TÌM HIỂU VÀ THU NHẬN HEMOGLOBIN TỪ MÁU ĐỘNG VẬT

TÌM HIỂU VÀ THU NHẬN HEMOGLOBIN TỪ MÁU ĐỘNG VẬT tài liệu, giáo án, bài giảng , luận văn, luận án, đồ án, bài tập lớn về...

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC 

ĐỀ TÀI:

TÌM HIỂU VÀ THU NHẬN HEMOGLOBIN TỪ MÁU ĐỘNG VẬT

GVHD: NGUYỄN THỊ THU SANG

NHÓM SV:

Nguyễn Thanh Phượng

Lê Văn Phong Phan Thị Anh Thư Nguyễn Thùy Hoài Thương Trần Thị Phương Thảo

PHẦN 1: TỔNG QUAN

I MÁU:

I.1 Khái niệm: Máu là một tổ chức di động được tạo thành từ các thành phần hữu hình là các tế bào (hồng cầu, bạch cầu,tiểu cầu) và huyết tương

 Các thành phần hữu hình (chiếm 45% thể tích máu) gồm

• Hồng cầu: chiếm 96% Ở động vật có vú, hồng cầu trưởng thành mất nhân và các bào quan Hồng cầu chứa hemoglobin và có nhiệm

vụ chính là vận chuyển và phân phối ôxy

• Bạch cầu: chiếm khoảng 3% là một phần quan trọng của hệ miễn dịch có nhiệm vụ tiêu diệt các tác nhân gây nhiễm trùng và phát động đáp ứng miễn dịch của cơ thể Bạch cầu được chia thành hai nhóm chính là bạc cầu hạt(bc trung tính, bc ưa acid,bc ưa kiềm) và bạch cầu không hạt(bc đơn nhân, lymbo bào)

• Tiểu cầu: chiếm 1%, chịu trách nhiệm trong quá trình đông máu Tiểu cầu tham gia rất sớm vào việc hình thành nút tiểu cầu, bước khởi đầu của quá trình hình thành cục máu đông trong chấn thương mạch máu nhỏ

 Huyết tương (chiếm 55% thể tích máu) là dung dịch chứa đến 96%

nước, 4% là các protein huyết tương và rất nhiều chất khác với một lượng nhỏ, đôi khi chỉ ở dạng vết Các thành phần chính của huyết tương gồm:

• Albumin

• Các yếu tố đông máu

• Các globulin miễn dịch (immunoglobulin) hay kháng thể

(antibody)

• Các hormone

• Các protein khác

• Các chất điện giải (chủ yếu là Natri và Clo, ngoài ra còn có

can xi, kali, phosphate

• Các chất thải khác của cơ thể

I.2 Chức năng:

• Hô hấp: vận chuyển O2, từ phổi tời các tổ chức vá vận chuyển

CO2 từ các tổ chức tới phổi nhờ Hb của hồng cầu

• Dinh dưỡng: vận chuyển chất dinh dưỡng như glucose,acid amin, lipid

• Bài tiết: vận chuyển chất bã từ quá trình biến dưỡng như urê,

CO2 tới thận, phổi, da,ruột để thải trừ

• Duy trì sự cân bằng acid-base bình thường trong cơ thể nhờ các

hệ thống đệm

• Điều hòa sự cân bằng nước qua tác dụng của nước qua tác dụng của máu lên sự trao đổi nước giữa dịch tuần hoàn và dịch ở tổ chức

• Điều hòa thân nhiệt bằng sự phân bố nhiệt cơ thể

bảo vệ chống nhiễm trùng nhờ các bạch cầu vá các kháng thể

• Vận chuyển các Hormon, điều hòa chuyển hóa và vận chuyển các chất chuyển hóa

I.3 Tính chất:

• Tỷ dung(Hematocrit) là phần trăm thể tích giữa hồng cầu và huyết tương Giá trị này được tính là % lít máu

• Thể tích máu: phụ thuộc vào kích thước cơ thể, tình trạng sinh

lý, dinh dưỡng, tuổi, mang thai…

• Tốc độ lắng hồng cầu: là hồng cầu trong máu lắng tụ dưới đáy ống nghiệm Tốc độ lắng hồng cầu ở mỗi loài khác nhau ở người là 4- 7mm

Bảng 1 Tỷ trọng, tỷ dung và thể tích máu của một số ĐV

II HEMOGLOBIN

 Là huyết tố cầu (kí hiệu Hb), một

cromoprotein có màu đỏ ở trong hồng cầu

động vật bậc cao Chính xác hơn là một

porphyrinoprotein bao gồm một protein

thuần GLOBIN và các nhóm ngoại

HEME Hồng cầu người chứa khoảng 32%

là Hb , tương ứng với 15,5 ± 1g/100ml

máu toàn phần ở nam và 14,4 ± 1g/100ml

máu toàn phần ở nữ hemoglobin ở trong

hồng cầu và được màng hồng cầu bảo vệ

 Trong thiên nhiên có nhiều loại Hb, mỗi loài sinh vật đều có một loại H b khác nhau, sự khác nhau này tùy thuộc vào nhóm globin, do vậy khi kết tinh, các Hb sẽ kết tinh dưới dạng tinh thể Hb tùy loài

II.1 Cấu tạo của Hemoglobin:

Hemoglobin gồm có hai phần:

- phần protein thuần: GLOBIN

- phần nhóm ngoại : HEME

2 chuỗi alpha Globin

Hemoglobin 2 chuỗi beta

Protoporphyrin IX Heme

Fe2+

Cấu tạo của HEMOGLOBIN

II.1.1 Heme:

Trong nhiều loại porphyrin khác nhau, chỉ có một dạng isomer có tên

protoporphyrin IX ( thực chất là một tetrapyrol gắn với 8 gốc thế gồm 4 gốc methyl ở các vị trí 1,3,5,8; hai gốc vinul ở các vị trí 2,4; và hai gốc propionyl ở

vị trí 6,7) hiện diện trong hệ thống sinh học

Heme được tạo thành bao gồm nhân protoporphynin IX gắn với một nguyên tử sắt hóa trị 2, bởi bốn liên kết giữa Fe2+ với 4 nitơ(N) của 4 vòng pyrol( 2 lk cộng hóa trị và 2 lk phối trí)

Cấu tạo của HEME

Heme bị oxy hóa sẽ biến thành hematin, Fe2+ trở thành Fe3+ Hematin có thề tách riêng dưới dạng muối clohydrat gọi là tinh thể hemin, tinh thể này có màu tím và được tạo ra bằng cách đun Hb với một hỗn hợp muối NaCl và axit acetic Tinh thể Hemin được sử dụng trong pháp y để xác định loại máu tại hiện trường II.1.2 Globin:

Ở người trưởng thành globin của Hb gồm 4 chuỗi polypeptid, trong đó có:

- Hai chuỗi α (mỗi chuỗi gồm 141 acid amin)

- Hai chuỗi β (mỗi chuỗi gồm 146 acid amin)

Trong khi đó toàn bộ phân tử Hb chứa 574 acid amin Bằng các phương pháp nhiễu xạ tia X vào các tinh thể Hb và các phương pháp sinh hóa khác người ta

đã phân tích cấu trúc 4 bậc của Hb.

-Về cấu trúc bậc II: các chuỗi α và β có hơn 70% acid amin tạo nên 7 xoắn α (chuỗi α) và 8 xoắn β (chuỗi β) có chiều dài từ 7 đến 20 acid amin Xoắn α được

ký hiệu là A đến G và xoắn β được ký hiệu từ A đến H

-Về cấu trúc bậc III: càc chuỗi α và βcuộn khúc tại các đoạn acid amin không xoắn,cấu trúc bậc III này rất giống cấu trúc bậc III của myoglobin

Myoglobin chuỗi β của hemoglobin

-Về cấu trúc bậc IV: mỗi một chuỗi polypeptid xoắn và cuộn khúc kết hợp với một heme tạo thành một bán đơn vị Hb Bốn bán đơn vị hợp lại tạo thành một phân tử Hb có cấu trúc bậc IV

Người ta đã xác đinh được nhiều loài Hb khác nhau và trình tự các acid amin trên mỗi loại Hb đó ở người trưởng thành đa số Hb là HbA (98%) gồm hai chuỗi α và hai chuỗi β ngoài ra còn có một phần rất nhỏ HbA2 ( hai chuỗi α và hai chuỗi δ) Tuy nhiên vẫn còn có một số kiểu Hb nữa xuất hiện trong quá trình phát triển phôi thai Tất cả các loại Hb này đều có phần globin chứa 4 chuỗi polypeptide

I.2 Tính chất:

I.2.1 Kết hợp thuận nghịch với oxy tạo oxyhemoglobin:

Hb kết hợp với oxy (O2 ) tạo oxyhemoglobin (HbO2 ), đây là phản ứng gắn oxy

và thuận nghịch Phân tử oxy gắn lỏng lẻo với nguyên tử Fe2+ qua cầu nối là liên kết phối trí vì vậy mà hb gắn và thả oxy một cách dễ dàng

Hb + O2  HbO2

Môt nguyên tử sắt của một heme gắn được với một phân tử oxy, nên môt phân

tử Hb gắn được với 4 phân tử oxy,do đó 1g Hb gắn được 1,39 ml O2 Sự kết hợp

và phân ly giữa O2 và Hb được xác định bằng phân áp của oxy (pO2) ở môi trường xung quanh Hb

Tại phổi pO2 cao (100 mmHg), phản ứng xảy ra theo chiều thuận Hb bão hòa với oxy tạo thành HbO2 theo dòng máu tới mô Ở các mô pO2 thấp (40 mmHg), phản ứng theo chiều nghịch HbO2 phân ly nhả O2 cho mô trở thành hb mất oxy goi là deoxy Hb (HHb) Nhờ tính chất trên mà Hb đóng vai trò quan trọng trong

hô hấp là vận chuyển oxy từ phổi đến mô.Hb gắn với oxy theo cơ chế hiệp đồng Giữa pO2 và độ bão hòa của Hb cò mối tương quan được biễu diễn bằng đường cong phân ly oxy-Hb

Đường cong phân ly oxy- hemoglobin

I.2.2 Kết hợp với carbon dioxyd (CO2) tạo thành carbonyl

Hemoglobin (HbCO2):

CO2 là sản phẩm chuyển hóa cuối cùng ở các mô, được máu vận chuyển để thải

ra ngoài bằng đường hô hấp Với pO2=40 mmHg ở 37°C chỉ có 2,9 ml CO2 hòa tan trong huyết tương, vậy phần còn lại phải đươc vận chuyển dưới nhiều dạng khác nhau Trong đó hb tham gia vận chuyển trực tiếp(15%-20%) và gián tiếp (70%) trong tổng số CO2 tạo thành

• Hb kết hợp trực tiếp với CO2 qua nhóm amin tự do (-NH2) cùa globin chứ không phải là Fe+2 của nhóm heme, tạo thành HbCO2

RNH3 + CO2  2H+ + R NH  COO-

(dẫn xuất carbanyl)

• Hb vận chuyển CO2 một cách gián tiếp.Đây là dạng vậ chuyển theo con đường thủy hóa xảy ra nhanh và mạnh trong hồng cầu vì sự có mặt của enzyme carbonic anhydrase (CA) CO2 từ mô tái hấp thu vào máu, dưới tác dụng của CA ở hồng cầu

CA

CO2 + H2O H2CO3  2H+ + HCO3

Sơ đồ vận chuyển CO2 gián tiếp của Hemoglobin

I.2.3 Kết hợp với carbon monocyd (CO) tạo carbon monocyd hemoglobin:

CO gắn vào hb tại những điểm gắn của oxy, nhưng CO lại có ái lực với Hb lớn hơn oxy 210 lần do đó CO cạnh tranh với oxy để gắn vào Hb,đồng thời CO

có khả năng đẩy oxy ra khỏi HbO2 HbCO tạo thành rất bền vững, không vận chuyển oxy mà cỏn làm cho HbO2 khò nhả O2 hơn

Hb + CO  HbCO

HbO2 + CO  O2 + HbCO Khi pCO = 0,7 mmHg sẽ gây chết người Trong trừong hợp này, người ta phải giữ thông khí tốt cho bệnh nhân, cho ngửi oxy nồng độ cao hay điều trị bằng oxy cao áp để phân ly HbCO

I.2.4 Oxy hóa hemoglobin tạo methemoglobin

MetHb là Hb co nguyên tử Fe2+ của nhóm heme bị oxy hóa thành Fe3+

Ở dạng này Hb mất khả năng gắn oxy nên không còn khả năng vận chuyển oxy nữa

Nhiều chất oxy hóa như sodium nitrit, clorat, ferricyanua, nitrobezen,

nitrophenol… và một số thuốc điều trị bệnh như sodium nitroprussiat,

nitroglycerin… là nguyên nhân gây MetHb

Bình thường trong cơ thể, việc duy trì nồng độ MetHb dưới 1% là nhiệm vụ của

hệ thống khử của hồng cầu như là hệ thống NADH dependent, methemoglobin reductase Khi có nhiều chất oxy hóa vượt quá khả năng khử của hổng cầu, MetHb trong hồng cầu sẽ tăng lên, gây nên tình trạng thiếu oxy (MetHb> 1,5%

tím tái)

I.2.5 Tính chất enzyme của Hb

Hb có tính chất của một oxydoreductase xúc tác phản ứng oxy hóa khừ

• Tính chất của một peroxydase rõ rệt

H2O2 + AH2  2H2O + A

• Có hoạt tính của catalase yếu

• 2H2O2  2H2O + O2

I.3 Tổng hợp Hemoglobin trong cơ thể

 Tổng hợp Globin:

Quá trình tổng hợp globin xảy ra tương tự như quá trình tổng hợp protein khá Các gen quyết định cấu trúc của chuỗi α và chuỗi ζ được sắp xếp thẳng hàng nằm trên nhiễm sắc thể thứ 16 Các gen quyết định cấu trúc của các chuỗi γ,δ, β tạo thành một cụm với nhau nằm trong một vùng thuộc nhiễm sắc thể thứ 11, còn gọi là phức hợp gen γδβ Phía trước của các vùng mã hóa cho mỗi một gen globin là một loạt các yếu tố khởi động và tăng cường

Gen mã hóa Globin

 Tổng hợp Heme

Quá trình tổng hợp heme bắt đầu và kết thúc đều xảy ra ở ty thể, tuy nhiên giai đoạn giữa lại xảy ra ở bào tương.Tất cả các mô đều có khả năng tạo heme trừ hồng cầu trưởng thành do thiếu ty thể.Gan và tủy xương là hai

cơ quan tạo ra nhiều heme nhất.Quá trình tổng hợp heme dược chia làm 3 giai đoạn

 Giai đoạn 1: Tạo acid δ-amino levulinic (δ-AAL)

Trong ty thể, glycin kết hợp với succinyl CoA là sản phẩm trung gian của chu trình Krebs để tạo α-amino β-cetoadipic, sau đó chất này nhanh chóng

bị khử carboxyl để tạo acid δ-amino levulinic

 Giai đoạn 2: Tạo coproporphyrin III tại bào tương, gồm 3 bước: Bước 1: Tạo porphobilinogen (PBG)

δ-AAL tạo thành rời khỏi ty thể nhờ khuyếch tán thụ động, trong bào tương 2 phân tử δ-AAL kết hợp với nhau tạo porphobilinogen

Bước 2: Tạo uroporphyrinogen III

Trong bào tương, 4 phân tử PBG trùng hợp với nhau tạo thành vòng polymer uroporphyrinogen vì mỗi vòng pyrol uroporphyrinogen có hai chuỗi bên khác nhau nên có thể có 4 dạng isomer được tạo thành Thực tế cơ thể chỉ

có hai loại isomer I và III được tạo thành, heme thuộc isomer III

Bước 3: Tạo coproporphyrin III

Bốn chuỗi bên acetat của uroporphyrinogen III được enzyme

uroporphyrinogen decarboxylase xúc tác chuyển thành nhóm methyl để tạo coproporphyrin III

Giai đoạn 3: Tạo protoporphyrin IX và gắn Fe2+ vào protoporphynyl

IX để tạo heme trong ty thể

Coproporphyrin III vào ty thể, trong ty thể 2 chuỗi bên propionat được biến đổi thành 2 nhóm vinyl để tạo thành protoporphyrinogen IX, sau đó

protoporphyrinogen IX bị oxy hóa nhờ enzyme protoporphyrinogen oxydase ở khoang bên trong màng ty thể tạo thành protoporphyrin IX

Enzyme heme synthase hay ferrochelatase của ty thể xúc tác quá trình gắn Fe2+

vào trong protoporphyrin IX tạo thành Heme

Sau đó Heme rời ty thể kết hợp với globin tạo thành Hemoglobin

THUYẾT TRÌNH QUY TRÌNH

Máu bò tươi thu được ta đem li tâm 3000v/phút, trong khoảng 10 phút, dung dịch sẽ tách làm hai pha ta dùng micropipet hút phần dịch bỏ đi, thu được phần tủa chứa hồng cầu, tủa này hòa vói nước muối 4‰, theo tỉ lệ 1:1 nhiệt độ 7

-100C, khuấy đều dịch trong 5 phút Sau đó đem li tâm lần 2 với vận tốc li tâm 4000v/phút.trong giai đoạn náy màng hồng cầu bị phá vỡ giải phóng ra chủ yếu

là Hemoglobin( trong hồng cầu Hemoglobin chiếm 90% phần chất khô và 10%

là các tạp chất khác), thu tủa rửa 3- 4 lần với dung dịch muốicho đến khi nước rửa âm tính với TCA (lúc này các tạp chất còn sót lại trong tủa sẽ bị cuốn trôi đi) sau đó rửa tủa lại bằng nước cất để loại bỏ bớt các ion của muối còn xót lại giúp cho quá trình thẩm tích xảy ra nhanh hơn Sau đó dùng phương pháp thẩm tích loại muối ở nhiệt độ < 100C cho đến khi nước thẩm tích âm tính với AgNO3

sau đó thu phần còn lại đi sấy đông khô

Mẫu sau khi sấy khô sẻ được cho vào lọ màu tối đậy kín,bảo quản ở nhiệt độ thấp

III:ỨNG DỤNG:

1 CHẤT THAY THẾ MÁU:

Chất thay thế máu

Trên thế giới hiện nay, mỗi năm thiếu hơn 50 triệu lít máu để thoả mãn nhu cầu truyền máu, nhưng lượng máu hiến lại giảm Để hạn chế sự nhiễm, các

tổ chức y tế không nhận máu của người trên 60 tuổi, những người đã được truyền máu và những người xăm mình Số ca phẫu thuật lớn lại tăng lên do dân số tăng và tuổi thọ kéo dài Vì vậy, việc nghiên cứu các chất thay thế máu trở thành vấn đề bức thiết

Tại Hội nghị quốc tế Parme (Ý) từ 17 đến 20 - 9 - 2006, nhiều công trình nghiên cứu về máu nhân tạo, chất thay thế máu đã được báo cáo

PolyHeme đã được công ty Northfield (Mỹ) hoàn tất các thử nghiệm lâm sàng.

Đây là một sản phẩm máu nhân tạo, mà vấn đề nhóm máu không cần thiết phải đặt ra

Được thử nghiệm trên 720 nạn nhân giao thông (chỉ có 10 ca tử vong vì thương tích quá nặng), PolyHeme đã thể hiện có khả năng giữ vững tỷ lệ hemoglobin trên 7g/dl, nồng độ mà cơ thể còn có thể chịu đựng (bình thường phải là 14g/dl), trong lúc chờ đưa bệnh nhân dến bệnh viện để xét nghiệm lúc chờ xét nghiệm nhóm máu Chế phẩm này được sản xuất từ phân tử hemoglobin của hồng cầu người Nó có khả năng oxy hoá các tế bào và các bộ phận của cơ thể Tuy nhiên, theo các chuyên viên, cần phải có cách ngăn chặn các phân tử PolyHeme chui vào làm tổn thương thận

Hemospan là hemoglobin người có một vỏ pylyethylen glycol (Peg) bao bọc.

Đây là loại máu nhân tạo dạng bột, chỉ cần pha một gói hemoglobin đông khô với nước là có máu nhân tạo để truyền cho bệnh nhân

Nó có thể bảo quản trong nhiều năm trong lúc máu bình thường chỉ có 2 ngày

Nó rất dễ sử dụng, không có vấn đề tương hợp với nhóm máu hay nhóm Rhesus Tuy nhiên, Hemospan không thể thay thế máu bình thường được vì nó chỉ cung cấp oxy tạm thời cho các mô Nó chỉ phục chế lượng máu trong trường hợp mất nhiều máu Nó rất có lợi khi truyền máu cấp cứu, nhưng khi đến bệnh viện cần tiếp máu thật

Cũng như PolyHeme, Hemospan được sản xuất từ “máu hiến” hết hạn sử dụng

Hemoglobin giun cát: nhóm Franck Zal (CNRS) đang nghiên cứu sử dụng

hemoglobin của giun cát để thay thế máu dùng cho người

Việc sản xuất máu toàn phần nhân tạo rất khó, vì máu bình thường có chứa nhiều tế bào đặc biệt, tế bào miễn dịch, protein liên kết với sự đông máu, hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu Các nhà nghiên cứu chỉ nhằm vào đặc tính vận chuyển