Bài giảng Công nghệ Enzym Protein

Bài giảng Công nghệ Enzym Protein

Công nghệ Enzym Protein

 Thực phẩm: Làm bánh mì, rượu bia, các sản phẩm sữa

 Tẩy rửa: protease, lipase

 Xử lý tinh bột: các amylase, isomerase

 Dệt-da: amylase, lipase, cellulase

 Trợ tiêu hóa: amylase, protease

 Chẩn đoán: Alcol dehydrogenase, Cholesterol esterase, Creatinase, Glucose oxidase, Uricase

 Điều trị: Asparaginase, Lactamase, Urease, Uricase, Streptokinase

 Hóa dược: Steroid, Ibuprofen, Salbutamol, Propanolol

Khái niệm xúc tác sinh học

 Enzym là chất xúc tác của các quá trình sinh học,

 Bản chất là protein

 Giúp phản ứng đạt được điểm cân bằng nhanh hơn

 Enzym không thể xúc tác phản ứng với sự thay đổi năng lượng tự do không thuận lợi trừ khi phản ứng

đó có thể song hành với một phản ứng khác có sự thay đổi năng lượng tự do thuận lợi hơn

 Giúp phản ứng xảy ra nhanh hơn trong điều kiện bình thường về áp suất, nhiệt độ, pH

Công nghệ enzym hiện đại

 Hóa học protein

 Lý sinh phân tử

 Sinh học phân tử

 Cấu trúc, hoạt động của protein-enzym

 Can thiệp để thay đổi phân tử protein-enzym

Nhu cầu sử dụng enzym

Tinh thể tinh khiết

Tinh thể tinh khiết

Nguồn gốc Vi sinh vật,

thường ngoại bào

Vi sinh vật, động vật, thực vật,

thường nội bào

Vi sinh vật, động vật, thực vật,

thường nội bào Giá sản

xuất

Xúc tác sinh học

 Tính chọn lọc cao

 Chọn lọc theo vị trí nhóm hóa học

 Chọn lọc không gian

 Hoạt động trên cơ chất đa dạng

 Hoạt động được trong môi trường không phải là nước

 Khả năng đảm nhận lượng cơ chất cao

 Có độ bền đủ cao

 Tính kinh tế

Tính chọn lọc theo vị trí

N

N N

N

O CH3

NH2O

OH HO

N N

N

O CH3

NH2O

OH HO

Dẫn xuất Purine (Nelarabine) Sản phẩm acyl hóa

(R,S)-naproxen methyl ester

(S)-naproxen

(R)-naproxen methyl ester

Sản xuất enzym - Nguồn nguyên liệu

Sản xuất enzym - Nguồn nguyên liệu

 Chiết tách từ mô: lysozym, papain, bromelin, …

 Lên men bề mặt: amylase, protease nấm mốc

 Lên men chìm: các enzym dùng trong phân tích và y học

 Qui mô lớn: enzym thô dùng trong công nghiệp

 Qui mô nhỏ: enzym dùng trong y học

 Chủng được chọn lọc thông qua biến đổi di truyền

Phương pháp sản xuất - Tổng quát

Chuẩn bị nguyên liệu

Chuẩn bị nguyên liệu sinh học

 Cơ quan động vật

đệm

 Nguyên liệu thực vật

 Vi sinh vật

 Hóa học: chất tẩy, kháng sinh

 Enzym: lysozyme, kháng sinh

French-press

Sản xuất enzym - Chiết tách

 lọc áp suất, lọc chân không

 lọc chảy qua (cross-flow filtration)

 Phương pháp kết bông

Đánh bắt ion kim

loại

Nguyên lý Sắc ký

Nguyên lý Sắc ký

Chọn Phương pháp sắc ký

GF = Lọc gel

AC = Sắc ký Ái lựcIEX = Sắc ký Trao đổi IonHIC = Sắc ký Tương tác kỵ nước RPC = Sắc ký Pha đảo

Ví dụ tinh chế amylase bằng hấp phụ

Dịch Enzym thô

Phức Enzym Alginat natri

Tủa Enzym Alginat Calci

Alginat Calci

Sản phẩm amylase

• Cô đặc

• Thẩm tích

Ví dụ sản xuất Taq polymerase

Taq polymerase tinh khiết

Môi trường thừa

Xác tế bào

Dịch nổi

 Nhờ sự cố định mà enzym không lẫn vào sản phẩm

cuối

 Enzym cố định bảo quản tốt hơn enzym tự do cùng

loại

 Nhược điểm

 Giảm hoạt tính của enzym so với ban đầu.

 Cản trở về không gian do liên kết với chất mang làm hạn chế sự tiếp xúc giữa enzym và cơ chất.

Vật liệu cố định

 Chất mang phải rẻ tiền, dễ tìm hoặc dễ tổng hợp

 Chất mang phải có tính cơ lý ổn định

 Chất mang phải bền vững về mặt hóa học, không hòa tan trong môi trường phản ứng.

 Chất mang phải có diện tích bề mặt lớn

 Có khả năng trương nở trong môi trường

Liên kết đồng hóa trị

Liên kết chéo

Không đổi Không đổi Thay đổi Thay đổi Không đổi

Khả năng tái cố

định

Khả năng ứng dụng Thấp Trung bình Trung bình Thấp Cao

Ứng dụng enzym trong ngành dược

 Liệu pháp enzym

 Enzym trong sản xuất thuốc

Trị liệu bằng enzym

 Thay thế enzym do bệnh di truyền

 Thay thế enzym do một bệnh mắc

phải

 Cung cấp tác dụng sinh học đặc hiệu

 Dùng trong điều trị hỗ trợ khi phối

hợp với các liệu pháp khác, hay để

giải độc máu hay mô.

Liệu pháp enzym - Yêu cầu của enzym

 Phải đến được vị trí tác động của chúng trong cơ thể hay mô.

 Phải có hoạt tính trong các điều kiện môi trường tại nơi tác

 Độ tinh khiết đủ cao

 Có hiệu quả điều trị dựa trên hoạt tính đặc hiệu của enzym

được dùng Hiệu quả của liệu pháp phải được chứng minh

 An toàn đối với bệnh và chỉ định điều trị

 Dạng sử dụng thuận tiện

Các vấn đề của thuốc protein

 Thời gian phát triển ngắn

 Tỷ lệ thành công khi xin cấp phép cao

Nguồn enzym

 Chiết xuất - Tinh chế:

 Không phải người: nấm, vi khuẩn, động vật, thực vật

 Người

 Tái tổ hợp

 Sử dụng gen người tái tổ hợp trong tế bào khác

 Cải thiện hoạt tính, đặc điểm thông qua cải tiến trình tự

 Năng suất cao

 Không thực hiện được biến đổi hậu dịch mã

 Sinh vật chuyển gen

 Liệu pháp gen

Sản xuất thuốc bằng công nghệ enzym

cnshduoc@gmail.com`

Thuốc đối quang

 Cấu trúc không gian của phân tử sinh học và thụ thể

 Chỉ một trong hai đồng phân có hoạt tính,

 Các đồng phân có hoạt tính khác nhau

 Dược động học và chuyển hóa khác nhau

 Thuốc tinh khiết quang học (enantiopure

Thuốc đối quang

Tác dụng dược lý chính Khác biệt giữa các đồng phân

Thuốc chẹn β:

propranolol, acebutolol, atenolol, alprenolol,

betaxolol, carvedilol, meto-prolol, labetalol,

pindolol, sotalol, …

l > d (d = không có hoạt tính)

Ví dụ: S(-)-propranolol > R(+)-propranolol

Thuốc chẹn kênh calci:

verapamil, nicardipine, nimodipine, nisoldipine,

felodipine, mandipine …

l > d

Ví dụ: S(-)-verapamil > R(+)-verapamil

Thuốc giãn phế quản:

albuterol (salbutamol), salmeterol và terbutaline

l > d (d = không có hoạt tính)

Ví dụ: R(-)-albuterol > S(+)- albuterol

An thần:

hexobarbital, secobarbital, mephobarbital,

pentobarbital, thiopental, thiohexital

ibuprofen, ketoprofen, benoxaprophen, fenprofen

Thuốc đối quang - racemic

Bất đối: 252

Không bất đối: 269

Chế phẩm dạng racemic: 140 Tổng hợp: 521

Chế phẩm một

đồng phân: 110

Các loại phản ứng được xúc tác bởi enzym

EC 1 Oxidoreductases

Không đòi hỏi đồng cơ chất

Oxi hóa/khử đối với –CH–OH, –C=O, –C=C, …

EC 2 Transferases

Không đòi hỏi đồng yếu tố

Chuyển các nhóm chức như halogen, aldehyde, keto, acyl, glycosyl, …

EC 3 Hydrolases

Không đòi hỏi đồng yếu tố

Thủy phân/ngưng tụ các ester, glycosid, nitril, amid, halogen, …

EC 4 Lyases

Không đòi hỏi đồng yếu tố

Thêm/loại bỏ; cắt các liên kết C–C, C–O, C–N

EC 5 Isomerases

Không đòi hỏi đồng yếu tố

Đồng phân hóa, chuyển dạng cis-trans, epime hóa

EC 6 Ligases

Cần đồng cơ chất ATP

Tạo các liên kết C–O, C–S, C–N, C–C

Một số vấn đề công nghệ

 Chi phí cố định phải bù đắp được bởi sự gia tăng tính ổn định

hoặc hoạt tính

 Giảm thiểu sự mất hoạt tính trong quá trình cố định

 Khi enzym được cố định bằng phương pháp có tính thuận

nghịch, sự rò rỉ enzym phải được nghiên cứu và có biện pháp thích hợp

 Sự giới hạn về luân chuyển vật chất trong chất mang cần được

tính toán khi điều chỉnh pH hay nhiệt độ trong quá trình phản ứng

 Với enzym tự do, hoạt tính chuyển hóa có thể đạt được cao

hơn ở nồng độ enzym cao, do đó việc chuyển hóa các cơ chất khó có thể thực hiện được.

 Tính vô trùng của phản ứng cần được quan tâm

 Sự tương thích của dung môi với chất mang và ảnh hưởng của

dung môi đến hoạt tính cần được xem xét.

Oxidoreductase

N

N N

N HN

Cl O

OH HO

HO

Ph Ph

N

N N

N HN

Cl O

OH HO

HO

Ph

Ph O

Nucleoside Oxidase

H2O, pH 6, 25 oC, 12-24h 5'

 Nucleoside oxidase lấy từ Stenotrophomonas maltophilia

(FERM BP-2252)

 Sản xuất các dẫn xuất 5’-carboxylic acid của các

nucleoside đồng đẳng

 Enzym thô từ dịch chiết tế bào

 Hoặc enzym cố định trên Eupergit-C

F

OHCOOHOH

N

N N N

O O

O O

O O

O O

O O

OH

O O

CO2HF

NHO

CO2EtF

NH

F

O

OO+

Deaminase

N

NO

S

NH2

OHO

N

N

OS

NH2

OHO

N

NH

OS

O

OHO