Tìm hiểu cách thu nhận kiểm tra độ tinh sạch và hoạt tính của enzyme có nguồn gốc từ vi sinh vật

2/ Thu nhận enzyme từ vi sinh vật2.1/ Thu nhận enzyme thô 2.2/Các phương pháp thu nhận enzyme thô 2.2.1/ Pháp pháp cơ học2.2.2/ Phương pháp cô đặc2.2.3/ Phương pháp siêu lọc2.3/ Các phươ

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TP HỒ CHÍ MINH VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC – THỰC PHẨM



ĐỀ TÀI:

sạch và hoạt tính của enzyme có nguồn gốc từ vi

sinh vật.

GVHD: Nguyễn Thị Trang

NHÓM THỰC HIỆN: NHÓM 12 LỚP HP: ĐHTP10B

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TP HỒ CHÍ MINH

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC – THỰC PHẨM

ĐỀ TÀI

NHÓM THỰC HIỆN: NHÓM 12

LỚP HP: ĐHTP10B GVHD: Nguyễn Thị Trang

1/ Lê Trí Thanh Giang (Nhóm trưởng) 14065321

Chúng em xin chân thành cảm ơn cô đã hướng dẫn cho chúng em về mặt

lý thuyết, hướng dẫn tài liệu tham khảo để chúng em có cở sở tìm hiểu

và hoàn thành bài tiểu luận Chúng em cũng xin chân thành cảm ơn Nhà trường, Thư viện đã tạo điều kiện thuận lợi nhất đê chúng em tìm hiểu, nghiên cứu và hoàn thành bài tiểu luận

LỜI CẢM ƠN

2/ Thu nhận enzyme từ vi sinh vật

2.1/ Thu nhận enzyme thô

2.2/Các phương pháp thu nhận enzyme thô

2.2.1/ Pháp pháp cơ học2.2.2/ Phương pháp cô đặc2.2.3/ Phương pháp siêu lọc2.3/ Các phương pháp tinh sạch enzyme

2.3.1/ Phương pháp kết tinh2.3.2/ Phương pháp điện di2.3.3/ Phương pháp sắc ký3/ Các phương pháp kiểm tra độ tinh sạch của enzyme từ vi sinh vật

4/ Hoạt tính của enzyme từ vi sinh vật

5/ Quy trình sản xuất, phương pháp kiểm tra độ hoạt tính của enzyme lipase6/ Quy trình sản xuất, phương pháp kiểm tra độ hoạt tính của enzyme amylase

7/ Quy trình sản xuất, phương pháp kiểm tra độ hoạt tính của enzyme pecrinase8/ Quy trình sản xuất, phương pháp kiểm tra độ hoạt tính của enzyme proteasePHẦN KẾT LUẬN

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHẦN MỞ ĐẦU

1/ Lý do chọn đề tài:

Trước thế kỷ XVII người ta đã biết sử dụng các quá trình enzyme trong đời sống song chỉ có tính chất kinh nghiệm thực tế và thông qua hoạt động của vi sinh vật Ðó là các quá trình lên men rượu, muối dưa, làm tương và nước chấm Ở thời

kỳ này người ta chưa hiểu về bản chất enzyme và các quá trình lên men Cho đến nữa đầu thế kỷ XIX các nhà khoa học đã khái quát được quá trình lên men là hiện tượng phổ biến trong sự sống và vai trò qua trọng của enzyme trong chuyển hoá các chất trong quá trình lên men

Đến nay việc nghiên cứu enzyme đã bước vào một giai đoạn mới với sự kết hợp nhiều ngành khoa học khác nhau: hoá học protein, lý sinh phân tử, sinh học phân tử…Trong nghiên cứu cũng như thu nhận, tinh chế enzyme, hay thiết kế định hướng những phân tử enzyme ưu việt hơn dạng tự nhiên Chế phẩm enzyme khôngchỉ được ứng dụng trong y học mà còn được ứng dụng trong nhiều lãnh vực công nghiệp khác nhau, trong nông nghiệp, trong hóa học… Do vậy, quá trình thu nhận

và tinh sạch protein/enzyme giữ vai trò cực kỳ quan trọng và không ngừng được

cải tiến để đạt được độ tinh sạch cao nhất để phụ vụ cho con người

2/ Mục đích nghiên cứu:

Hiểu và nắm rõ các phương pháp thu nhận enzyme từ vi sinh, phương pháp kiểm tra độ tinh sạch cũng như hoạt tính của enzyme từ vi sinh vật để ứng dụng trong công nghệ nuôi cấy, sản xuất các loại enzyme phục vụ cho các lĩnh vực khác

Biết được phương pháp để đánh giá độ tinh sạch của enzyme từ vi sinh vật, cũng như lựa chọn các loại dịch chiets có độ tinh sạch phù hợp với mục đích

2/ Thu nhận enzyme từ vi sinh vật

2.1/ Thu nhận enzyme thô

2.2/Các phương pháp thu nhận enzyme thô

2.2.1/ Pháp pháp cơ học2.2.2/ Phương pháp cô đặc2.2.3/ Phương pháp siêu lọc2.3/ Các phương pháp tinh sạch enzyme

2.3.1/ Phương pháp kết tinh2.3.2/ Phương pháp điện di2.3.3/ Phương pháp sắc ký3/ Các phương pháp kiểm tra độ tinh sạch của enzyme từ vi sinh vật

4/ Hoạt tính của enzyme từ vi sinh vật

5/ Quy trình sản xuất, phương pháp kiểm tra độ hoạt tính của enzyme lipase

6/ Quy trình sản xuất, phương pháp kiểm tra độ hoạt tính của enzyme amylase7/ Quy trình sản xuất, phương pháp kiểm tra độ hoạt tính của enzyme pecrinase8/ Quy trình sản xuất, phương pháp kiểm tra độ hoạt tính của enzyme protease

4/ Kết quả nghiên cứu

- Nắm được các quy trình thu nhận , tinh sạch , kiểm tra hoạt tính các loại enzyme vi sinh vật Từ đó, lựa chọn giống vi sinh vật phù hợp với mục đích nghiên cứu

- Hiểu các quy trình thu nhận, tinh sạch, kiểm tra hoạt tính các loại enzyme lipase, amylase, pectinase, protease từ nguồn vi sinh vật Ứng dụng nghiên cứu nhân giống vi sinh vật, sản xuất enzyme vi sinh vật với quy mô công nghiệp, làm giảm giá thành sử dụng

PHẦN NỘI DUNG

1/ GIỚI THIỆU CHUNG VỀ ENZYME

1.1/ Định nghĩa:

- Enzyme là những protein có khả năng xúc tác cho

những phản ứng hóa học với mức đặc hiệu khác nhau ở

nhiệt độ tương đối thấp

- Trong phản ứng enzyme xúc tác các phân tử lúc ban

đầu của quá trình được gọi là cơ chất, enzyme biến đổi chúng thành các phân tử khác nhau Enzyme có hiệu suất xúc tác lớn hơn các chất xúc tác hữu co và vô cơ khác Enzyme không chỉ xúc tác các phản ứng trong cơ thể sống, mà sau khi tách khỏi cơ thể sống chúng vẫn giữ được hoạt tính xúc tác ở những điều kiện xác định

- Enzyme có tính đặc hiệu, nghĩa là mỗi loại enzyme chỉ xúc tác cho một cơ chất nhất định

1.2/ Tính chất của enzyme:

- Enzyme có bản chất là protein nên có tất cả các thuộc tính lý hóa của protein Đa

số các loại enzyme có dạng hình cầu và không đi qua màng bán thấm do có kích thước lớn

- Tan trong nước và các dung môi hữu cơ phân cực, không tan trong ete và các dung môi không phân cực

- Dễ bị biến tính ở nhiệt độ cao Trong môi trường axit hoặc bazo cũng làm

enzyme mất khả năng hoạt động

- Enzyme có tính lưỡng tính

- Tính cường lực xúc tác

- Tính đặc hiệu

- Làm giảm năng lượng hoát hóa phản ứng

- Enzyme có hai nhóm: enzyme một cấu tử ( chỉ chứa protein) và enzyme hai cấu

tử ( trong phân tử còn có nhóm không phải protein)

Trong phân tử enzyme hai cấu tử có hai phần:

• Apoenzym: Phần protein, nâng cao lực xúc tác của E, quyết định tính đặc hiệu

• Coenzym: Phần không phải protein, trực tiếp tham gia vào phản ứng E, bảnchất là những hợp chất hữu cơ phức tạp

2/ THU NHẬN ENZYME TỪ VI SINH VẬT:

*Ưu điểm của nguồn thu enzyme vi sinh vật:

- Có thể thay đổi hệ enzme bằng cách thay đổi

điều kiện nuôi cấy và sử dụng các tác nhân

điều chỉnh Bằng cách này có thể vi sinh vật

tổng hợp mạnh hoặc một vài enzyme nào đó

theo mong muốn

- Khả năng sinh sản nhanh, phát triển mạnh và

sinh tổng hợp enzyme với vận tốc rất lớn nên

cho phép thu được một lượng lớn enzyme

trong khoảng thời gian ngắn một cách dễ dàng

- Khả năng chuyển hóa mạnh nên hoạt tính của enzyme vi sinh vật rất mạnh, vượt

xa so với các enzyme khác

- Vi sinh vật là nguồn nguyên liệu dùng sản xuất enzyme có nhiều ưu điểm nổi bật,

là nguồn nguyên liệu vô tận, có thể chủ động tạo ra được.Chu kỳ sinh trưởng của

vi sinh vật ngắn (16-100 giờ) Hệ enzyme vi sinh vật vô cùng phong phú Và phần lớn thức ăn nuôi vi sinh vật dễ kiếm và rẻ

- Enzyme vi sinh vật có hoạt tính rất mạnh, trong vòng 24 giờ vi sinh vật có thể chuyển hoá một lượng thức ăn gấp 30-40 lần trọng lượng cơ thể chúng

2.1/ Thu nhận enzyme thô

- Trên thực tế có nhiều phương pháp thu nhận enzyme từ vi sinh vật Một số phương pháp tách chiết như phương pháp cơ học, cô đặc, siêu lọc và các phương pháp tinh sạch enzyme phổ biến hiện nay như phương pháp sắc kí, điện di, kết tủa, màng bán dẫn

- Các Enzyme nội bào không có khả năng đi qua màng tế bào và màng của các cấu trúc tế bào chứa chúng Do đó, để chiết rút enzyme nội bào thì điều trước tiên ta phải phá vỡ cấu trúc tế bào có chứa ezyme và chuyển chúng vào dung dịch

- Sau khi đã phá vỡ cấu trúc tế bào, enzyme được chiết bằng nước cất, dung dịch đệm hoặc muối trung tính

2.2/ Các phương pháp thu nhận enzyme thô:

- Ly tâm là quá trình tách vật chất rắn ra khỏi dung dịch

Trong công nghệ enzyme, phương pháp ly tâm thường

được ứng dụng khá rộng rãi để thu nhận dung dịch

enzyme, dung dịch này chứa các enzyme ngoại bào

Enzyme nội bào nằm trong tế bào sinh vật, muốn thu nhận

enzyme nội bào ta phải tiến hành một giai đoạn phá vỡ tế

bào

- Phần lớn các enzyme ngoại bào (exoenzyme) là những

enzyme hòa tan Như vậy khi tiến hành ly tâm, dung dịch được tách khỏi các thànhphần rắn là dung dịch enzyme thô, dung dịch enzyme thô này còn chứa các thành phần sau:

+ Protein có hoạt tính sinh học

+ Các chất hòa tan khác

+ Nước

- Phương pháp ly tâm chỉ tách được thành phần rắn có tỷ trọng lớn hơn dung dịch Dịch thu được chưa phải là chế phẩm enzyme tinh khiết mà là chế phẩm enzyme thô, vì còn chứa protein không hoạt động, nước và các chất hòa tan khác

- Để tránh hiện tượng biến tính của enzyme, trong những mẫu nghiên cứu, người tathường tiến hành ly tâm lạnh, còn trong sản xuất theo quy mô công nghiệp, người

ta thường tiến hành trong điều kiện nhiệt độ thấp

- Trong quy mô công nghiệp, người ta thường tiến hành ly tâm thu nhận dung dịch enzyme bằng máy ly tâm liên tục Phương pháp ly tâm liên tục có những ưu điểm

là thời gian thu nhận sản phẩm nhanh, liên tục, và không gây ảnh lớn đến hoạt tính của enzyme Hiện nay, trong công nghệ enzyme, người ta đang sử dụng rông rãi bakiểu ly tâm: ly tâm hình trụ thẳng đứng, ly tâm liên tục nằm ngang, ly tâm liên tục nhiều đĩa

- Ngoài ba kiểu ly tâm điển hình trên, ở một số nhà máy sản xuất enzyme có sử dụng một số kiểu ly tâm khác Việc chọn kiểu ly tâm này hay ly tâm khác phải xem xét đến hai yếu tố rất quan trọng: nồng độ chất rắn (%), kích thước vật lắng

b/ Phương pháp lọc

- Trong công nghệ enzyme, sau khi phá vỡ thành tế bào sinh vật hay sau khi lên men, người ta thường sử dụng quá trình lọc để thu nhận dung dịch enzyme nội bào,

enzyme ngoại bào hòa tan.

- Lọc cũng là phương pháp tách thành phần rắn ra khỏi dung dịch Lọc là một phương pháp khi thực hiện thường gặp nhiều khó khăn như kích thước vật chất dưới tế bào thường rất nhỏ, và độ nhớt của dung dịch thường rất cao Cả hai yếu tố này đều làm cản trở quá trình lọc Tốc độ lọc phụ thuộc rất lớn vào: diện tích bề mặt vật liệu lọc, độ nhớt dịch lọc, sức đề kháng

- Trong công nghiệp sản xuất enzyme người ta thường sử dụng các kiểu sau:

+ Lọc ép: Lọc ép (lọc đĩa, buồng lọc) thường được sử dụng trong trường hợpdung dịch cần lọc có khối lượng nhỏ Phương pháp này sử dụng để lọc enzyme rất

có hiệu quả

+ Lọc chân không: Là phương pháp được ứng dụng nhiều nhất trong nghiên cứu và trong sản xuất các sản phẩm sinh học có hoạt tính Trong đó, lọc chân không quay được sử dụng nhiều hơn cả

+ Lọc theo dòng chảy cắt ngang: Trong những năm gần đây, nhiều nhà máy sản xuất enzyme sử dụng phương pháp lọc theo dòng chảy cắt ngang Theo đó, dòng dung dịch lọc sẽ chảy song song bề mặt nguyên liệu lọc Phần lọc sẽ được thoát qua vật liệu lọc và đi xuống phía dưới Phương pháp này có ưu điểm là giảm sức đề kháng quá trình lọc của vật liệu chất rắn

+ Lọc thông thường: Phương pháp lọc thông thường đã có từ rất lâu, hiện nay ở một số nhà máy vẫn còn sử dụng Phương pháp lọc này đang được thay thế dần bằng những phương pháp khác nhanh hơn, có hiệu quả hơn

Phá vỡ các tế bào vi sinh vật thường gặp nhiều khó khăn hơn các tế bào động vật và thực vật Các tế bào vi sinh vật thường dai hơn và có kích thước nhỏ (khoảng 0,2-10 μm), thường phải có phương pháp phá vỡ đặc biệt Nhiều enzyme m), thường phải có phương pháp phá vỡ đặc biệt Nhiều enzyme

từ nấm men và các vi khuẩn Gram âm có thể được chiết bằng cách dùng các dung môi không trộn nước, như toluen hoặc cloroform, có thể phá vỡ màng tế bào và giải phóng enzyme Các dung môi hòa tan nước, như ethanol và 2-propanol, được dùng để tách chiết enzyme từ khoảng gian bào, nhưng sử dụng các dung môi này đòi hỏi mức độ an toàn cao trong sản xuất ở quy mô lớn Các chất tẩy thích hợp có thể được dùng để tách chiết các phân tử enzyme nhỏ (trọng lượng phân tử dưới 70.000) Trong một số trường hợp enzyme ổn định ở giá trị pH cao, có thể sử dụngdung dịch kiềm để phân giải các tế bào vi khuẩn

Các tế bào vi sinh vật có thể được phá vỡ dễ dàng hơn bằng các phương thứcvật lý Siêu âm là kỹ thuật thích hợp và rất hiệu quả ở quy mô phòng thí nghiệm, nhưng khó ứng dụng ở quy mô sản xuất lớn Phá vỡ tế bào bằng cách dùng áp suất cao để đẩy nguyên liệu (dịch huyền phù tế bào dưới dạng bột nhão được làm đông

ở -20oC) qua các lỗ hẹp của máy nén thì tế bào sẽ bị phá vỡ do sự thay đổi pha và thay đổi thể tích cũng như do lực cắt của các tinh thể đá Phương pháp này có thể

sử dụng để phá vỡ các tế bào nuôi cấy ở quy mô lớn 100-1000 L/giờ Nhiều loại tế bào có thể bị phá vỡ bằng khuấy (rung) nhanh hoặc trộn lẫn với các hạt thuỷ tinh nhỏ hoặc các hạt gốm (ceramic) Ở quy mô phòng thí nghiệm, phương thức này rấtthích hợp Ở quy mô sản xuất lớn người ta sử dụng phương pháp nghiền bằng quả cầu thép Tỷ lệ và hiệu suất giải phóng enzyme phụ thuộc vào vận tốc lắc và kích thước của các loại hạt cũng như đường kính của thiết bị Với cùng một thể tích hạt

thì sử dụng một lượng lớn các hạt nhỏ sẽ hiệu quả hơn một lượng tương đối nhỏ các hạt lớn, vì nó làm tăng sự va chạm giữa các hạt và các tế bào.

2.2.2/ Phương pháp cô đặc:

Người ta phải cô đặc dung dịch enzyme nhằm một số mục đích sau:

- Làm tăng hoạt tính của enzyme trong một khối lượng dung dịch enzyme

- Làm giảm chi phí và công sức cho việc xử lý sau này

- Tăng khả năng bảo quản enzyme

- Giảm chi phí vận chuyển, bảo quản

- Tăng hiệu suất tác động của enzyme đối với cơ chất

bị mất nhiều, thậm chí có thể dẫn đến triệt tiêu hoạt tính

- Do đó, việc khống chế nhiệt độ cùng với thời gian cần thiết trong quá trình

cô đặc là điều rất cần thiết

- Trong công nghiệp, người ta thường sử dụng những phương pháp sau:

 Bốc hơi lớp mỏng

 Bốc hơi ly tâm lớp mỏng

 Bốc hơi ống dài

- Trong cơ thể, enzyme thường hoạt động trong điều kiện nhiệt hoạt động của

tế bào sống Trường hợp nhiệt độ vượt quá nhiệt độ hoạt động của tế bào sống, thì tế bào sẽ chết Enzyme mất hoạt tính là một trong những nguyên nhân làm tế bào chết, là vì khi đó các phản ứng trao đổi chất của tế bào sẽ không còn xảy ra nữa, sự trao đổi chất của tế bào bị ngưng trệ, tế bào không thể tồn tại

b Phương pháp kết tủa

- Kết tủa là phương pháp được sử dụng rất rộng rãi trong các nghiên cứu enzyme trong phòng thí nghiệm và sản xuất enzyme trong quy mô sản xuất công nghiệp Phương pháp kết tủa dựa trên nguyên tắc, enzyme là một phức hợp protein có khả năng tạo kết tủa với một số dung môi

- Trong quá trình kết tủa, người ta phân biệt hai thuật ngữ: kết tủa âm và kết tủa dương:

+ Kết tủa âm: là sự kết tủa protein tạp Phần protein cần thiết nằm trong dung dịch chứ không nằm trong phần tủa

+ Kết tủa dương thì hoàn toàn ngược lại, các protein cần thiết lại nằm trong phần kết tủa còn protein tạp nằm trong phần dung dịch

Vd Dịch enzyme được giữ ở 50 - 70<SUP>0</SUP>C trong thời gian xác định,sau đó protein tạp đã bị biến tính được loại bỏ bằng cách lọc hoặc ly tâm Như

vậy, dịch chiết protein thô bền với nhiệt có thể được thu nhận bằng cách cho kếttủa không thuận nghịch phần lớn các protein tạp.

Để thu nhận chế phẩm protein theo phương pháp kết tủa thuận nghịch bằng các muối trung tính, cần tiến hành ở nhiệt độ thấp, đối với dung môi hữu cơ cần tiếnhành ở nhiệt độ dưới 0<SUP>0</SUP>C tránh biến tính đặc biệt là protein

c Phương pháp thẩm tích

• Thẩm tách dựa trên nguyên tắc sự khuếch tán các phân tử từ nơi có nồng

độ cao sang thấp

• Dung dịch enzyme được chứa trong màng bán thấm và ngâm trong beaker

có chứa dung dịch buffer thích hợp

• Màng bán thấm cho phép các phân tử có kích thước nhỏ hơn phân tử

enzyme đi qua màng thông qua sự khuếch tán qua các lỗ nhỏ trên màng

• Quá trình thẩm tách thực hiện ở 4 0 C kết hợp khuấy nhẹ

• Thay dung dịch buffer sau 1 – 2 giờ

• Sau khi thâm tích, dùng pipetteman hút dung dịch ra khỏi túi thẩm tích

Ví dụ Tinh sạch enzym bằng phương pháp thẩm tích

- Cân 1kg enzym thô, pha trong 10ml dung dịch đệm sodiumphotphate 0,03 có pH 7,2

- Lấy enzym hoà tan cho vào túi cellphane rồi đặt túi vào cốc chứa 1lít dung dịch đệm

- Thẩm tích trong 6 giờ và cứ 2 giờ thì thay dung dịch đệm 1 lần

- Dung dịch đệm được khuấy đều liên tục bằng máy khuất từ

- Tinh sạch enzym ở nhiệt độ thấp, để giảm sự biến tính của enzym

2.2.3/ Phương pháp siêu lọc

- Phương pháp siêu lọc là phương pháp sử dụng những màng lọc có lỗ lọc siêu nhỏ Phương pháp này được ứng dụng rất nhiều trong nhiều lĩnh vực khác nhau

- Phương pháp tách vật chất bằng màng siêu lọc hiện nay có ba loại là: lọc dòng chảy cắt ngang, siêu lọc, thẩm thấu ngược

- Trong những phương pháp trên, phương pháp lọc dòng chảy cắt ngang để thu nhận sinh khối vi khuẩn, tách vi khuẩn khỏi dung dịch enzyme

- Phương pháp thẩm thấu ngược dùng để thu nhận các chất có khối lượng phân tử thấp và có khả năng hòa tan

- Trong khi đó, siêu lọc lại được sử dụng rất rộng rãi để thu nhận enzyme, siêulọc có thể giúp ta thu nhận các chất có khối lượng phân tử trong

khoảng1.000 – 300.000 dalton Người ta sử dụng cellulose acetate và các

loại polymer hữu cơ như poly sulfone, poly-vinylidene và poly propylene làm nguyên liệu màng lọc

- Trừ cellulose acetate ra, các loại nguyên liệu màng lọc khác kể trên có thể rửa bằng kiềm, acid hoặc bằng hơi nóng Ngoài ra, người ta còn tách muối trong dung dịch enzyme bằng lọc thẩm tích

- Cách thực hiện: Sử dụng màng FS 50PP có giá trị loại trừ 30.000, diện tích màng 336cm 2 Dịch nước sau khi ly tâm được cho qua siêu lọc, trong quá trình này thêm nước cất vào để tinh sạch và thu được dung dịch cô đặc Thu nhận tủa bằng cách sử dụng acetone hoặc sấy thăng hoa dung dịch cô đặc

- Ví dụ Enzyme glucoamylase

- Thiết bị: thiết bị UF Phương pháp siêu lọc dùng để tách các chất có phân tử lượngkhác nhau Các chất có phân tử lượng nhỏ như đường, muối, nước… sẽ chui qua màng, enzyme và protein phi enzyme được giữ lại trên màng

- Nguyên lý hoạt động: Ultra Filtration(UF) là một công nghệ lọc dùng màng áp suất thấp để loại bỏ những phân tử có kích thuớc lớn ra khỏi nguồn nước Dưới một áp suất không quá 2,5 bars, nước, muối khoáng và các phân tử/ ion nhỏ hơn lỗ lọc (0.01-0.005 micron) sẽ “chui” qua màng dễ dàng Các phân tử có lớn hơn, các loại virus, vi khuẩn sẽ bịgiữ lại và thải xả ra ngoài

- Màng lọc Ultrafiltration có thể hoạt động theo 2 nguyên lý:

 Từ ngoài vào trong: Lớp lọc nằm bên ngoàimàng Dòng nước có chất ô nhiễm

được đẩy vào từ bên ngoài màng lọc Nước sạch sau lọc được thu ở bên trong màng lọc

 Từ trong ra ngoài: Lớp lọc nằm bên trong màng Dòng nước có chất ô nhiễmđược châm vào từbên trong màng lọc Nước sạch sau lọc được thu ở bên ngoài màng lọc

 Một số lưu ý:

- Enzyme là chất xúc tác sinh học có bản chất là

protein và không ổn định, dễ bị biến tính và mất khả

năng hoạt hóa Do đó, khi làm việc với enzyme cần

chú ý đến các điều kiện môi trường để tránh làm mất

khả năng hoạt hóa của enzyme

- Nhiệt độ cao, các chất oxy hóa – khử cũng là

nguyên dân gây biến tính enzyme Tuy nhiên, các enzyme khác nhau có thể nhạy cảm với các tác nhân gây biến tính khác nhau

- Vì thế, khi tách và tinh sạch E cần tiến hành ở nhiệt độ thấp từ 0oC đến 5oC Đối với các E không bền quá trình tinh sạch được tiến hành ở nhiệt độ thấp hơn từ -

5oC đến -20oC Trong trường hợp này người ta sử dụng các hỗn hợp lạnh như nước đá với CO2 hoặc nước đá với muối NaCl, hoặc thậm chí dùng hỗn hợp nước

đá với sulfuric acid đậm đặc…

Bảng 1: Hỗn hợp làm lạnh

- Tiến hành tinh sạch ở nhiệt độ thấp vừa hạn chế biến tính E cũng như tác dụng phân giải của các E proteolytic có mặt trong dịch chiết Đối với nhiều E có thể bổ sung chất ức chế của E proteolytic vào dịch chiết để hạn chế sự thủy phân đối với E quan tâm

- Tránh tạo bọt khí vì nhiều E sẽ biến tính ở mặt phân cách hai pha nước và khí Để tránh bọt khí Chỉ sử dụng các gụng cụ inox để cắt xay nguyên liệu để tránh tác dụng của kim loại nặng làm mất hoạt tính E

2.3/ Các phương pháp tinh sạch enzyme

2.3.1/ Phương pháp kết tinh

- Đây là phương pháp đặc hiệu tốt nhất để tách từng phần protein enzyme ở giai đoạn tinh chế cuối cùng Khi protein enzyme đã được làm tinh khiết hoàn toàn, trong những trường hợp riêng biệt, người ta có thể tiến hành kết tinh chúng Một điều cần chú ý là protein enzyme ở trạng thái tinh thể không thể được coi là bằng chứng về sự tinh khiết Các tinh thể protein enzyme kết tinh lần đầu đôi khi có độ sạch không vượt quá 50% và có thể chứa các protein enzyme khác

- Vd - Người ta thường tiến hành kết tinh enzyme trong dung dịch (NH4)2SO4 Quá trình kết tinh có thể tiến hành từ từ kéo dài vài ngày thậm chí hàng tuần nếu muốn nhận được các tinh thể tốt Thông thường là thêm muối (NH4)2SO4 vào dung dịch protein enzyme khá đậm đặc cho đến khi làm vẫn đục nhẹ nhàng dung dịch Sau đó đặt dung dịch vào một nơi, đồng thời tăng rất từ từ nồng độ muối trong dung dịch Có thể tiến hành tăng nồng độ muối theo nhiều cách, thêm dung dịch muối đậm đặc hơn vào dung dịch enzyme theo từng giọt, thêm muối qua màng bán thấm hoặc có thể cho bay hơi chậm chạp dung dịch protein enzyme Trong quá trình kết tinh có thể thay đổi chỉ số pH hoặc nhiệt độ Để kết tinh

protein enzyme được dễ dàng, ở những giai đoạn trước đó, người ta thường tách từng phần các protein enzyme bằng các dung môi hữu cơ Điều này có lẽ liên quan đến việc các chất có bản chất lipid bị loại ra khỏi dung dịch protein enzyme tạo điều kiện tốt cho quá trình kết tinh

Thành phần hỗn hợp Tỷ lệ Nhiệt độ đạt đượcNước đá: muối 100:33 (3:1) -21,3oC

Nước đá : H2SO4 đậm đặc 100:25 (4:1) -20,0 oC

2.3.2/ Phương pháp điện di

- Phân tách protein/enzyme bằng điện di trên gel là phương pháp tách các phân tử sinh học (DNA, RNA, protein) bằng cách cho đi qua chất nền là gel trong một điệntrường

- Đây là phương pháp để đánh giá quá trình tinh sạch protein/E có hiệu quả hay không, ngoài cách xác định hoạt tính đặc trưng của protein/E có tăng lên sau mỗi bước tinh sạch, còn một cách là làm phát hiện các protein hiện diện trong mẫu sau mỗi bước tinh sạch Tuy nhiên, phương pháp này là khó áp dụng ở quy mô lớn

- Ví dụ: Với protease, cơ chất casein, sau đó nhuộm gel với coomassie thì vị trí có

E sẽ không có màu (do E phân giải cơ chất), tạo thành vệt sáng trên gel có cơ chất nhuộm màu xanh

chiều

- Các protein/E có thể được phân tách dựa trên khối lượng bằng điện di trên

gel polyacrylamide dưới điều kiện đã bị biến tính Một số chất biến tính protein như: SDS (sodium dodecyl sulfate), LDS (lithium dodecyl sulfate), Ureùa,

Formamide Thường dùng nhất là SDS

- Hỗn hợp protein có chứa E được hòa tan trong dung dịch SDS, một chất tẩy

mang điện tích âm sẽ phá tất cả các nối không cộng hóa trị của protein ban đầu Mercaptoethanol (2-thioethanol) hay dithiothreitol cũng có thể được thêm vào để làm giảm số nối disulfide Phức hợp SDS với protein đã bị biến tính có một điện tích thực âm tỉ lệ thuận với khối lượng của protein Điện tích âm có được do gắn với SDS lớn hơn rất nhiều điện tích của bản thân protein ban đầu Vì thế, điện tích ban đầu của protein không ảnh hưởng đáng kể đến điện tích của phức hợp

b Điện di dựa vào điểm đẳng điện

- Ví dụ: pI của cytochrome C, một protein vận chuyển ion có tính base cao, là

10.6, trong khi pI của albumin huyết thanh, một protein có tính acid trong máu, là 4.8

- Khi ta cho hỗn hợp protein chạy trong điện trường trên một miếng gel với

một khuynh độ pH, không có sự hiện diện của SDS Mỗi protein sẽ di chuyển cho đến khi nó đến vị trí mà tại đó pH bằng pI của nó Dựa vào hiện tượng này, ta có phương pháp phân tách protein dựa vào điểm đẳng điện của protein để tạo khuynh

độ pH, trước hết là cho vào gel một hỗn hợp polyampholyte (những polymer nhỏ

đa điện tích) có nhiều giá trị pI, sau đó điện di hỗn hợp

- Điện di dựa vào điểm đẳng điện phân tách protein nhanh với khả năng phân

biệt được sự chênh lệch pI khoảng 0.01 hay những protein khác nhau chỉ một đơn

vị điện tích cũng có thể được phân tách bằng phương pháp này

c Điện di hai chiều

- Đây là phương pháp có khả năng phân tách cao do sự kết hợp SDS-PAGE

với điện di dựa vào điểm đẳng điện Mẫu protein đầu tiên sẽ được chạy điện di dựavào điểm đẳng điện sau đó, đặt khoảng gel có chứa protein vừa được điện di lên tấm gel SDS-polyacrylamide theo phương nằm ngang Protein sẽ chịu một điện trường theo chiều dọc Kết quả là một mô hình các điểm được phân tách hai chiều, chiều ngang theo điểm đẳng điện, chiều dọc theo khối lượng

d Điện di mao dẫn

- Phương pháp này được ứng dụng trong giám sát quá trình tinh sạch protein/E tinh sẽ cho một band đơn Ngoài ra phương pháp này còn giúp xác định khối lượng phân tử tương đối của protein/E

protein/E-2.3.3/ Phương pháp sắc kí

- Vd➢ Tinh sạch bromelin bằng phương pháp sắc ký

Bromelin thân được cho chạy sắc ký trên Duolite CS101 ở pH 6,05 cho hai phân đoạn

khác nhau về điện tích với hoạt tính xúc tác phân giải BAEE, casein và glucagons Sắc ký bromelin thân trên Bio Rex ở pH 6,1 sẽthu được 5 phân đoạn khác nhau về thành phần amino acid Khi sắc ký trên sephadex G-75 ở pH 7 cũng nhận được 5 thành phần có hoạt tính enzyme Trọng lượng phân tử của 5 thành phần này ở trong khoảng từ 17.800 – 20.000 Dalton

a Phương pháp sắc ký lọc gel

- Cơ sở của phương pháp lọc gel là dựa vào sự khác nhau về kích thước hình dạng

và phân tử lượng của enzyme có trong hỗn hợp để táchchúng ra

- Để đảm bảo cho việc tách enzyme được tốt, chất rây phân tử phải là chất trơ, không phản ứng với protein enzyme Chất này cũng không hòa tan và tương đối bền với các yếu tố về cơ học cũng như sinh học

VD:

Phương pháp lọc trên sephadex được tiến hành như sau: cho sephadex vào cột thủy tinh dài và cân bằng bằng dung dịch đệm có pH nhất định Sau đó cho dung dịch enzyme lên cột Khi lọc và chiết bằng dung môi thích hợp, các phân tử

có trọng lượng phân tử nhỏ (ở đây là các muối) sẽ khuyếch tán chậm chạp qua các

lỗ nhỏ của các hạt Sephadex bị trương phồng, còn chất có trọng lượng phân tử lớn hơn (ở trường hợp này là protein enzyme ) không có khả năng đi vào mà lách nhanh qua các hạt sephadex và sẽ rơi xuống trước, sẽ được chiết nhanh ra khỏi cột

Vì vậy ta có thể tách được chất có trọng lượng phân tử cao hơn ra khỏi chất có phân tử lượng nhỏ

b Sắc ký trao đổi ion

- Phương pháp này được dựa trên cơ sở của phản ứng trao đổi ion giữa protein

được tan trong nước hoặc dung dịch đệm loãng và các tác nhân trao đổi ion Tác nhân (hay nguyên liệu) trao đổi ion có thể là chất nhựa có tích nhóm sinh ion hoặc

là chất ionit Đây là những chất giá trơ, không tan trong nước, có bản chất là

cellulose hoặc chất gel dextran có lưới phân nhánh (Sephadex, Molselect) hoặc là chất nhựa polystirol Chất giá thể này thường kết hợp với các nhóm ion hóa Các chất trao đổi ion có chất giá là cellulose, sephadex, molselect

- Phương pháp sắc ký trao đổi ion dựa trên sự tích điện của phân tử protein

Phương pháp trao đỏi ion được sử dụng rộng rãi trong sản xuất enzyme theo quy

mô công nghiệp Tính chất tích điện của protein chịu ảnh hưởng rất nhiều bởi giá trị pH Từ đó, người ta chọn chất trao đổi là anion hay cation

- Vd: chất tan S, chất tan dẽ đuổi đối ion C ra thế chỗ vào, để gắn vào pha tĩnh, và như thế chất tan sẽ bị giữ lại trong cột, trong khi đó những chất khác của hỗn hợp mẫu chất ban đầu sẽ không bị giữ lại nên đi ra khỏi cột kỹ thuật này tách riêng được hợp chất S ra khỏi hỗn hợp ban đầu

RG- + S+ -Æ RG-S+ + C+

Hoặc RG+ +S- -Æ RG+S- + C

Trong đó: R là pha tĩnh hay gọi là nhựa (resin), G là nhóm chức mang điện tích được cố định trên pha tĩnh hay còn gọi là nhóm chức họat động của nhựa C là đối

ion của G S là chất hữu cơ có mang điện tích trái dấu với G ¾ Các loại hạt nhựa trao đổi ion: nhựa polystyren, silicagel, polymer carbohydrate.

c Sắc ký kỵ nước

- Phương pháp này dựa trên sự tương tác của vùng kỵ nước của phân tử protein vớinhóm kỵ nước trên chất nền, sự hấp thụ xảy ra ở nồng độ muối cao và quá trình phân đoạn với muối Phương pháp này đặc biệt thích hợp đối với những enzyme đãđược làm cô đặc trước đó bằng phương pháp kết tủa với muối ammonium sulfate

- Đặc điểm: Phân tách các phân tử theo tính kỵ nước của phân tử Các nhóm kỵ nước khác nhau đựợc cố đinh trên bề mặt giá thể Dưới điều kiện nồng độ muối cao (thấp) CÁC phần kỵ nước trên phân tử tương tác các nhóm cố định Các phân

tử gắn kết được rứa giải bằng cách giảm áp lực ion và vì vậy hòa tan các phân tử rakhỏi giá thể Ưu điểm: Là bước cho phép cô mẫu, công suất cao, nhanh, mẫu được thu nhận trong nồng độ muối thấp Nhược điểm: một số protein có thể bị tủa ở nồng độ muối cao, khó nâng cấp quy mô lớn

d Sắc ký đồng hóa trị

Liên kết đồng hóa trị được tạo thành giữa các protein ở trạng thái tĩnh

e Sắc ký ái lực

- Cơ sở của phương pháp này là người ta gắn những phân tử (chất) vào chất mang (chất giá) rắn bằng liên kết cộng hóa trị mà protein enzyme cần tách sẽ tương tác đặchiệu với nó Những chất đó có thể là cơ chất (Substrate) hoặc chất ức chế

(inhibitor) cạnh tranh

- Nhược điểm: đắt tiền, khó tẩy rửa, chọn lọc ligand (phối tử), gắn kết ligand lên giá thể hoạt hóa thường gặpnhiều khó khăn

- Ưu điểm: phát triển phương pháp tinh sạch trên protein A (protein A là antigen cho IgG), bước bắt giữ tốt, cho phép phân tách protein dạng nguyên thủy còn họat tính với dạng biến tính

- Sắc ký là một trong những phương pháp tinh sạch, trong đó enzym tách rakhỏi hỗn hợp ngay khi được đưa qua matrix Các matrix sử dụng trong sắc

ký có tính chất vật lý và hóa học có khả năng tương tác với các enzym do đó nó giữ lại enzym

- Ví dụ như protease có tính acid sẽ tương tác với một matrix base nhiều hơn

một protease trung tính Do vậy một matrix base có thể được sử dụng để tách các protease mang tính acid vì nó sẽ tương tác với matrix và bị giữ lại, còn

những protease không mang tính acid sẽ chảy qua matrix Các protease bị giữ lại

sẽ được loại bỏ hoặc tách ra khỏi matrix bằng cách phá vỡ liên kết giữa chúng hoặclàm yếu dần các liên kết

3/ Phương pháp kiểm tra độ tinh sạch của enzyme:

3.1/Đánh giá tính đồng thể của protein enzyme

Khi đã nhận được một protein enzyme ở trạng thái kết tinh, người ta phải thử lại mức độ tinh khiết hay tính đồng thể của nó Độ đồng thể của chế phẩm protein enzyme phải được kiểm tra bằng một số phương pháp dựa trên những nguyên lý khác nhau Trong một số trường hợp protein enzyme được coi là đồng thể khi ly tâm, nhưng lại có thể phân chia thành một số isoenzyme bằng phương pháp điện ditrên gel Chính vì vậy, nếu dùng nhiều loại phương pháp khác nhau để kiểm tra độ

sạch của protein mà kết quả đều cho là đồng thể thì protein đó có thể được công nhận là tinh khiết Những phương pháp để kiểm tra tính đồng thể hay dùng là xây dựng đồ thị về độ hòa tan, điện di và siêu ly tâm.

- Phương pháp kiểm tra tính đồng thể (hoặc còn gọi là tính đồng nhất) của protein đơn giản và nhạy nhất là xây dựng đường biểu diễn về độ hòa tan

Cách làm như sau:

Trong hàng loạt mẫu dùng một thể tích không đổi một loại dung môi (nước hoặc dung dịch muối) lắc với những số lượng enzyme khác nhau Sau đó lọc và xác định số protein trong dịch lọc Cuối cùng xây dựng đường đồ thị

Trong những loại mẫu đầu, tất cả các protein thêm vào bị hòa tan và số lượng protein thêm vào bằng số lượng protein có trong dịch lọc hay dịch ly tâm Kết quả nhận được biểu diễn là một đường thẳng Sau đó dung dịch đạt được bão hòa Nếu protein đem hòa tan là tinh khiết nghĩa là đồng nhất thì khi thêm protein trong dịchlọc sẽ không tăng lên và đường biểu diễn có một điểm uốn

Nếu trong mẫu có một protein thứ hai thì sau khi đạt được độ bão hòa đối với protein ít hòa tan hơn, loại protein thứ hai còn có thể hòa tan được nữa

Kết quả là có một điểm bão hòa thứ hai và đường biểu diễn có hai điểm uốn Nếu dịch chiết (hỗn hợp) có nhiều protein enzyme thì sẽ có nhiều điểm uốn

Phương pháp này được Northrop và Kunitz sử dụng rất có kết quả Nay vẫn còn ứng dụng nhiều

Độ biểu diễn độ hòa tan protein

- Phương pháp thứ hai để xác định độ đồng thể của protein enzyme là phương phápđiện di Phương pháp điện di là ứng dụng tính chất lưỡng tính của protein, dựa trên

cơ sở dịch chuyển của các tiểu phần chế phẩm protein enzyme mang điện trong điện trường Đem chế phẩm protein enzyme điện di ở pH và lực ion nhất định Nếutrên điện di đồ có một đỉnh thì chứng tỏ protein enzyme đó là đơn thể Nếu có hai đỉnh chứng tỏ có hai protein enzyme trong chế phẩm đó

- Phương pháp siêu ly tâm:

Đây cũng là phương pháp rất quan trọng để xác định tính đồng thể của protein enzyme Phương pháp được thực hiện như sau:

Dùng lực ly tâm rất lớn bằng cách tăng số vòng quay ly tâm lên hàng nghìn, hàng vạn vòng trong một phút Với tốc độ ly tâm rất lớn, người ta có thể tách ra được các phân tử enzyme có trọng lượng phân tử khác nhau

Tốc độ kết tủa của protein enzyme trong máy siêu ly tâm được xác định bằng trọng lượng phân tử của nó Khi dừng quay thì các phân tử protein lại khuyếch tán vào dung dịch Bởi vậy, cần phải quan sát tốc độ lắng trong quá trình siêu ly tâm Chính vì vậy, trong cốc siêu ly tâm, người ta gắn một thiết bị quang học đặc biệt,

vẽ các đường ánh sáng của kết quả phân tích lên một màn Nếu trong dung dịch có một loai protein enzyme (có một trọng lượng phân tử) thì trên màn sáng sẽ cho đường đồ thị có một đỉnh Nếu làm việc với hai protein enzyme thì sẽ có hai đỉnh v.v

3.2/ Hoạt độ enzyme:

3.2.1/ Phương pháp xác định hoạt độ enzyme

Khác với trong hóa học phân tích bình thường, trong enzyme học, người ta không định lượng enzyme một cách trực tiếp mà thường xác định gián tiếp thông qua xác định độ hoạt động (còn gọi là hoạt độ) của enzyme Trong phán ứng có enzyme xúc tác, sự hoạt động của enzyme được biểu hiện bằng cách làm thay đổi các tính chất vật lý, hóa lý cũng như tính chất hóa học của hỗn hợp phản ứng Theodõi những biến đổi đó có thể biết được chính xác mức độ hoạt động của enzyme thông qua xác định cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm được tạo thành trong phản ứng

Để xác định hoạt độ của enzyme ở các dịch chiết hoặc ở chế phẩm người ta thường dùng các phương pháp vật lý hoặc hóa học Các phương pháp, so màu, đo khí, đo độ phân cực, đo độ nhớt, chuẩn độ được dùng phổ biến trong nghiên cứu định lượng các phản ứng enzyme

Có thể chia ra ba nhóm phương pháp sau:

1 Đo lượng cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm được tạo thành trong một thời gian nhất định ứng với một nồng độ enzyme xác định

2 Đo thời gian cần thiết để thu được một lượng biến thiên nhất định của cơ chất hay sản phẩm với một nồng độ enzyme nhất định

3 Chọn nồng độ enzyme như thế nào để trong một thời gian nhất định thu được sự biến thiên nhất định về cơ chất hay sản phẩm

3.2.2/ Đơn vị hoạt độ enzyme

Hội nghị quốc tế về hóa sinh enzyme đã đưa ra khái niệm đơn vị enzyme quốc

tế (hoặc đơn vị enzyme tiêu chuẩn) vào năm 1961

Đơn vị hoạt độ enzyme (U) là lượng enzyme có khả năng xúc tác làm chuyển hóa 1 micromole (1μm), thường phải có phương pháp phá vỡ đặc biệt Nhiều enzyme mol) cơ chất sau một phút ở điều kiện tiêu chuẩn

1 U = 1μm), thường phải có phương pháp phá vỡ đặc biệt Nhiều enzyme mol cơ chất (10-6 mol)/ phút

Từ năm 1972 người ta lại đưa thêm khái niệm Katal (Kat)

- Katal (Kat) là lượng enzyme có khả năng xúc tác làm chuyển hóa 1 mol cơ chất sau một giây ở điều kiện tiêu chuẩn

Đối với chế phẩm enzyme, ngoài việc xác định mức độ hoạt động còn cần phải đánh giá độ sạch của nó Đại lượng đặc trưng cho độ sạch của chế phẩm enzyme làhoạt độ riêng

- Hoạt độ riêng của một chế phẩm enzyme là số đơn vị enzyme/ 1mg protein (U/mg) cũng có thể 1g chế phẩm hoặc 1 ml dung dịch enzyme Thông thường hàm lượng protein được xác định bằng phương pháp Lowry Khi đã biết khối lượng phân tử của enzyme thì có thể tính hoạt độ phân tử

- Hoạt độ phân tử là số phân tử cơ chất được chuyển hóa bởi một phân tử enzyme trong một đơn vị thời gian

Hoạt độ phân tử lớn (còn gọi là con số chuyển hóa hoặc con số vòng: turnover number) có nghĩa là phản ứng được xúc tác xảy ra rất nhanh Như vậy, hoạt độ phân tử chính là khả năng xúc tác: hoạt độ phân tử càng cao thì khả năng xúc tác càng lớn Ví dụ người ta đã xác định được hoạt độ phân tử cao của một số enzyme tinh khiết như catalase (5,6 x 106) acetyl - cholinesterase (3,0 x 106), β-amylase (1,2 x 106)

- Cũng cần chú ý rằng trong một số trường hợp định nghĩa về đơn vị hoạt độenzyme ở trên không thể áp dụng được Nếu cần thiết chúng ta sẽ đưa ra các điều kiện thí nghiệm tương đối hoặc định nghĩa của các đơn vị khác Ở nơi có nhiều hơn một mối liên kết của phân tử cơ chất bị tấn công thì một đơn vị hoạt độ

enzyme là lượng enzyme có khả năng xúc tác làm chuyển hóa một micro - đương lượng của nhóm liên quan sau 1 phút ở điều kiện xác định Ở nơi có hai phân tử giống nhau phản ứng với nhau thì 1 đơn vị hoạt độ là lượng enzyme xúc tác cho sựchuyển hóa của 2 μm), thường phải có phương pháp phá vỡ đặc biệt Nhiều enzyme mol cơ chất sau 1 phút

4/ Hoạt tính của enzyme từ vi sinh vật

_ Khác với trong hóa học phân tích bình thường, trong enzyme học, người ta không định lượng enzyme một cách trực tiếp mà thường xác định gián tiếp thông qua xác định độ hoạt động ( hoạt tính) của enzyme Mỗi enzyme có khả năng xúc tác cho một hoặc một số phản ứng nhất định Trong phản ứng có enzyme xúc tác,

sự hoạt động của enzyme được biểu hiện bằng cách làm thay đổi các tính chất vật

lý, hóa lý cũng như tính chất hóa học của hỗn hợp phản ứng Hoạt động hay hoạt tính của enzyme càng mạnh thì lượng cơ chất được chuyển hóa hoặc lượng sản phẩm tạo thành trên một đơn vị thời gian càng lớn Theo dõi những biến đổi đó có thể biết được chính xác mức độ hoạt động của enzyme thông qua xác định cơ chất

bị mất hay lượng sản phẩm được tạo thành trong phản ứng