CHO NHỮNG NGHIÊN cứ u

C ơ BẢN VỂ VI SINH VẬT HỌC4.1 CHUẨN BỊ NGUYÊN VẬT LIỆU

٠ Các nguyên, vật liệu đem làm môi trường nhất thiết phải cung cấp đầy đù các thành phần dinh dường cho các quá trình trao đổi chất ciia tế bào vi sinh vật, đồng thời phái duy trì dược thê oxi hóa - khử, áp suất thấm thấu và tạo được sự ổn định của pH thích hợp cùa môi trường

- Các thành phần nguyên, vật liệu phải được cân, đong chính xác và pha chê theo đúng trình tự hướng dẫn

- Đối vói môi trường dịch thể: các thành phần nguyên, vật liệu được cản, đong rồi hòa tan vào nước

- Đối với môi trường thạch: nếu là thạch bột thì cân cùng với các thành phần khác rồi hòa tan vào nước; còn nếu là thạch sợi thì phải cân thạch sợi, ngám vào nước, vớt thạch

ra, vắt khô, cho vào nồi nấu môi trường đê đun

4.2 LÀM TRONG MÔI TRƯỜNG

Nếu môi trường dịch thể không có đủ độ trong cần thiết, việc làm trong môi trường giúp quan sát sự phát triển của vi sinh vật dễ dàng hơn Có thể làm trong môi trường bằng phương pháp lọc môi trường qua bông gòn, vải thưa hay giấy lọc; cùng có thẻ lọc mòi trường bằng cách sử dụng than hoạt tính hay lòng trắng trứng gà Trong phương pháp lọc bằng lòng tráng trứng gà, cứ một lít môi trường thì phải sử dụng một quả trứng Trước tièn, trộn lòng trắng trứng với một thể tích nước tương đương với thể tích lòng tráng trứng rồi đánh cho đến khi sủi bọt Sau đó, cho hổn hợp này vào mòi trường, khuấy đều rồi đun sôi trong vòng 10 - 15 phút, đế lắng và lọc

4.3 ĐIỀU CHỈNH pH CỦA MÔI TRƯỜNG

Các vi sinh vật khác nhau chỉ có thê sinh trưởng và phát triển trong các khoảng pH khác nhau và chi phát triển tối ưu tại một pH nhất định nào đó Vì vậy, pH của môi trường cần phải được điều chỉnh sao cho thích hợp

Các châ.t thường được sử dụng để điều chính pH của môi trường nuôi cấy vi sinh vật là các dung dịch NaOH, KOH, HCl, H2SO4, NaHCO,, NaoCOib

Để xác định pH của môi trường, có thể sử dụng các chất chỉ thị màu như giấy quì hay xanh bromthymol Tuy nhiên, việc sử dụng máy đo pH có sẵn trong phòng thí nghiệm cho kết quả chính xác hơn

Các dụng cụ chứa môi trường thường là bình tam giác, các loại ống nghiệm hay dĩa Petri Quá trình phán phối mòi trường vào dụng cụ chứa phải tuân thù một số qui tác cơ bản sau đây:

- Môi trường khi được phân phối phải ở trạng thái lỏng

C huân bị m ôi trư ờ n g và đ iể u k iệ n n g h iên cứu vi sin h v ậ t 27

28 Chương 2

- Nếu dụng cụ chứa là đĩa Petri và môi trường cần phải được vô khuẩn thì môi trường này phải được hấp tiệt trùng trước khi phân phối

- Nếu dụng cụ chứa là ống nghiệm hay bình tam giác thì phải sử dụng phễu

- Các thao tác phản phôi cần phái nhanh, gọn, khéo léo để inôi trường không bị dấy lên miệng hay thành của dụng cụ chứa và phải hoàn thành trước khi môi trường bắt đầu hóa rắn

4.5 VÔ KHUẨN MÔI TRƯỜNG

Phương pháp vô khuẩn và các điều kiện vô khuẩn sử dụng đế vô khuẩn một môi trường nào đó phụ thuộc vào tính chất cúa mòi trường đó Phương pháp thường được sử dụng nhất để vò khuẩn môi trường là phương pháp hâ'p tiệt trùng bằng hơi nước ớ áp suâ١cao Ngoài ra có thể sử dụng phương pháp lọc qua màng lọc các môi trường có chứa các thành phần không bền nhiệt

4.6 LÀM THẠCH NGHIÊNG, THẠCH ĐỨNG VÀ THẠCH ĐĨA

i- Thạch nghiêng

- Phân phối môi trường (có chứa thạch) vào ống nghiệm haỳ lọ thúy tinh có nút bòng hay nắp đậy ngay sau khi vô khuẩn môi trường Thế tích môi trường được phân phối vào òhg nghiêm hay lọ phụ thuộc vào yêu cầu về độ dài cùa mặt thạch nghiêng hay độ cao của phần thạch sâu Thông thường, người ta cho vào ống nghiệm một lượng môi trường bằng 1/3 thè' tích Ông nghiệm để làm thạch nghiêng

- Cần phái thực hiện thao tác phân phối thật nhanh, gọn cùng với các kỹ thuật vô trùng đê tránh nhiềm khuân từ bên ngoài

٠٠ Đê nguội ống nghiệm hay lọ có chứa môi trường ở tư thế nghiêng góc sao cho ựiặt nghiêng và phần thạch sáu đạt yêu cầu

- Đê yên cho đến khi môi trường đặc lại Bề mặt thạch nghiêng phải bằng phẳng không gồ ghề, nhăn và liên tục

2 Thạch đứng

- Tiên hành phán phối môi trường như đối với thạch nghiêng nhưng làm nguội òng nghiệm ờ tư thế đứng Thông thường, người ta cho vào ống nghiệm một lượng inòi trường bằng 3/4 thế tích ống nghiệm để làm thạch đứng

- Đế yên cho đến khi mỏi trường đặc lại

3- Thạch đĩa

- Việc phân phối mòi trường vào thạch đĩa thường phái được thực hiện trong tu cấy

vỏ trùng

- Đìa Petri phải được hoàn toàn vô khuẩn

- Tiến hành song song với các kỹ thuật vô trùng

- Có thê phán phối môi trường vào đĩa bằng pipet hay rót trực tiếp ra đĩa Tùy vào yêu cầu cụ thê’ cùa từng thí nghiệm mà thê tích môi trường được phân phối vào đĩa có khác nhau đê tạo cho mòi trường thạch có độ dày, mỏng khác nhau

- Lưu ý náp đìa Petri chỉ được mớ một phần khi cho môi trường vào đìa.

C hu an bị m ôi trư ơng và đ iề u k iệ n n g h iê n cứ u vi sin h v ặ t 29

- Đậy nắp lại, xoay đĩa theo đường tròn, tới, lui một cách nhẹ nhàng để tránh môi trường dấy lên thành và nắp đìa

- Đê yên cho đến khi môi trường nguội và đặc lại

Chat ỏng

c)

HinK 2.3: a) Tliạcli ngliiêrig; b) tKạcli dicng; c) tliach đltt

4.7 B Ả QUẢN VÀ KIỂM TRA MỞI TRƯỜNG

Mô.i trường chưa dược sứ dụng cần phải dược bảo quản nơi khô, thoáng, tránh anh sáng, nhiệt độ phai thích hợp (thường từ 0 - 5('c), và có độ ẩm thích hợp đế' tránh làm khô inOi trường

- ThOi-gian bảo qudn phải dược tuân thU nghiêm ngặt theo yêu cầu cUa t.ừng thl nghiệm dé.-ddm bdo châ.t lượng cUa mỏi trường

2- P h ư ằ g pỊváp tao môi trương ddc Kiệu

Các mòi trường dặc hiệu thường da dược nghiên cứu râ't kỹ bởi nhiều nha khoa học khi họ da tlm hiể.u về dặc tinh sinh ly, sinh hOa và phân loại vi sinh vật

Các loại môi trường dặc hiệu cho từng giô'ng vi sinh vật dược liệt kê trong chương 13.Công việc cUa người nghiên cứu dặc tinh sinh lý, sinh hóa vi sinh vật cOn lại la tim mOi trường thích hợp dối với giỡ'ng vi sinh vật mà minh dang nghiên cứu Khi da tim dược đUng mối t.rương phu hợp vơi giOng vi sinh vật và phu hợp với mục dích nghiên cứu, cOng việc cOn lại là làm tuần tự như phần trên da trinh bày

Ngoài ra, trong nhiều trương hợp ta khOng tim dược môi trường dặc hiệu, ta phải sử dụng môi trường cơ bản làm nền Từ môi trường cơ bản, tiến hành nghiên cứu lần lượt ánh hưởng của từng yê'u tố môi trương Cách làni nhy thường rất mất thời gian nhmig kết quả rất khả quan Khi dó, ta tạo ra dược môi trương dặc hiệu cho giỏ'ng vi sinh vật mà ta dang nghiên cứu

ChƯGing 3

PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP, BÀO QUẢN GIỐNG VI SINH VẬT

BÀI 5: PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP GIỐNG VI SINH VẬT

Phán lập một vi sinh vật là quá trình tách riêng vi sinh vật đó từ mẫu vật hoặc quần thê vi sinh vật ban đầu đế thu nhận giống ớ dạng thuần khiết

Giống vi sinh thuần khiết rất quan trọng trong công nghệ sinh học Chúng chỉ gồm các tế bào được sinh ra từ một tế bào ban đầu Hầu hết các ứng dụng trong còng nghệ sinh học đều liên quan đến việc sử dụng giống thuần

Phần lớn các phương pháp phân lập giống thuần khiết đều dựa trên các kỹ thuật pha loãng, thường gồm các bước chính sau: chuẩn bị mẫu, táng sinh mẫu (nếu số lượng tế bào vi sinh vật có trong mẫu rất ít), pha loãng mẫu, cấy mẫu lên môi trường thạch đĩa thích hợp,

ủ mẫu, kiếm tra và phát hiện khuẩn lạc đặc trưng, chọn khuẩn lạc đặc trưng đem tạo giống thuần và kiểm tra giống thuần

5.1 CHUẨN BỊ TĂNG SINH VÀ PHA LOĂNG MẪU

Mẫu có chứa vi sinh vật nếu ở dạng rắn thì cần phải được nghiền ra và đem hòa tan vào nước cất vô khuẩn, hoặc nước muối sinh lý

Nếu mẫu chứa rât ít số tế bào vi khuẩn cần phân lập, cần thiết phải sử dụng đến môi trường tăng sinh Môi trường tàng sinh cho một vi sinh vật là một loại mòi trường tổng hợp có chứa các yếu tố chọn lọc cần thiết cho sự sinh trưởng của vi sinh vật đó Quá trình tăng sinh phải qua giai đoạn ủ ở nhiệt độ thích hợp để tế bào vi sinh vật có thể phát triển đến sô' lượng cần thiết, sau đó mới tiến hành pha loãng và cây mẫu lên môi trường thạch

để tạo các khuẩn lạc phát triển riêng lẻ

Dung dịch chọn đem pha loãng có thể là nước cất, nước muối sinh lý hay một loại dung dịch đệm nào đó sao cho sau khi pha loãng, tế bào vi sinh vật vẫn có thể thực hiện các quá trình trao đổi chất bình thường

Mẫu nên được pha loãng ở nhiều nồng độ khác nhau (thường theo tỉ lệ 1:10, 1:100, 1:1000, 1:10000, .) nhằm tránh hiện tượng không có khuẩn lạc hoặc các khuẩn lạc phát triển dày khít nhau trên mặt thạch và như thế sẽ không phân lập được

5.2 CẤY MẪU VÀ ủ MẪU

Môi trường phân lập thường không giống nhau đối với việc phân lập các vi sinh vật khác nhau Hơn nữa, các vi sinh vật khác nhau nhưng có quan hệ gần thì có thể phát triển thành những khuẩn lạc có đặc điểm tương tự nhau Chính vì vậy, việc chọn môi trường phân lập đóng vai trò rất quan trọng quyết định hiệu quả phân lập Thông thường, các môi trường chuyên biệt cho sự sinh trưởng của một vi sinh vật nào đó được sử dụng để phân lập các vi sinh vật này

Tuy nhiên, việc nuôi cấy vi sinh vật đòi hỏi các kỹ thuật vô trùng Bằng các kỹ thuật

vô trùng, người thao tác thí nghiệm có thể ngán ngừa giống vi sinh vật và các dung dịch

P h ư ơn g pháp p h â n lập b ảo q u ả n g iố n g v i sin h v ậ t in

khòi bị nhiềm bởi các vi sinh vật không mong muốn Thao tác các kỹ thuật vô trùng một cách chính xác cũng giúp người làm thí nghiệm tránh bị nhiềm các vi sinh vật gáy bệnh

Do đó, người làm thí nghiệm cần phải:

1- Vệ sinh sạch khu vực thí nghiệm bằng hóa chất sát trùng đế giám tối đa lượng vi sinh vật gây nhiễm,

2- Các dụng cụ cấy cnuyền phải được tiệt trùng, ví dụ; dáy cấy phái được đốt đỏ trước

và sau khi cấy chuyền

3- Các thao tác phải được thực hiện nhanh, chính xác và có hiệu quả đê rút ngắn thời gian mà qua đó giống vi sinh vật và người làm thí nghiệm có thê bị nhiễm

Các bước cấy chuyền giống vi sinh vật/mẫu từ ống nghiệm (hay này sang ốngnghiệm (hay lọ, ) khác được thực hiện như sau:

1 Dốt đỏ dây cấy trên ngọn lửa đèn cồn

2- Mở nút bông (hay nắp) và hơ miệng ống nghiệm (hay lọ, ) chứa giống vi sinh vật trên ngọn lứa đèn cồn

3- Thu một ít giống vi sinh vật bằng dây cấy và chuyền qua môi trường tinh khiết.4- Hơ lại miệng ống nghiệm (hay lọ, ) chứa giông vi sinh vật trên ngọn lửa đèn cồn

và đậy nút bông (hay nắp) lại

5- Đốt lại dây cấy trên ngọn lửa đèn cồn

Các kỹ thuật vô trùng đối với việc cấy giống lên bề mặt đĩa Petri cũng được thực hiện tương tự

Như vậy, người làm thí nghiệm phải;

1 Luôn luôn tiệt trùng dây cấy bằng cách đôt trước khi đưa nó vào bất cứ một ống nghiệm (hay lọ, ) nào chứa giống vi sinh vật

2- Luôn luôn hơ miệng ống nghiệm (hay lọ, ) chứa giống vi sinh vật trước khi đưa dây cấy đã tiệt trùng vào để lấy hoặc cấy giống

3- Luôn luôn đậy kỹ các ống nghiệm (hay lọ, ) đựng giống vi sinh vật với các nắp tương ứng khi không thực hiện cấy chuyền Tuyệt ăối tránh nhầm lẫn ống nghiệm (hay lọ, ) này với nắp kia Không đặt các nắp ống nghiệm hay nắp đĩa Petri lên mặt bàn hay tiếp xúc với bất cứ vật gì khác ngoài ống nghiệm hay đĩa Petri đựng giống vi sinh vật tương ứng đế tránh gây nhiễm Khi chuyến các khuẩn lạc ra, vào đĩa Petri, sử dụng nắp đìa như íà vật che chắn, bảo vệ giống khỏi bị nhiễm bằng cách nâng nghiêng nắp đĩa lén một góc đủ để đưa dáy cấy vào

4 Thao tác chính xác khi mở nút hay nắp ống nghiệm/lọ

1· Đối với vi sinh vật hiểu khí

Cấy mấu

- Thể tích các mẫu (kể cả pha loãng và không pha loãng) được cây lên thạch đĩa thường là 0,1 ml Tránh cấy mẫu với thể tích lớn, vì như vậy thạch sẽ không hấp thu hết mẫu và chất lỏng còn lại trên mặt thạch sẽ làm cho các khuẩn lạc phát triển dính liền nhau sau khi ủ

' Lấy que gạt vô khuẩn (nhúng vào cồn ^09( rồi đốt cháy với ngọn lửa đèn cồn, để nguội trong vài giây) phân bô đều mẫu lên mặt thạch Đậy nắp đĩa lại, để thạch thấm hút hết mẫu trong vài phút

32 Chương 3

- ú p ngược đĩa thạch rồi đem ủ trong tủ ấm ơ nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển cũa vi sinh vật Tùy theo từng loại vi sinh vật mà thời gian ủ có khác nhau

2- Đôi với vi sinh vật kị khi

- Chưng cách thủy mòi trường trong các ống nghiệm để đuổi hết oxy có trong môi trường

- Để mòi trường nguội đến 45-5Ò'’C cấy 0.1 ml dung dịch các mẫu (pha loãng và khòng pha loảng) vào môi trường, đậy kín lại và lắc ống nghiệm quanh trục của nó đê phân

bò đều mầu trong mòi trường

- Rót thật nhanh môi trường trong các ống nghiệm này ra các đĩa Petri rồi đậy nhanh nắp đĩa lại

- Dùng paraffin dán kín kẻ hở giữa đáy đĩa và nắp đĩa rồi đem ủ ở nhiệt độ thích hợp Thời, gian ủ phụ thuộc vào từng loại vi sinh vật cần phân lập

Thòng thường, các vi sinh vật khác nhau có khuẩn lạc mang những đặc điểm khác nhau trẽn môi trường phán lập Sử dụng que cấy cắt khối môi trường có khuẩn lạc đặc trưng phát triển riêng lẻ rồi cấy vào môi trường dịch thể thích hợp Đem ủ mỏi trường lỏng

ó nhiệt độ và thời gian thích hợp đế kiểm tra tính thuần khiết của vi sinh vật

5.4 KIỂM TRA TÍNH THUẦN KHIẾT CỦA MỘT GIỐNG VI SINH VẬT

Cỏ nhiều cách đề kiểm tra tính thuần khiết của một giống vi sinh vật như kiểm tra vết cảy, kiếm tra dưới kính hiển vi, kiểm tra bằng phương pháp cấy trang (cấy gạt, như đã thực hiện ơ phần cấý mẫu đối với vi sinh vật hiếu khí), hay kiểm tra bằng phương pháp cấy ria (tạo vạch) Tuy vậy, phương pháp cấy trang và cấy ria được coi là những phương pháp tiện lợi nhất và có ý nghĩa thực tê nhất

- Kiểm tra dưới kính hiển vi: Các tê bào vi sinh vật của cùng một khuẩn lạc khi được kiếm tra dưới kính hiển vi phải có hình thái y hệt nhau Các phương pháp nhuộm phân biệt, chăng hạn như nhuộm Gram thường được sử dụng

- Kiểm tra bằng phương pháp cấy trang (cấy gạt): pha loãng giống vi sinh vật đến các nồng độ thích hợp Lấy 0,1 ml dịch huyền phù tế bào được pha loãng này cây lên môi trường thạch, sừ dụng que trang thủy tinh nhúng vào cồn 90٥, đốt cháy, để nguội trong vài giây rồi gạt đều phần mầu đã cấy trên bề mặt thạch Đem ủ thạch đã cấy ở nhiệt độ và thời gian thích hợp

- Kiểm tra bằng phương pháp cấy ria: Có thể cây trực tiếp một khuẩn lạc đặc trưng

từ mỏi trường phân lập hay từ các vi khuẩn có trong môi trường dịch thé (có cây khuẩn lạc đặc trưng) sau khi li:

• Vó.Ị khuẩn lạc lấy trực tiếp từ môi trường phân lập: lấy que cấy vòng lấy khuẩn lạc này rồi cấy ria lên mặt thạch của một đĩa mới chứa mòi trường thích hợp (môi trường phân lập) cho sự phát triển rồi đem ủ

٠ Với các vi sinh vật có trong môi trường dịch thể sau khi ủ: cấy ria dịch này lên một đĩa mới chứa môi trường phân lập rồi đem ủ

Phươn؛؛ p h áp p h â n lậ p , b ảo q u ả n g iố n g vi sin h v ậ t 33

Trèn các vạch tạo lại ở bề mặt mòi trường của các đĩa này, giỏng vi sinh vật được xem là thuần khiết nếu có duy nhất một loại các khuẩn lạc có hình thái y hệt các khuẩn lạc được phán lập ờ đĩa thứ nhất (đìa thạch phân lập)

Có nhiếu phương pháp cấy ria và mỗi phương pháp đòi hỏi một số các kỹ thuật thao tác uhàt định Cần phải lưu ý rằng trên đầu dây cấy chứa nhiều hơn một tế bào vi sinh vặt١ vì vặy nhiều vạch cần được tạo ra (tức làm loãng) Không cần thiết phải lấy một lượng lớn các vi sinh vật đem tạo vạch lên dây cấy

P h ư ơ n g p h á p c ấ y r ia

~ Tạo các góc phần tư bằng cách vẽ hai đường vuông góc bên ngoài đáy đìa thạch, chia đìa thạch thành 4 phần bằng nhau

- Đốt nóng que cấy vòng, đế nguội trong vài giây rồi đưa que cấy vào trong ống nghiệm chứa giống vi siiih vật và lấy một ít vi sinh vật này

٠ Chạm nhẹ que cấy lên bề mặt thạch rồi trượt nhẹ que cây theo đường zizac liên tục trén một phần tư đĩa thạch đã được chia Sử dụng nắp đĩa،|để bảo vệ bề mặt thạch khỏi bị xihiễni bởi các vi sinh vật rơi từ không khí vào Tránh thọc sâu que cấy vào trong thạch

- Đốt nóng que cấy đế nguội, chạm đầu que cấy vào vùng thạch thuộc góc phần tư thứ nhất (đã được cấy ria), trượt băng que cấy từ vùng này qua vùng thạch thuộc góc phần tư thứ hai, rồi tạo đuờng zizac liên tục trên góc phần tư này Luôn luôn đốt nóng que cấy sau mỗi lần tạo vạch trên mỗi góc phần tư của thạch; làm như vậy sẽ tiêu diệt bất cứ một tế bào nào bám vào đầu que cấy và tránh cho lần cấy ria tiếp theo bị nhiễm

■ Lặp lại các bước cấy ria như thê trên vùng thạch thuộc góc phần tư thứ ba và thứ tư

٠ Đốt nóng đầu que cấy lần nữa sau khi đã cấy ria xong một đĩa thạch

Phuong pháp cấy ria góc

٠ Lấy một ít giống vi sinh vật lên que cấy và trượt đều đầu que cấy lên một nửa bề mặt thạch theo một đường zizac liên tục

٠ Không đốt nóng que cấy và không đưa que cấy ra khỏi đĩa, không quay bề mặt đầu que cay, quay đĩa thạch 90 và tiếp tục tạo đường zizac liên tục như đã làm trên vùng thạch trước ló

■ Chuẩn bị đĩa cấy ria đối chứng trong đó người tiến hành cấy ria chỉ sử dụng que cấy

đã tiệt trùng không có vi sinh vật sông bám vào Chỉ cần sử^dụng một trong hai phương pháp cấy ria trên Đây là những đĩa chỉ thị cho kỹ thuật vô trùng Nếu các kỹ thuật vô

٠ Trong buổi thí nghiệm tiếp theo, quan sát các đĩa được cấy ria Mô tả kết quả.

BÀI 6: PHƯƠNG PHÁP BẢO QUẢN GIỐNG VI SINH VẬT

Bảo quản giông vi sinh vật hay còn gọi là giữ giống vi sinh vật Bảo quản nhằm mục đích làm chậm quá trình hô hấp và trao đổi chất của tế bào vi sinh vật, ngán cản sự sinh sản của chúng, đồng thời không làm thay đổi phẩm chất ban đầu của giống, có nghía là giống được bảo quản tốt thì sẽ có các quá trình sinh, lý, hóa y như ban đầu nếu gặp được điều kiện sinh trưởng như ban đầu Giông khi đem bảo quản phải thuần khiết và phải ở trong trạng thái sinh, lý tốt.

Có nhiều phưcmg pháp bảo quản giống vi sinh vật, như phương pháp cấy chuyền định

kỳ lên môi trường mới, phương pháp giữ giống trên môi trường thạch có lớp dầu khoáng,

phương pháp giữ giống trến cát hay hạt, hay phương pháp đông khô.

i - P h ư ơ n g p h á p c ấ y c h u y n đ ịn h k ỳ lê n m ô i trư ờ n g m ờ i

Phương pháp này có thể áp dụng cho tất cả các vi sinh vật và bảo quản ở nhiệt

độ thâ'p (khoảng 4٥C) Tuy nhiên, tùy thuộc vào từng loại vi sinh vật, và từng giông, loài của mỗi loại mà thời gian cấy chuyền định kỳ sẽ khác nhau Phương pháp này dễ thực hiện nhưng thời gian bảo quản không lầu Hơn nữa, phẩm chất ban đầu của giông

dễ bị thay đổi Giông vi sinh vật được cấy chuyền định kỳ trong môi trường thạch đặc hiệu và được giữ trong điều kiện nhiệt độ nói trên Nên cây chuyền thường xuyên (thường là vài tuần hoặc một vài tháng tùy theo giống vi sinh vật) và có sổ ghi chép đê tiện theo dõi.

2- P h ư ơ n g p h á p giữ g iố n g trê n m ô i trư ờ n g th ạ c h c ỏ lớ p d ầ u k h o á n g

Dầu khoáng được sử dụng ở đây có thể là paraffin lỏng hay vaseline trung tính, có độ nhớt cao, vô hại đôl với vi sinh vật Dầu khoáng, trước khi được thêm thành một lớp

(khoảng một vài cm) trên mặt môi trường thạch, chứa trong ống nghiệm, phải được hấp vô

khuẩn ở 121.C trong 2 giờ rồi sấy khô ở 170.C trong 1.2 giờ, để nguội Sau khi thêm lớp dầu khoáng, miệng ống nghiệm phải được trét với paraffin đặc và ống nghiệm này phải được giữ ở điều kiện lạnh Phương pháp này đơn giản nhưng lại có hiệu quả cao, môi trường không mất nước và không bị khô Cách thực hiện như sau: chuẩn bị 3 ống vi sinh vật đã nuôi ở nhiệt độ và thời gian thích hợp Đổ lớp dầu khoáng đã vô trùng lên bề mặt Hàn kín ống nghiệm bằng paraffin rồi đem bảo quản.

3 · P h ư ơ n g p h á p giữ g iố n g trê n cá t h a y h ạ t

٠Cát có thể được sử dụng để giữ các chủng vi sinh vật có khả năng tạo bào tử Trước khi sử dụng cho bảo quản, cát phải được đem rây để lây hạt đều, ngâm vào trong H2SO4

P hư ơng p h áp p h ầ n lập , b ảo q u ản g iố n g v i sin h v ậ t 3 5

đậm đặc để loại bỏ các chất hữu cơ Sau đó, làm trung tính cát bằng cách rửa sạch với nước, sấy khô và giừ ở điều kiện vô trùng Khi đem bảo quản với vi sinh vật thì đổ cát vào ống nghiệm có chứa môi trường thạch có vi sinh vật phát triển ở trên mặt thạch, lắc đều, rồi cho toàn bộ cát lẫn vi sinh vật vào một ống nghiệm khác Trét kín miệng của ống nghiệm này và đem bảo quản.

- Hạt có thể được sử dụng để bảo quản các chủng vi sinh vật tạo hoặc không tạo bào

tử Hạt thường được sử dụng là các loại hạt ngũ côc như lúa chẳng hạn, đem nấu cho hạt vừa nứt vớt ra, để ráo Cho các hạt này vào ống nghiệm rồi phủ lên trên một lớp bông thâm nước Cấy giống vi sinh vật cần bảo quản lên lớp bông này, để cho chúng phát triển rồi sấy khò ớ nhiệt độ < 50“C cho đến khi độ ẩm đạt khoảng 8-10% Sau đó đem bảo quản ở nhiệt độ 15 - 20'١c

4' Phương pháp dông khô

Phương pháp này làm cho tế bào mất nước ở trạng thái tự do nhưng có khả năng

Giống vi sinh vật được nuôi trong môi trường đặc hiệu dạng lỏng, khi kiểm tra thấy tổng lượng tê bào và bào tử đạt được tôi đa, tiến hành phân phối chúng vào nhừng ống thủy tinh nhỏ chuyên dùng cho máy đông khô Tiến hành cho máy đông khô hoạt động và sau khi kết thúc, người ta hàn miệng các ống thủy tinh này lại Bằng cách này, giống được bảo quản trong một thời gian rất dài, không sợ bị thoái hóa nữa.

Chương 4

Vi sinh vật là những cơ thề sông vô cùng nhỏ bé Phần lớn các vi sinh vật không thể quan sát thây bằng mắt thường mà phải nhờ đến độ phóng đại của kính hiển vi Chính vì thế, kính hiển vi là một dụng cụ vô cùng quan trọng và không thể thiếu trong nghiên cứu các đặc tính hình thái của vi sinh vật như hình dáng, kích thước, khả năng

di động, sự hình thành bào tử, sinh sản, Các tiêu bản tạm thời thường được sử dụng

để quan sát hình thái vi sinh vật Dưới đây là cách làm tiêu bản tạm thời.

٠ Tay phải vô khuẩn que cấy vòng bàng cách đốt nóng dây cấy trên đèn cồn cho đến

đỏ rực Tiếp theo, tay phải lại mơ nút ống nghiệm hay nắp lọ bằng ngón út và lòng tay phải Giữ nguyên náp lọ như thế.

٠ Tay trái hơ miệng ống hay lọ trên ngọn lửa đèn '١ồn Nhanh chóng nhưng khéo léo đưa que câV đã nguội vào ống hay lọ đế lấy giống rồi rút que ra Lại hơ miệng ô"ng nghiệm hay lọ trên ngọn lửa đèn cồn rồi đậy nút ống nghiệm hay nắp lọ lại Để ống hay lọ vào vị trí cũ.

Lưu ý: Nếu môi trường trong ống hay lọ là đặc thì lấy một ít sinh khối bằng que cấy

vòng, tránh lây luôn cả thạch Còn nếu là môi trường dịch thể thì chỉ cần nhúng đầu que câ.y vào rồi lấy que cấy ra.

• Làm vết bôi trên phiến kính: cho giọt dịch chứa vi sinh vật trên đầu que cấy lên mặt của một phiến kính sạch, nếu vi sinh vật ở trạng thái sinh khối, cần phải hòa sinh khối này với một hay vài giọt nước cất vô khuẩn để tạo được huyền phù sao cho không quá đậm đặc ngay trên bề mặt phiến kính.

• Vô khuẩn que cấy trên đèn cồn rồi đặt nó vào vị trí cũ.

- Đặt lá kính lên giọt huyền phù vi sinh vật bằng cách đế một mép lá kính tiếp xúc với phiến kính rồi từ từ hạ lá kính xuống đê không có bọt khí tạo thành.

- Quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi.

P h ư ơn g pháp n g h iê n cứ u h ìn h th á i v i sin h v ật

2 TIÊU BÀN GIỌT TREO

Trong loại tiêu bản này, mầu vật cần quan sát được treo lơ lứng dưới một lá kính đặt

Loại tiêu bản này được dùng để quan sát khả năng di động cua vi sinh vật, theo dõ_

sự hình thành bào tử sự sinh sản và phản ứng ciia vi sinh vật khi bị kích thích.

Cách làm tiêu bản g iọ t treo

Để quan sát từng tế bào vi sinh vật, sử dụng vật kính dầu Quan sát và ghi lại kết quả và vẽ lại hình dáng vi khuẩn quan sát được.

Loại bò phiến kính vào đúng nơi qui định đế đem tiệt trùng.

3 TIÊU BẢN TẠM THỜI c ó NHUỘM MÀU

Thuốc nhuộm vi sinh vật phai không độc hoặc ít độc đối với vi sinh vật cần quan sát

và phải được pha loãng tổi nồng độ đám bảo đê sau khi nhuộm, vi sinh vật vẫn sống và hoạt động.

Tế bào sống và tế bào chết có thế được phân biệt khi nhuộm với xanh methylene Xanh methylene có màu xanh khi không có sự hiện diện của hydro, và không màu khi có hydro Khi các tế bào ở trạng thái nghỉ (trạng thái của phase ổn định trên đường cong sinh trưởng), mặc dù còn sống, thường không có khả năng khử màu xanh của methylene thành không màu Do đó, nên quan sát các tế bào khi chúng ở giai đoạn đầu của phase táng trưởng Có hai cách nhuộm màu vi sinh vật sống:

- Nhỏ một giọt xanh methylene ra bề mặt của một phiến kính sạch.

- Thêm vào đó một giọt chất lỏng chứa tế bào vi sinh vật.

- Cẩn thận đặt lĩiột ỉá kỉnh sạch lến trển giọt dịch hổn hợp

- Quan sát giọt ẽp dưới kính hiển vi nền sáng với các vật kính x io rồi x40.

- Nhỏ một giọt xanh methylene ra bề mặt của một phiến kính sạch.

- Dàn đều giọt thuốc nhuộm trên phiến kính bằng que cấy rồi để khô tự nhiên.

- Cho một giọt dịch chứa vi khuẩn lên vùng thuốc nhuộm dã khô.

- Quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi nền sáng với các vật kính xio rồi x40

BÀI 7; NGHIÊN c ứ u HÌNH THÁI VI KHUẨN

Vi khuẩn có cấu tạo đơn bào, đa số chúng có đường kính từ 0,2 - 2,0 pm, chiều dài từ

2 - 8 pm Hình dáng tế bào có thể là hình cầu, hình que, hình xoắn hay hình dấu phẩy; các

tế bào có thể tồn tại đơn lẻ hay có thể kết đôi, kết chuỗi và kết chùm Chúng sinh sản chủ yếu bằng hình thức phân đôi tế bào Một số loài vi khuẩn có khả nàng tạo bào tử; một số loài khác có khả năng di động nhờ chúng có tiên mao.

Khi quan sát vi khuẩn, nói chung cần quan sát các đặc điểm mang tính đặc trưng như hình dáng, kiểu liên kết giừa các tế bào, khả nàng di động, sự hình thành báo tử và nhuộm Gram Tuy nhiên, muốn quan sát các đặc điểm khác nhau của vi khuẩn thì cách quan sát cũng có khác nhau, ví dụ: muốn quan sát khả năng di động của vi khuẩn thì phải làm tiêu

Phướng pháp n g h ỉên cứu h in h tháỉ vi einh vật 39

bản giọt tre.؛ muốn quan sất hinh đấng vi khuẩn thi lầm tiêu bẳn giọt ếpí hay muốn xem

vi khuẩn là Gram dưcmg hay Gram ầm thi phổi tiến hành nhuộm Gram,

Dầu soi thường dược sử dụng dể quan sắt vi khuấn vdi vặt kinh xioo.

Sau dây là mật số phương phấp thướng dược sử dụng dề quan sốt hlnh thối vi khuấn.

7.1 NHUỘM GRAM

Đây là phương phấp nhuộm vi khuẩn của Christian Gram Nhuộm Gram không những giUp phần biật vi khuẩn nh٥ cấc dặc diểih hlnh thối và sự sáp xếp của tế bảo mà còn cung cấp thống tin về Idp vố tế bầo Khi nhuệm theo phương phốp nầy, tế bầo vi khuẩn Gram dương có lởp vồ tế bằo dầy tạo bdi peptidoglycan sẽ cố mầu tim, còn vi khuẩn Gram

âm có lớp vỏ tế bào mồng hơn (do cố ít peptidoglycan hơn) và dược bao bọc bởi một mầng mỏng sẽ cO mầu hồng.

Theo phương phấp nhuộm Gram, vết bôi vi khuẩn dược tạo ra, lầm khô và hơ ndng nhẹ dể tê' bầo vi khuẩn dinh chẩc vầo bề mặt phiến kinh Sau đố, vết bôi dược nhuộm vdi crystal violet, thuốc nhuộm dư dược rửa trôi rồi thêm dung dịch iodine vào vết bôi Iodine lầm nhiệm vụ gán chất mầu vầo tế bầo Tiếp theo, vê't bôi dược khử mầu bdi cồn và dược nhuộm lại với safranin ở tê' bầo vi khuổn Gram dương, mầu tim của crystal violet dược gán chắc vầo lớp vỏ tế bào nhơ iodine, không bị khử bdi cồn và vi thế mà tế bầo vi khuẩn vần

mang mằu tim Trái lại, màu tim ở tế bầo vi khuẩn Gram âm bị khử bdi cồn và tế bầo

khOng màu lại bất vơi mầu hồng của safranin.

Một số điểm cần lưu ý

1- Vi khuẩn Gram dương cố thể bị mất khà nống giữ mầu tim khi tế bâo về giằ Vì thế nên sử dụng các tế bầo dược nuôi cấy chi qua dêm CUng cần lưu ỷ ràng tế bầo vi khuẩn Gram dương cổ thể xuất hiện dươi dạng Gram âm, nhưng tế bầo vi khuẩn Gram ầm thi khOng bao giở xuất hiện dươi dạng Gram dương.

2- Vi khuẩn Gram dương cUng cO thể xuất hiện dư٥i dạng Gram ầm do khử mầu quấ mức bởi cồn, vì vậy không nên sử dụng quá nhiều cồn và khử mầu quấ lầu.

3- Nếu vết bôi quấ dầy, thuốc nhuộm sê thấm vầo cốc tế bầo một cốch không dều 4- Cố thể thay thế safranin bdi một thuốc nhuộm khấc dễ phần biệt vơi mầu tlm.

1- Cấc lọ dựng cắc thuốc nhuộm Gram (S6)

2٠ Giẩ nhuộm và phiến kinh nhuộm

3- Cắc vi khuẩn sau dược nuối cấy qua dẽm trẽn thạch nghiêng TSA (Trypticase Soy Agar) (Ml)

- Staphylococcus epldcrmldis

4 0 Chương 4

2~ Cách tiến hành

1- Nhỏ hai 0.1٠٦t- lén mọt phiến kính sạch Tạo huyền phù giọt thứ nhất (vết bòi)

VƠI một vi khuẩn chưa biết tên C'òn giọt thứ hai sẽ được tạo huyền phù với inột hồn hợp

cùa một vi khuẩn Gr.am dương và một vi khuẩn Gram âm đã biết Hỏn hợp này sè là đối

chứng để đảm bảo phương pháp nhuộm Gram được thực hiện điing Hơ nóng nhẹ phiến

kính (H.4.2).

P h ư ơn g pháp n g h iê n cứ u h ìn h th á i v i sin h v ậ t

1i

e) Khứ màn troììg ỉ-5s f) Rứa với tinớc trong 5s

1- Phù hoàn toàn vết bòi với thuòc nhuộm crystal violet Để yèn 30 giáy rồi nhẹ

nhàng rứa trôi thuốc nhuộm dư bằng nước (H.4.3).

2- Phu vết bôi này với dung dịch iodine trong khoảng 30 giây rồi lại rứa nhẹ nhàng

với nước.

3 Giừ phiến kính ở góc nghiêng nhò và cẩn thận nhỏ giọt cồn cho cồn chảy ngang qua vết bôi cho đến khi không thấy vết thuỏc nhuộm chảy theo Ngay lập tức rửa vết bôi

lại vdi nước Vết bôi dày có thế cần phầi được khử màu lâu hơn, tuy nhiên thời gian đế vết

bói tiếp xuc với cổn không nên lâu quá 5 giây Thời gian khứ màu trong bước này đóng vai

trò quan trọng quyết định kết quả cùa quá trình nhuộm.

4" Phú hoàn toàn vết bôi với safranin và đê yên trong vòng 30 giây Rứa với nước.

5 Thấm khô phiến kính với giấy thấm Khi phiến kính khô hoàn toàn, quan sát dưới kính hiển vi với vật kính dầu So sánh với mầu đối chứng trên cùng phiến kính.

6- Ghi lại và mô tả kết quả.

7.2 NHUỘM BÀO TỬ

Một số vi khuân như Bacillus hay Clostridium có khả năng tạo thành bào tử Bào tử

có thê tồn tại trong môi trường thiếu chất dinh dường, chịu được nhiệt và một sô các hóa

chất mà thê sinh dưỡng không thể.