Ứng dụng kỹ thuật xét nghiệm ái tính kháng nguyên giới hạn (LAG avidity) và hệ số phân loại sai để ước tính tỷ lệ mới nhiễm HIV trên một số nhóm có nguy cơ cao lây nhiễm HIV ở việt nam

Với tính cấp thiết, tính ứng dụng cao n n ch ng t i đã tiến hành nghiên cứu “Ứng dụng kỹ thuật xét nghi m ái lực kháng nguyên giới hạn LAg-Avidity và h sốphân loại sai để ước tính tỷ l m

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

HÀ NỘI – 2018

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Chuyên ngành : Vi sinh vật học

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

HÀ NỘI – 2018

LỜI CAM ĐOAN

Tôi là Trần Hồng Trâm, nghiên cứu sinh của Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội, xin cam đoan:

Kết quả đề tài này là thành quả nghiên cứu của t i với sự hướng dẫn v gi p

đ nhi t t nh của một tập thể c c chuy n gia cao cấp trong v ngo i nước T i đã đượcLãnh đạo Vi n, chủ nhi m đề tài và các thành viên trong nhóm nghiên cứu

đồng ý cho phép sử dụng các kết quả nghiên cứu của cùng đề tài với mục đích phântích và so sánh Toàn bộ các số li u, kết quả nêu trong luận án là trung thực v chưađược công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Nghiên cứu sinh

Trần Hồn Tr m

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin trân trọng bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và cảm ơn chân th nh tớiPGS.TS Nguyễn Anh Tuấn và PGS.TS Nguyễn Quang Huy, những người Thày cónhiều kinh nghi m và kiến thức đã tận tình giảng dạy, hướng dẫn tôi trong suốt quátrình học tập, thực hi n đề t i cũng như ho n th nh luận án

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến các anh ch bạn đồng nghi p Khoa HIV/AIDS, ban Lãnh đạo Vi n V sinh D ch tễ Trung ương; các Thày, Cô Bộ môn Vi sinhvật học, Trường Đại học Khoa học Tự nhi n, Đại học Quốc gia Hà Nội đã luôn tạođiều ki n v gi p đ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận án

T i cũng xin chân th nh cảm ơn TS Dương Th Yến – chuyên gia cao cấp vềxét nghi m sớm HIV của Trung tâm kiểm soát và phòng ngừa b nh tật (CDC) Atlanta đãcung cấp tài li u v hướng dẫn cách làm xét nghi m và phân tích kết quả xét nghi m; TS.Neha S.Shah – chuyên gia cao cấp về d ch tễ học của CDC Atlanta đã hỗ trợ phân tíchcác chỉ số li n quan đến d ch tễ học; ThS BS Patrick Nadol– Trưởng nhóm d ch tễ họcCDC Vi t Nam, ThS Lê Vi Linh chuyên gia cao cấp d ch tễ học của CDC Vi t Nam đãcung cấp các số li u và kết quả xét nghi m cuối cùng; cùng toàn thể c c đồng nghi p tronglĩnh vực HIV, HBV của CDC Atlanta và CDC Vi t Nam đã hỗ trợ tôi thực hi n và hoànthành luận án này

Luận n được thực hi n trong khuôn khổ hợp tác nghiên cứu giữa CDC Vi tNam và Vi n V sinh D ch tễ Trung ương của “Dự án nâng cao chất lượng giám sát

và xét nghi m HIV ở Vi t Nam, giai đoạn 2006- 2010, 2011 -2016” do Trung tâmkiểm soát và phòng ngừa b nh tật Hoa Kỳ tài trợ

Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến bố mẹ, chồng con, các anh ch em vànhững người thân trong gia đ nh, bạn bè đã hết lòng ủng hộ, động viên tôi trong suốtquá trình học tập v l động lực to lớn gi p t i vượt qua được những khó khăn để đạtđược kết quả học tập và hoàn thành luận án

Nghiên cứu sinh

Trần Hồn Tr m

MỤC LỤC

MỤC LỤC 1

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT 4

DANH MỤC CÁC HÌNH 6

DANH MỤC BẢNG 8

MỞ ĐẦU 10

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 12

1.1 Tình hình nhiễm HIV trên thế giới và ở Vi t Nam 12

1.2 Đặc điểm virut HIV 12

1.2.1 Cấu trúc HIV 13

1.2.2 Diễn biến quá trình nhiễm HIV 15

1.2.3 C c giai đoạn lâm sàng của các b nh nhiễm trùng cơ hội 18

1.3 Một số thuật ngữ xét nghi m mới nhiễm HIV 20

1.4 C c phương ph p v kỹ thuật xét nghi m trong giám sát d ch tễ và chẩn đo n HIV ở Vi t Nam 21

1.4.1 Phương ph p x t nghi m chẩn đo n gi n tiếp HIV 24

1.4.2 Phương ph p x t nghi m chẩn đo n trực tiếp 28

1.5 Các kỹ thuật xét nghi m x c đ nh tỷ l mới nhiễm HIV 30

1.5.1 Kỹ thuật miễn d ch gắn enzym kém nhạy 33

1.5.2 Các kỹ thuật x c đ nh tỷ l kháng thể IgG 33

1.5.3 Các kỹ thuật ái lực 33

1.5.4 Kỹ thuật IDE-V3 34

1.5.5 Kỹ thuật phát hi n kháng nguyên p24 34

1.5.6 Kỹ thuật phát hi n ARN HIV 34

1.5.7 Kỹ thuật phát hi n kháng thể IgG 3 kháng p24 35

1.5.8 Kỹ thuật miễn d ch dòng 35

1.6 Ước tính tỷ l mới nhiễm HIV trên thế giới 38

1.6.1 Các ứng dụng của ước tính tỷ l mới nhiễm HIV 39

1.6.2 C c phương ph p ước tính tỷ l mới nhiễm 39

1

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 45

2.1 X c đ nh và so sánh tỷ l phân loại sai trong ước tính tỷ l mới nhiễm HIV của hai kỹ thuật BED –CEIA và LAg- Avidity trên những b nh nhân bắt đầu đăng ký điều tr ARV tại các phòng khám ngoại trú của bốn tỉnh trong năm 2010 -2011 45

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 45

2.1.2 Đ a điểm và thời gian nghiên cứu 45

2.1.3 C mẫu và cách chọn mẫu 45

2.1.4 Thiết b và sinh phẩm, hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu 46

2.1.5 Phương ph p nghi n cứu 47

2.1.6 Quy trình thu thập mẫu tại phòng khám ngoại trú 49

2.1.7 Các yếu tố cần đ nh gi trong nghi n cứu 50

2.2 Ứng dụng kỹ thuật LAg Avidity để ước tính tỷ l mới nhiễm HIV-1 trong một số nhóm đối tượng có nguy cơ cao lây nhiễm HIV ở Vi t Nam năm 2006 và 2009 51

2.2.1 Các thông tin của nghiên cứu IBBS đã thực hi n năm 2006, 2009 51

2.2.2 Phương ph p nghi n cứu tính tỷ l mới nhiễm HIV bằng sinh phẩm LAg-Avidity, sử dụng thông tin và mẫu IBBS 2006, 2009 53

2.3 Các kỹ thuật xét nghi m sử dụng trong hai nghiên cứu 56

2.3.1 Xét nghi m BED-CEIA 56

2.3.2 Quy trình kỹ thuật xét nghi m mới LAg-Avidity EIA 59

2.3.3 Xét nghi m Western Blot 61

2.3.4 Xét nghi m kiểu gen HIV 62

2.3.5 Xét nghi m đo tải lượng HIV 63

2.3.6 Xét nghi m thành phần thuốc ARV 63

2.4 Công thức tính toán và phần mềm nhập li u của hai nghiên cứu 63

2.4.1 Công thức tính tỷ l phân loại sai và tỷ l mới nhiễm 63

2.4.2 Phần mềm phân tích kết quả 64

2.5 Đạo đức trong nghiên cứu 65

2

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 66

3.1 X c đ nh và so sánh tỷ l phân loại sai trong ước tính tỷ l mới nhiễm HIV của hai kỹ thuật BED–CEIA và LAg-Avidity trên những b nh nhân bắt đầu đăng ký điều tr ARV tại các phòng khám ngoại trú của bốn tỉnh trong năm 2010 -2011 66

3.1.1 Đ nh gi đặc điểm chung của những người tham gia nghiên cứu 67

3.1.2 X c đ nh tỷ l phân loại sai mới nhiễm của từng sinh phẩm BED - CEIA, LAg-Avidity 71

3.2 Ứng dụng kỹ thuật LAg Avidity để ước tính tỷ l mới nhiễm HIV-1 trong một số nhóm đối tượng có nguy cơ cao lây nhiễm HIV ở Vi t Nam năm 2006 và 2009 95

3.2.1 Đ nh gi kết quả ban đầu xét nghi m mới nhiễm bằng sinh phẩm LAg-Avidity tr n ba nhóm nguy cơ cao của c c điều tra IBBS 97

3.2.2 Tỷ l mới nhiễm hi u chỉnh theo năm 2006, 2009 sử dụng tỷ l phân loại sai cho từng miền 101

3.2.3 Đ nh gi kỹ thuật LAg-Avidity tr n cơ sở xét nghi m 108

3.3 Hạn chế của các nghiên cứu 113

KẾT LUẬN 114

KIẾN NGHỊ 115

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 116

TÀI LIỆU THAM KHẢO 117 PHỤ LỤC

3

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Deoxyribonucleic Acid

AEM Asian Epidemic Model Mô hình d ch tễ Châu Á

AIDS Aquired immune deficiency Hội chứng suy giảm miễn d ch

ART Antioretroviral therapy Li u pháp chống virut Retro

BED-CEIA Capture Enzyme ImmunoAssay Kỹ thuật miễn d ch gắn enzym tóm

B, E, D subtype bắt phân nhóm B, E, D

CDC U.S Centers for Disease Control Trung tâm iểm so t v ph ng

CEPHIA Consortium for the Evaluation Nhóm ủy vi n ban đ nh gi v

and Performance of HIV thực hi n các xét nghi m mới

EIA Enzyme Immuno Assay Xét nghi m miễn d ch gắn enzym

ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbert Xét nghi m miễn d ch hấp phụ gắn

EPP Epidemic Projection Package Phần mềm dự báo d ch

FHI Family Health International Tổ chức sức khỏe gia đ nh Quốc tế

GAP Global AIDS program Chương tr nh AIDS to n cầu

HIV Human immunodeficiency virus Virut gây suy giảm miễn d ch ở

người

HTLV III Human T- cell Leukaemia Virut gây ung thư tế bào T ở người

Virus

IBBS Integrated Biological and Giám sát lồng ghép hành vi và chỉ

Behavioral Surveillance số sinh học

LAg Avidity Limmiting Antigen Avidity Thử nghi m miễn d ch gắn enzym

ái lực kháng nguyên giới hạn

LAV Lymphadenopathy Associated Virus Virut gây tăng sinh bạch cầu hạt

4

LTR Long Terminal Repeats Đoạn lặp lại ở hai đầu mút

MSM Men Sex with Men Nam qua h tình dục đồng giới

NMR Nuclear Magnestic Resonance Cộng hưởng từ hạt nhân

PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp

PEPFAR President's Emergency Plan for Kế hoạch cứu trợ khẩn cấp của

AIDS Relief Tổng thống Hoa Kỳ về phòng,

RT Reverse Transcriptase Enzym phi n mã ngược

Realtime - Realtime Polymerase chain Phản ứng tổng hợp chuỗi thời gian

UNAIDS Joint United Nations Programme Chương tr nh phối hợp của Liên

UNGA United Nations General Assembly Đại hội đồng liên hợp quốc

WHO World Health Organization Tổ chức Y tế Thế giới

5

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cấu tạo virut HIV 15

Hình 1.2 Cấu trúc gen HIV 15

Hình 1.3 Chu kỳ nhân lên của virut HIV 16

Hình 1.4 Sự biến đổi thông số sinh học trên b nh nhân nhiễm HIV 16

Hình 1.5 Quy trình xét nghi m trong an toàn truyền máu 22

Hình 1.6 Quy trình xét nghi m HIV trong giám sát d ch tễ học 22

Hình 1.7 Quy trình chẩn đo n nhiễm HIV ở người lớn và trẻ em ≥ 18 th ng tuổi 23

Hình 1.8 Kỹ thuật xét nghi m miễn d ch đ nh dấu trên màng lọc 25

Hình 1.9 Nguyên lý kỹ thuật xét nghi m miễn d ch sắc ký 25

Hình 1.10 Nguy n lý kỹ thuật ngưng kết hạt 26

Hình 1.11 Nguyên lý kỹ thuật ELISA Sandwich 27

Hình 1.12 Hình ảnh kết quả Western blot HIV-1 28

Hình 1.13 Nguyên lý sinh phẩm BED-CEIA 36

Hình 1.14 Nguyên lý sinh phẩm LAg – Avidity 38

Hình 1.15 Sơ đồ xét nghi m mới nhiễm HIV sử dụng một kỹ thuật 40

Hình 1.16 Sơ đồ ước tính tỷ l mới nhiễm sử dụng kết hợp hai hoặc nhiều kỹ thuật xét nghi m mới nhiễm 41

Hình 1.17 Sơ đồ ước tính tỷ l mới nhiễm sử dụng một xét nghi m mới nhiễm kết hợp với các xét nghi m khác và thông tin b nh án 42

Hình 2.1 Sơ đồ phương ph p nghi n cứu tìm tỷ l phân loại sai mới nhiễm HIV 48

Hình 2.2 Quy trình thu thập mẫu 49

Hình 2.3 Sơ đồ phương ph p nghi n cứu tìm tỷ l mới nhiễm HIV bằng sinh phẩm LAg-Avidity 55

Hình 2.4 Sơ đồ xét nghi m BED-CEIA trong nghiên cứu 56

Hình 2.5 C c bước thực hi n xét nghi m BED-CEIA 57

Hình 2.6 Quy trình xét nghi m LAg-Avidity 59

Hình 2.7 C c bước thực hi n xét nghi m LAg-Avidity 60

Hình 3.1 Kết quả chạy trên thạch những mẫu nghi ngờ và mẫu mới nhiễm HIV 81

6

Hình 3.2 Kết quả xét nghi m giải trình tự vùng GP41 HIV -1 trên các mẫu nghi

ngờ mới nhiễm HIV82

Hình 3.3 Kết quả xét nghi m Western Blot trên những mẫu phân loại sai mới

nhiễm84

Hình 3.4 Kết quả xét nghi m BED- CEIA và LAg-Avidity trên 22 mẫu Elite

Controller 94

Hình 3.5 Tỷ l mới nhiễm HIV trên nhóm phụ nữ bán dâm 103

Hình 3.6 Tỷ l mới nhiễm nhóm nghi n chích ma túy 103

Hình 3.7 Tỷ l mới nhiễm nhóm nam quan h tình dục đồng giới 104

Hình 3.8 Tỷ l mới nhiễm nhóm nghi n chích ma túy cả nước 107

Hình 3.9 Tỷ l mới nhiễm nhóm phụ nữ bán dâm cả nước 107

Hình 3.10 Tỷ l mới nhiễm nhóm nam quan h tình dục đồng giới cả nước 108

Hình 3.11 Phương ph p x t nghi m tìm tỷ l mới nhiễm 111

Hình 3.12 Sơ đồ chẩn đo n nhiễm HIV cho người lớn và trẻ >18 tháng tuổi 112

7

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Tổng hợp tám kỹ thuật phát hi n mới nhiễm HIV đang sử dụng trên

thế giới 31

Bảng 1.2 Các nghiên cứu tỷ l mới nhiễm HIV trên thế giới 44

Bảng 2.1 Số lượng mẫu cần cho nghiên cứu ước tính tỷ l mới nhiễm HIV từ mẫu lưu IBBS 53

Bảng 3.1 Số lượng mẫu chọn lọc trong nghiên cứu 66

Bảng 3.2 Đặc điểm chung của những người tham gia nghiên cứu 68

Bảng 3.3 Kết quả xét nghi m BED-CEIA, LAg-Avidity 71

Bảng 3.4 Tổng hợp kết quả xét nghi m mới nhiễm HIV bằng hai sinh phẩm BED-CEIA, LAg-Avidity 72

Bảng 3.5 Bảng nhập li u kết quả sàng lọc xét nghi m HIV-1 BED-CEIA 73

Bảng 3.6 Bảng nhập li u kết quả khẳng đ nh xét nghi m HIV-1 BED-CEIA 74

Bảng 3.7 T ỷ l phân loại sai là mới nhiễ m của sinh phẩm BED -CEIA 76

Bảng 3.8 Bảng nhập li u kết quả sàng lọc xét nghi m HIV-1 LAg-Avidity 77

Bảng 3.9 Bảng nhập li u kết quả khẳng đ nh xét nghi m HIV-1 LAg-Avidity 78

Bảng 3.10 Tỷ l phân loại sai là mới nhiễ m của sinh phẩm LAg-Avidity 80

Bảng 3.11 Kết quả xét nghi m thành phần thuốc ARV 85

Bảng 3.12 Kết quả tỷ l phân loại sai mới nhiễm sau khi loại bỏ những trường hợp đã điều tr ARV của sinh phẩm BED –CEIA và LAg- Avidity 87

Bảng 3.13 Tỷ l phân loại sai phân theo từng phòng khám ngoại tr đối với hai sinh phẩm BED, LAg-Avidity 88

Bảng 3.14 So sánh kết quả tỷ l phân loại sai bằng sinh phẩm BED - CEIA của Vi t Nam với thế giới 91

Bảng 3.16 Tổng hợp mẫu IBBS năm 2006 v 2009 95

Bảng 3.17 C mẫu cần hi u chỉnh theo tỷ l mới nhiễm thực tế của nghiên cứu IBBS theo tỷ l phân loại sai miền Bắc 96

8

Bảng 3.18 C mẫu cần hi u chỉnh theo tỷ l mới nhiễm thực tế của nghiên cứu

Bảng 3.19 Kết quả xét nghi m mới nhiễm LAg-Avidity trên ba nhóm NCMT,

PNBD, MSM ở Miền Bắc 98

Bảng 3.20 Kết quả xét nghi m mới nhiễm LAg-Avidity trên ba nhóm NCMT,

PNBD, MSM ở Miền Nam99

Bảng 3.21 So sánh tỷ l mới nhiễm HIV hi u chỉnh tr n 3 nhóm nguy cơ cao ở miền

Bắc theo năm điều tra 2006 & 2009 – Tỷ l

phân loại sai là 2,6% 101

Bảng 3.22 So sánh tỷ l mới nhiễm HIV hi u chỉnh tr n 3 nhóm nguy cơ cao ở miền

Nam theo năm điều tra 2006 & 2009 – Tỷ l

phân loại sai là 0,7% 102

Bảng 3.23 Tổng hợp số mẫu xét nghi m mới nhiễm HIV trên cả nước 105

Bảng 3.24 So sánh tỷ l mới nhiễm HIV hi u chỉnh tr n 3 nhóm nguy cơ của cả

nước năm 2006 v 2009 – Tỷ l phân loại sai là 1,7% 106

9

MỞ ĐẦU

Ng y 28 th ng 10 năm 2014 - Chính phủ Vi t Nam công bố cam kết thực hi nmục tiêu 90-90-90 phấn đấu đến năm 2020 có 90% số người biết được tình trạngnhiễm HIV của mình, 90% số người đã chẩn đo n nhiễm HIV được điều tr thuốcARV liên tục và 90% số người được điều tr ARV kiểm so t được tải lượng virut ởmức thấp và ổn đ nh Vi t Nam là quốc gia châu Á đầu tiên cam kết thực hi n mụctiêu mới này Trên thế giới và ở Vi t Nam, c c phương ph p x t nghi m HIV hi n nay

chủ yếu chỉ tính được tỷ l hiện nhiễm là một tỷ l mặc dù quan trọng nhưng có

những hạn chế trong vi c tìm hiểu sự lan truyền HIV mới nhất Đối với HIV vi c

phát hi n ra người mới nhiễm HIV trong v ng s u th ng đầu là rất quan trọng vì trong

thời gian này nếu người b nh kh ng được tư vấn, xét nghi m v điều tr ARV

k p thời sẽ lây lan trong cộng đồng rất nhanh, khó kiểm so t để ngăn chặn d ch HIV bùng nổ [4]

X c đ nh được tỷ l mới nhiễm là rất khó mặc dù các nghiên cứu thuần tậptương lai theo dõi những người khỏe mạnh đến khi có huyết thanh chuyển đổinhiễm HIV là tiêu chuẩn v ng để ước tính tỷ l mới nhiễm HIV, nhưng những nghiêncứu này lại rất mất thời gian, phức tạp và tốn kém tiền bạc Để khắc phục nhữngđiểm này, các phòng thí nghi m đã ph t triển các loại kỹ thuật thử nghi m để đolường tỷ l mới nhiễm dựa vào các dấu ấn miễn d ch sinh học trong nhiễm HIV diễn

ra một vài tháng sau khi nhiễm trong các quần thể nghiên cứu cắt ngang

Với tính cấp thiết, tính ứng dụng cao n n ch ng t i đã tiến hành nghiên cứu

“Ứng dụng kỹ thuật xét nghi m ái lực kháng nguyên giới hạn (LAg-Avidity) và h sốphân loại sai để ước tính tỷ l mới nhiễm HIV trên một số nhóm có nguy cơ cao lây nhiễm HIV ở Vi t Nam” để tìm ra cách tính toán tỷ l mới nhiễm HIV phù hợp với điều ki n và hoàn cảnh Vi t Nam Nghi n cứu n y tập trung v o c c đối tượng nguy cơcao nhiễm HIV: nghi n chích ma t y, g i mại dâm, nhóm nam quan h t nh dục đồng giới ở c c tỉnh trọng điểm nhiễm HIV cao ở Vi t Nam

10

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

1 X c đ nh và so sánh tỷ l phân loại sai trong ước tính tỷ l mới nhiễm HIV của hai

kỹ thuật BED –CEIA và LAg- Avidity EIA trên những b nh nhân bắt đầu đăng ký điều trARV tại các phòng khám ngoại trú của bốn tỉnh trong năm 2010 -2011

2 Ứng dụng kỹ thuật LAg Avidity EIA để ước tính tỷ l mới nhiễm HIV-1 trongmột số nhóm đối tượng có nguy cơ cao lây nhiễm HIV ở Vi t Nam năm 2006 v 2009

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Nghiên cứu đ nh lượng và so sánh phân loại sai của sinh phẩm BED và Avidity EIA theo phương ph p nghi n cứu cắt ngang trên những người bắt đầutham gia điều tr tại các phòng khám ngoại trú

LAG Ước tính tỷ l mới nhiễm HIV dựa trên tỷ l phân loại sai đã được tính từ nghiêncứu trước sử dụng nguồn mẫu lưu c c đối tượng nguy cơ cao nhiễm HIV: nghi n chích

ma túy, phụ nữ bán dâm, nam quan h tình dục đồng giới của điều tra “Lồng ghép hành vi

và các chỉ số sinh học – IBBS” năm 2006 v

2009

ĐIỂM MỚI CỦA LUẬN ÁN

- Lần đầu ti n đã x c đ nh được tỷ l phân loại sai sử dụng kỹ thuật BED-CEIA và LAg-Avidity

- Ứng dụng được tỷ l phân loại sai để ước tính tỷ l mới nhiễm HIV trên một số nhóm có nguy cơ cao lây nhiễm HIV ở Vi t Nam

11

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tình hình nhiễm HIV trên thế giới và ở Việt Nam

Theo thống kê của UNAIDS, trên thế giới từ năm 2010 đến 2016 số người mớinhiễm HIV ở mọi độ tuổi đã giảm xuống h ng năm khoảng 16 % tương đương với1,8 tri u người (nằm trong khoảng 1,6 tri u – 1,8 tri u người) Đây l một bước tiến

đ ng ghi nhận tuy nhiên con số này vẫn c n xa để đạt được mục tiêu do UNAIDSđưa ra trong năm 2016 l sẽ phải giảm xuống h ng năm chỉ c n ít hơn 500,000 ngườimới nhiễm cho đến năm 2020 Số người mới nhiễm HIV được phân chia theo cácnhóm tuổi và giới tính Đối với trẻ em (< 15 tuổi) c c trường hợp mới nhiễm HIV đãgiảm xuống 47% từ năm 2010 do c c b mẹ đã được điều tr dự phòng thuốc kháng virút ARV từ khi mang thai, con số n y đã giảm từ 47 % đến 76% qua từng năm chođến nay Tính đến 2016, UNAIDS ghi nhận số người lớn mới nhiễm HIV trên thếgiới nằm chủ yếu độ tuổi lớn hơn15 [111] Tuy nhi n đến năm 2017 UNAIDS ướctính số người trưởng thành mới nhiễm HIV giảm 8% so với giữa 2010 và 2015,

giảm 11% so với giữa 2010 và 2016.

Thống kê theo báo cáo công tác phòng, chống HIV AIDS năm 2017 cho thấy:

số trường hợp nhiễm HIV phát hi n mới giảm 1,1%, số b nh nhân AIDS giảm 39%

và người nhiễm HIV tử vong giảm 15% Kết quả giám sát trọng điểm năm 2016, tỷ

l nhiễm HIV trong nhóm NCMT là 9,53%; PNBD là 2,39% và MSM là 7,36% Tỷ lnhiễm HIV trong nhóm MSM đã tăng từ 5,1% năm 2015 l n 7,36% năm 2016 [2].Tổng hợp của WHO UNAIDS đến 2015 có bảy loại sinh phẩm xét nghi m mớinhiễm đã được CEPHIA đ nh gi : LAg-Avidity, BED CEIA, Ortho Clinical

Diagnostic VITROS Anti-HIV 1+2 (LS-Vitros), Ortho Clinical Diagnostics VITROS anti HIV 1+2 (BSRI – Vitros-Avidity), Biorad HIV1/2+O Avidity EIA,

sinh phẩm khẳng đ nh Geenius HIV-1/HIV-2 được phát triển và tối ưu hóa th nhsinh phẩm xét nghi m nhanh có nguyên lý giống Western Blot, và NMR dựa trênnguy n lý qu tr nh trao đổi chất thay đổi qua thời gian thông qua kiểu đo quang phổtrên mẫu huyết tương để phân bi t mới nhiễm với nhiễm lâu [116,124]

1.2 Đặ đ ểm virut HIV

12

Nhiễm virut HIV và AIDS là một quá trình b nh lý do một loại virut thuộc họphụ Lentivirinae, họ Retroviridae gây ra Các Lentivirinae có nhiều đặc tính hình th

i v đặc tính sinh học giống nhau Lentivirinae có thể truyền b nh cho nhiều loài, vớiđặc trưng l thời gian nhiễm và ủ b nh rất dài [72] Thời gian trung bình từ khi nhiễmHIV đến khi tiến triển thành AIDS khoảng 10 năm Tuy nhi n, một số b nh nhân cóthể tiến triển nhanh đến AIDS trong vòng vài tháng Một số khác (5%) có thể kéodài trên 15 - 20 năm vẫn không có các tri u chứng AIDS và số lượng tế bào CD4không giảm [56]

Hai loại HIV đã được đ nh rõ đặc điểm: HIV-1 và HIV-2 HIV-1 là loại virutban đầu được phát hi n v đặt tên là LAV [27] hay HTLV-III [55] HIV-1 độc hơnHIV-2 và là nguyên nhân của phần lớn các ca nhiễm HIV trên toàn cầu HIV-2 cókhả năng lây nhiễm thấp hơn HIV-1 cho nên nó chỉ hạn chế ở Tây Phi [53,57].Virut có thể sống vài ngày ở b n ngo i cơ thể trong điều ki n khô và vài tuầntrong dung d ch ở nhi t độ phòng thí nghi m Tuy nhiên, virut rất nhạy cảm với nhi t

độ và các chất tẩy uế th ng thường Ở nhi t độ 560C, HIV chết sau 30 phút Virutchết nhanh khi b đun s i HIV đề kháng với nhi t độ lạnh, tia gamma, tia cực tím,sống được 3 ngày trong máu b nh nhân nếu để ngoài trời, dễ b tiêu di t bởi cồn 70%,nước javen [8, 10]

1.2.1 Cấu trúc HIV

HIV có dạng hình cầu, kích thước 100 - 120 nm, cấu tạo HIV gồm 3 lớp [14](hình 1.1):

- Vỏ ngoài: có cấu tạo từ lớp lipit kép với các gai glycoprotein Mỗi gai có

hai tiểu đơn v glycoprotein có khối lượng 41kDa ký hi u là gp41 cắm xuyên màng lipitkép và glycoprotein có khối lượng 120kDa (gp120) gắn với gp41 nhờ cầu nối disulfuatạo thành gp160 Gp41 và gp120 là glycoprotein điển hình trên bề mặt

được xem là một trong các thành phần chính trong vi c t m ra hướng sản xuất xin HIV và các sinh phẩm [33, 38, 40, 45];

vắc Phía trong vỏ ngoài: có cấu trúc hình cầu được cấu tạo từ protein có khối

lượng 17kDa nằm giữa vở ngoài và lõi

13

- Bên trong: là vỏ capsit hình trụ cấu tạo bởi protein có khối lượng 24kDa

(p24) [3, 45] Trong cấu trúc hình trụ là hai sợi ARN (+), protein lõi (P7 và P9) và enzymphi n mã ngược

Ngoài ra, còn có một số gen tổng hợp các protein chức năng điều hòa khác:

 Gen Vif (virus infective factor) [5,38] – mã cho protein P23 là yếu tố gây

nhiễm, làm tang khả năng nảy chồi giúp cho virut dễ dàng xâm nhập từ tế bào này sang tếbào khác Nếu thiếu gen vif virut sẽ mất khả năng lây nhiễm [18,75,82];

 Gen tat (transactivator of transcription): mã cho protein P16 điều hòa sự kéo

dài phiên mã Thiếu protein này sự phiên mã sẽ kết thúc sớm

 Gen rev mã cho protein rev (P19) điều hòa sự vận chuyển của các ARN từ

nhân vào tế bào chất, nhờ đó tổng hợp đầy đủ các protein cấu trúc

 Gen nef (negative expression factor) mã cho yếu tố biểu hi n âm tính, đó l

protein làm giảm biểu hi n của gen Nef có thể gây điều h a ngược CD4 [19] và

HLA lớp I [41] trên bề mặt của tế bào nhiễm HIV-1, v đây có thể là một cơ chế giúpvirut trốn tránh sự tấn công của T CD8 gây độc tế bào và tránh được sự nhận di ncủa các T CD4 [56]

 Gen Vpr cần thiết cho quá trình nhân bản của virut ở các tế bào không phân

chia ví dụ đại thực bào Ngoài các yếu tố kích thích khác của tế bào và virut, vpr

cũng có thể kích thích HIV-LPP Gần đây, người ta thấy vpr có vai trò quan trọng

trong vận chuyển phức hợp tiền tích hợp của virut vào nhân [80] và có thể làmngừng chu kỳ tế bào ở G2

 Gen Vpu có vai trò quan trọng trong quá trình nảy chồi của virut bởi c c đột

biến của vpu khiến các hạt virut nằm mãi trên màng tế bào vật chủ Vpu còn liên quan tới

sự liên kết của phức hợp CD4-gp160 trong lưới nội nguy n sinh v do đó cho ph p gp160được quay v ng để tạo các hạt virut mới [16,33,38]

Như vậy HIV gồm 3 nhóm gen chính [45]: Gag – mã hóa cho các protein lõi P24, P17; Pol- mã hóa cho enzym phiên mã ngược; Env – mã hóa cho các

glycoprotein vỏ gp41, gp120 có vai trò quan trọng trong vi c giúp virut bám và xâm

14

nhập vào tế b o đích HIV-1 có nhiều kh ng nguy n đặc hi u như: gp 41, gp 120, gp

160, P24 [47] Virut HIV có chứa mọi thành phần enzym cần thiết cho nhân bản baogồm: enzym phiên mã ngược (RT), integrase P32 và một protease P 11 [74]

Hình 1.1 Cấu tạo virut HIV [16]

Enzym phi n mã ngược

Hình 1.2 Cấu trúc gen HIV [17]

1.2.2 Diễn biến quá trình nhiễm HIV

HIV làm suy giảm số lượng tế bào TCD4, từ đó gây ra suy giảm nghiêm trọngtình trạng miễn d ch dẫn đến b nh nhân mắc các nhiễm trùng cơ hội v ung thư, suy

15

ki t và tử vong [82,84] Dòng di truyền của HIV là dòng di truyền ngược chiều từ ARN sang ADN chứ không phải thuận chiều ADN sang ARN [18].

Hình 1.3 Chu kỳ nhân lên của virut HIV [45]

Hình 1.4 Sự biến đổi thông số sinh học trên bệnh nhân nhiễm HIV [3].

Năm giai đoạn nhiễm HIV đã được x c đ nh [17]:

Giai đoạn 1: Giai đoạn sơ nhiễm hay giai đoạn cửa sổ Sốt cấp nhất thời li n

quan đến biến đổi huyết thanh Thời kỳ ủ b nh thường k o d i 2 – 4 tuần Trong

16

m u xuất hi n virut (virema) v chưa có kh ng thể Người b nh thường b sốt, vi m họng, nổi hạch, nhức đầu, khó ch u, ph t ban Tri u chứng n y thấy ở 50 – 95% b nh nhân nhưng kh ng biểu hi n dấu hi u đặc trưng, n n khi chẩn đo n dễ b nhầm với b

nh kh c Sự có mặt HIV trong m u được khẳng đ nh thông qua xác

đ nh ARN virut bằng kỹ thuật PCR, kh ng thể kh ng gp120 v gp41 xuất hi n sớm, kh

ng thể kh ng P24 xuất hi n sau 6 tuần Do vậy đối với b nh nhân âm tính cần x c đ nh lại

kh ng thể sau 3 th ng kể từ ng y có nguy cơ lây nhiễm HIV

Giai đoạn 2: Nhiễm HIV kh ng kèm theo tri u chứng Nhiều b nh nhân khi x t nghi m huyết thanh

dương tính nhưng kh ng biểu hi n tri u chứng hoặc biểu hi n rất nhẹ như nhức đầu, nổi hạch Lượng tế b

o T-CD4⁺ kh ng giống nhau ở mỗi người, do đó cần x c đ nh nhiều lần Hơn nữa tế b o T-CD4⁺ kh ng ho

n to n tỷ l thuận với mức độ trầm trọng của b nh Ở một số người tuy lượng tế b o T-CD4⁺

thấp nhưng kh ng biểu hi n tri u chứng, một số người kh c có lượng tế b o T-CD4⁺ cao nhưng lại biểu hi n tri u chứng.

- Kháng nguyên P24 tăng l n trong m u phản nh mức độ nhân l n của virut

m h thống bảo v của cơ thể kh ng kiểm so t được

- Mức độ nhiễm cũng được thể hi n th ng qua sự có mặt của nhiều loại phân

tử h a tan trong huyết thanh, có khả năng hoạt hóa bạch cầu Do vậy, đối với b nh nhân

kh ng biểu hi n tri u chứng cần phải kiểm tra lại kh ng chỉ đối với vi c giảm số lượng tế b

o T-CD4⁺ m c n phải xem x t vi c tang li n tục c c phân tử h a tan đặc trưng do sự nhiễmHIV có tri u chứng tiến triển chậm

Giai đoạn 3: Nhiễm HIV có tri u chứng giai đoạn sớm Vi c chuyển giai đoạn

từ kh ng tri u chứng sang có tri u chứng thể hi n th ng qua sốt, vã mồ h i về đ m, ti uchảy mãn (do nhiễm virut ở m ng nh y ruột), nổi hạch (chỉ thấy ở một số người) vđau đầu Ung thư aposi có thể xuất hi n sớm Bắt đầu xuất hi n c c b nh cơ hội, đặc

bi t l candidoz (do Candida albicans) nơi mi ng, tăng bạch cầu ni m mạc mi ng,nhiễm trùng đường h hấp (tr n v dưới) v quanh răng (nha chu)

17

Giai đoạn 4: Nhiễm HIV có tri u chứng giai đoạn muộn hi số lượng tế b o

T-CD4⁺ c ng giảm th nguy cơ b nh cơ hội c ng tang Ví dụ, khi giảm xuống 200 tế b o

ml dễ b vi m phổi v b nh li n quan tới não do Toxoplasma hi giảm đến c n 100 tế b

o ml dễ b nhiễm hỗn hợp Mycobacterium avium – intracellulare hoặc CMV, pháttriển Candida thực quản, vi m phổi do herpes khi cơ thể đã suy ki t Vi c giải phóngTNF l dấu hi u bước v o giai đoạn AIDS tiến triển v cơ thể đã ki t sức

Giai đoạn 5: Nhiễm HIV giai đoạn tiến triển Lượng tế b o T-CD4⁺ giảm chỉ

c n 50 tế b o ml l m mất ho n to n khả năng miễn d ch Ở giai đoạn n y có thể xuất

hi n tất cả c c loại nhiễm trùng cơ hội C c biểu hi n của AIDS bao gồm:

- Nhiễm trùng cơ hội,

- Hội chứng suy ki t tiến triển ở người lớn nhưng tốc độ suy ki t lại diễn ra chậm ở thanh thiếu ni n

- Với b nh nhân AIDS l thanh thiếu ni n th c c nhiễm trùng thường xuy n kh ng

được xem lnhiễm trùng cơ hội, ví dụ vi m phổi do vi khuẩn t i nhiễm hoặc lao phổi

- Một số ung thư như aposi, u lympho được coi l đặc trưng của AIDS

- C c b nh tâm thần như b nh não (giảm trí nhớ), b nh vi m chất trắng não

- Viễm phổi kẽ m lympho

1.2.3 Các giai đoạn lâm sàng của các bệnh nhiễm trùng cơ hội [13]

- Giai đoạn lâm sàng 1: Không triệu chứng

 Không có tri u chứng,

 Hạch to toàn thân dai dẳng

- Giai đoạn lâm sàng 2: Triệu chứng nhẹ

 Sút cân mức độ vừa không rõ nguyên nhân (< 10% trọng lượng cơ thể),

 Nhiễm trùng hô hấp tái diễn (viêm xoang, viêm amidan, viên tai giữa, viêm hầu họng),

 Zona (Herpes zoster),

18

 Loét mi ng tái diễn,

 Phát ban dát sẩn, ngứa,

- Giai đoạn lâm sàng 3:

 Sút cân nặng không rõ nguyên nhân (> 10% trọng lượng cơ thể)

 Tiêu chảy kh ng rõ nguy n nhân k o d i hơn 1 tháng

 Sốt không rõ nguyên nhân từng đợt hoặc liên tục k o d i hơn 1 tháng

 Nhiễm nấm Candida mi ng tái diễn

 Bạch sản dạng lông ở mi ng

 Nhiễm trùng nặng do vi khuẩn (viêm phổi, viêm mủ màng phổi, vi m đa cơ

mủ, nhiễm trùng xương khớp, viêm màng não, nhiễm khuẩn huyết

 Viêm loét mi ng hoại tử cấp, viêm lợi hoặc vi m quanh răng

- Giai đoạn lâm sàng 4: Triệu chứng nặng

 Hội chứng suy mòn do HIV (sút cân >10% trọng lượng cơ thể, kèm theo sốtkéo dài trên 1 tháng hoặc tiêu chảy kéo dài trên 1 tháng không rõ nguyên nhân)

 Viêm phổi do Pneumocystis jiroveci (PCP)

 Nhiễm Herpes simplex mạn tính (ở môi mi ng, cơ quan sinh dục, quanh hậumôn, kéo dài hơn 1 tháng, hoặc bất cứ đâu trong nội tạng)

 Nhiễm Candida thực quản (hoặc nhiễm candida ở khí quản, phế quản hoặc phổi)

 Lao ngoài phổi

 B nh do Cytomegalovirus (CMV) ở võng mạc hoặc ở c c cơ quan khác

 B nh do Toxoplasma ở h thần kinh trung ương

19

 B nh lý não do HIV.

 B nh do Cryptococcus ngoài phổi bao gồm viêm màng não

 B nh do Mycobacteria avium complex (MAC) lan tỏa

 B nh lý não chất trắng đa ổ tiến triển

(Progessive multifocal leukoencephalopathy -PML)

 Tiêu chảy mạn tính do Cryptosporidia

 Tiêu chảy mạn tính do Isospora

 B nh do nấm lan tỏa (b nh nấm Penicillium, b nh nấm Histoplasma ngoài phổi)

 Nhiễm trùng huyết tái diễn (bao gồm nhiễm Sallmonella không phải

thương h n)

 U lympho ở não hoặc u lympho non-Hodgkin tế bào B

 Ung thư cổ tử cung xâm nhập (ung thư biểu mô)

 B nh do Leishmania lan tỏa không điển hình

 B nh lý thận do HIV

 Viêm có tim do HIV

1.3 Một số thuật ngữ xét nghiệm mới nhiễm HIV

Tỷ lệ mới nhiễm: là tỷ số người được ph t hi n mới nhiễm HIV tr n tổng số

người trong một nhóm quần thể trong khoảng thời gian được x c đ nh, thường đượctính theo c ng thức: số người mới nhiễm HIV tổng số người đơn v thời gian (VD: sốngười nhiễm HIV 100.000 dân/12 tháng) [114]

Tỷ lệ hiện nhiễm: l tỷ l số người nhiễm HIV tr n tổng số người trong một

nhóm quần thể tại một thời điểm nhất đ nh n o đó [12]

Phương pháp xét nghiệm mới nhiễm (RITA): L x t nghi m hoặc tổ hợp c c x t

nghi m cùng với x t nghi m bổ sung, kết hợp với c c th ng tin lâm s ng để phân loạinhiễm HIV gần đây hay đã lâu [114]

Giá trị trung bình thời gian mới nhiễm theo RITA: đây l một th ng số cần thiết

đối với mới nhiễm HIV sử dụng RITA Trong khoảng lý tưởng từ 4 – 12 tháng,

20

gi tr trung bình thời gian có thể thay đổi theo RITA đặc hi u được sử dụng cho mỗiRITA hoặc cũng có thể thay đổi theo phân nhóm HIV Cần cân nhắc kh ng n n sửdụng một RITA trong ước tính tỷ l mới nhiễm trong một quần thể khi gi tr trungbình thời gian chưa được x c đ nh sẵn đối với quần thể đó v đối với c c phân nhómHIV ưu thế trong quần thể [115].

Tỷ lệ phân loại sai: l tỷ l phân loại sai những trường hợp nhiễm HIV lâu (> 1

năm) th nh mới nhiễm Đây l một th ng số cần thiết đối với mới nhiễm HIV sử dụngRITA) [103,115]

Xét nghiệm chẩn đoán: để khẳng đ nh một mẫu dương tính với x t nghi m

s ng lọc có kh ng thể đặc hi u với HIV kh ng X t nghi m khẳng đ nh cần có độ đặc

hi u cao [3, 6]

Chiến lược xét nghiệm: l c c phương ph p x t nghi m được ứng dụng cho từng

mục đích x t nghi m kh c nhau (chiến lược I: an to n truyền m u, chiến lược II: gi m

s t trọng điểm HIV, chiến lược III: chẩn đo n HIV) [8]

Phương pháp xét nghiệm: là c ch ph t hi n sự hi n di n kh ng nguy n, kh ng thể

hay c c ADN ARN trong m u hoặc d ch tiết của cơ thể người để x c đ nh t nh trạngnhiễm HIV

1.4 Các p ƣơn p áp và kỹ thuật xét nghiệm trong giám sát dịch tễ và chẩn đoán HIV ở Việt Nam

Theo Quyết đ nh 1098 QĐ-BYT - Hướng dẫn quốc gia về xét nghi m Huyếtthanh học HIV, xét nghi m HIV được tiến hành theo ba chiến lược khác nhau tùythuộc vào mục đích x t nghi m [8]:

21

- Chiến lược I dùng trong an toàn truyền máu (hình 1.5)

Hình 1.5 Quy trình xét nghiệm trong an toàn truyền máu [8]

Chú thích: (1) Kết quả không được dùng cho mục đích chẩn đo n nhiễm HIV,

không thông báo kết quả cho người được xét nghi m XN SP1: xét nghi m sinh phẩm 1,SP1+: sinh phẩm 1 dương tính, SP2-: sinh phẩm 2 âm tính

- Chiến lược II áp dụng cho giám sát dịch tễ (hình1.6)

Hình 1.6 Quy trình xét nghiệm HIV trong giám sát dịch tễ học [8]

Chú thích: Sinh phẩm SP1, SP2 khác nhau về nguyên lý hoặc cách chuẩn b kháng

nguyên (1) Kết quả phục vụ cho mục đích giám sát d ch tễ học HIV/AIDS không thôngbáo cho người được xét nghi m XN SP1: xét nghi m sinh phẩm 1, SP1+: sinh phẩm 1dương tính, SP2-: sinh phẩm 2 âm tính, XN SP2: xét nghi m sinh phẩm 2, SP1+SP2+:sinh phẩm 1 dương tính v sinh phẩm 2 dương tính, SP1+ SP2-: sinh phẩm 1 dương tính,sinh phẩm 2 âm tính

22

- Chiến lược III áp dụng cho xét nghiệm chẩn đoán nhiễm HIV (hình 1.7): xác

đ nh tình trạng nhiễm HIV của người được làm xét nghi m

Hình 1.7 Quy trình chẩn đoán nhiễm HIV ở người lớn và trẻ em ≥ 18 tháng tuổi [8]

Chú thích: Các sinh phẩm xét nghi m SP1, SP2, SP3 khác nhau về nguyên lý hoặc cách

chuẩn b kháng nguyên

 (1) Vi c xét nghi m lại bằng SP1, SP2 để kiểm tra loại trừ sai sót khi xét nghi m bằngsinh phẩm SP1 hoặc SP2

 (2) Kết quả dương tính được dùng để kết luận các trường hợp nhiễm HIV với điều

ki n thực hi n xét nghi m tại phòng xét nghi m được Bộ Y tế cho phép khẳng đ nh các

trường hợp nhiễm HIV

 (3) Trường hợp kết quả xét nghi m không xác đ nh, lấy máu xét nghi m lại lần thứ 2 sau 14 ngày

SP1, SP2, SP3: sinh phẩm 1,2,3; XN SP1, XN SP2, XN SP3: xét nghi m sinh phẩm 1,2,3; SP+: sinh phẩm dương; SP-: sinh phẩm âm

23

1.4.1 h ơng pháp t nghiệm chẩn đoán gián tiếp

L phương ph p ph t hi n sự hi n di n của kh ng thể kh ng HIV trong m u hoặc

d ch tiết của cơ thể người

1.4.1.1 thu t xét nghiệm nhanh Rapid test

Được chia th nh một số loại kỹ thuật dựa trên nguyên lý sau: miễn d ch chấm

- thấm; miễn d ch lọc; miễn d ch sắc ký, là những nguyên lý kỹ thuật phổ biến trongcác sinh phẩm nhanh HIV trên th trường Vi t Nam Các loại sinh phẩm nhanh

thường sử dụng là Detemine HIV-1/2, Alere Determine™ HIV-1/2 Ag/Ab ComboControls, SD Bioline HIV1/2 3.0, Vikia HIV 1/2, Double Check Gold HIV 1&2…[3]

Các xét nghi m nhanh được thực hi n đơn giản, thuận lợi với số lượng mẫu ít;

dễ thực hi n, cho kết quả nhanh (trong vòng 30 phút), có thể đọc kết quả bằng mắtthường Xét nghi m kh ng đ i hỏi các trang thiết b ; dễ bảo quản sinh phẩm; với c csinh phẩm sử dụng được cả m u to n phần thích hợp cho vi c p dụng chích

m u đầu ngón tay để x t nghi m chẩn đo n HIV ở những nơi điều ki n đi lại khókhăn [20]; có độ nhạy v độ đặc hi u cao tương đương với kỹ thuật ELISA [16]; một sốsinh phẩm nhanh c n phân bi t được nhiễm HIV-1 v HIV-2 [21,29] Ngày nay một số sinhphẩm nhanh cho phép phát hi n đồng thời cả kháng nguyên P24 và kháng thể kháng HIVtrong mẫu b nh phẩm [20] Tuy nhiên xét nghi m này không thuận lợi khi số mẫu xétnghi m nhiều; kh ng lưu được dữ li u kết quả; kết quả đọc phụ thuộc chủ quan v o ngườiđọc

- Các xét nghiệm miễn dịch chấm - thấm miễn dịch l c (hình 1.8): là kỹ thuật

dựa trên nguyên tắc miễn d ch đ nh dấu trên màng lọc; màng phản ứng chứa những hạt vilượng bao phủ kháng nguyên HIV-1 và HIV-2, đồng thời có một vùng chứng

để kiểm tra phản ứng; kháng thể kháng HIV có trong huyết thanh hoặc huyết tươngngười được làm xét nghi m sẽ gắn với kháng nguyên trên màng lọc, phức hợp khángnguyên - kháng thể n y được phát hi n bởi cộng hợp có gắn enzym cho phản ứng hi

n màu với cơ chất [21]

24

Hình 1.8 Kỹ thuật xét nghiệm miễn dị đán dấu trên màng lọc [3]

- Các xét nghiệm miễn dịch sắc ký (hình 1.9): mẫu xét nghi m sẽ được nhỏ lên

vùng nhỏ mẫu thử Huyết thanh/huyết tương sẽ thấm qua vùng có chứa cộng hợp l

kh ng nguy n vi r t đã gắn với một chất đ nh dấu mầu và tiếp tục d ch chuyển qua vùng phản ứng đã cố đ nh kháng nguyên (xét nghi m dương tính khi có hai vạch màu ở vùng phản ứng và vùng kiểm chứng; xét nghi m âm tính khi chỉ có vạch màu

ở vùng kiểm chứng; xét nghi m không có giá tr nếu không có vạch màu ở vùng chứng, khi đó phải thực hi n lại xét nghi m mẫu đó tr n thanh sinh phẩm mới) [16]

Hình 1.9 Nguyên lý kỹ thuật xét nghiệm miễn dịch sắc ký [3]

1.4.1.2 K thu t xét nghiệm ngưng ết hạt vi lượng (hình 1.10)

Kỹ thuật ngưng kết hạt vi lượng được coi l đơn giản; những hạt hữu hình (gelatin,latex, hồng cầu) được gắn với các thành phần kháng nguyên của vi r t HIV-1/HIV-2 sẽ cho phản ứng ngưng kết khi có sự hi n di n của kháng thể đặc hi u với HIV nếu có trong mẫu thử (hình 1.10) [54] C c bước thực hi n tương đối đơn giản, kh ng đ i hỏi nhiều trang thiết b , thích hợp cho vi c xét nghi m sàng lọc hàng loạt mẫu máu; kỹ thuậtnày không mất nhiều thời gian như ELISA v kết quả có thể đọc được bằng mắt thường sau 2 giờ; độ nhạy v độ đặc hi u của kỹ thuật này cao; tỷ l dương tính giả thấp [3] Tuy nhiên các thao t c phức tạp hơn c c sinh phẩm nhanh; thời

25

gian đọc kết quả lâu hơn sinh phẩm nhanh; đ i hỏi c n bộ có kinh nghi m v thao t c

th nh thạo; hạn sử dụng một số hóa chất sau khi mở l 14 ng y [54]

Hình 1.10 N uy n l kỹ t uật n ƣn kết ạt [3]

1.4.1.3 Các k thu t miễn dịch gắn enzym ELISA (hình 1.11)

Có ba nguyên lý kỹ thuật ELISA [3]: ELISA gián tiếp, ELISA cạnh tranh vàELISA sandwich Hi n nay các sinh phẩm xét nghi m chẩn đo n HIV tr n th trường

Vi t Nam chủ yếu là nguyên lỹ kỹ thuật ELISA sandwich (hình 1.11): kháng thểkháng HIV có trong mẫu thử sẽ kết hợp đặc hi u với kh ng nguy n vi r t đã được cố

đ nh trên phiến nhựa vi lượng Phức hợp kháng nguyên - kháng thể sẽ được phát hi

n bởi cộng hợp l c c kh ng nguy n vi r t gắn enzym khi cho phản ứng hi n màu với

cơ chất thích hợp Giá tr mật độ quang (OD) của phản ứng màu tỷ l thuận với lượngkháng thể kháng HIV hi n di n trong mẫu thử Sinh phẩm ELISA Sandwich nhưMurex 1.2.O, Murex HIV Ag Ab Combination, SD HIV ELISA 3.0…

Kỹ thuật này cho phép thực hi n đồng thời nhiều mẫu Có thể dùng máy tự động giảm bớt thao t c cho người làm xét nghi m, tránh sai sót và lây nhiễm; đọc kếtquả bằng máy không phụ thuộc vào chủ quan của người làm xét nghi m; có thể lưu

c c bảng kết quả và các thông số kỹ thuật thuận lợi cho vi c kiểm tra đ nh gi chất lượng xét nghi m Thực hi n xét nghi m trên số lượng mẫu > 40 mẫu/ngày [3] Kỹ thuật xét nghi m phát hi n đồng thời kháng nguyên và kháng thể Một số sinh phẩm dùng kỹ thuật phát hi n đồng thời kh ng nguy n vi r t (P24) và kháng thể kháng HIV cho phép phát hi n sớm nhiễm HIV trong giai đoạn chuyển đổi huyết thanh [46] Tuy nhiên kỹ thuật ELISA cần có sự đầu tư cho trang thiết b ban đầu và bảo dư ng,

hi u chuẩn, hi u chỉnh máy móc; cán bộ xét nghi m phải được đ o tạo

26

tốt; các sinh phẩm phải bảo quản ở nhi t độ lạnh (4-80C); thời gian thực hi n xét nghi m ELISA từ 2-3 giờ [101].

Hình 1.11 Nguyên lý kỹ thuật ELISA Sandwich [3]

Dựa trên cách chuẩn b các kháng nguyên, các sinh phẩm được chia thành 4 thế

h [3]:

- Thế hệ thứ nhất sử dụng kh ng nguy n l vi r t to n phần được ly giải và tinh

chế từ các tế b o đã gây nhiễm với HIV Các sinh phẩm n y có độ nhạy v độ đặc hi u hạnchế

- Thế hệ thứ hai dùng các kháng nguyên là protein tái tổ hợp Sinh phẩm có

độ nhạy v độ đặc hi u cao hơn

- Thế hệ thứ ba sử dụng các kháng nguyên là các peptite tổng hợp và các

protein tái tổ hợp Độ nhạy v độ đặc hi u được cải thi n rõ r t

- Thế hệ thứ tư phát hi n đồng thời kháng nguyên P24 và kháng thể có trong

mẫu thử, sinh phẩm này cho phép phát hi n nhiễm HIV trong giai đoạn chuyển đổi huyếtthanh và là sinh phẩm được khuyến cáo nên lựa chọn cho kiểm tra an toàn trong truyềnmáu

1.4.1.4 K thu t Western-blot (hình 1.12)

Kỹ thuật Western-blot là tiêu chuẩn vàng được chỉ đ nh để x t nghi m khẳng

đ nh cuối cùng các mẫu đã có kết quả dương tính với xét nghi m s ng lọc ỹ thuật này có độ đặc hi u rất cao (100%) v chỉ dùng để l m x t nghi m khẳng đ nh m kh ng dùng

l m x t nghi m s ng lọc Kỹ thuật Western Blot có gi th nh cao hơn tất cả các xét nghi m trên, người thực hi n x t nghi m v đọc kết quả cần phải có tr nh độ v kinh nghi m nhất đ

nh n n hi n nay WHO không khuyến cáo thực hi n thường

27

quy ở những nước đang ph t triển WHO khuyến c o dùng phối hợp ba xét nghi mkhác nhau về nguyên lý hoặc cách chuẩn b kh ng nguy n theo chiến lược III để chẩn

đo n khẳng đ nh trường hợp HIV dương tính Trường hợp sử dụng c c sinh phẩm đểchẩn đo n nhiễm HIV theo chiến lược x t nghi m III cho kết quả kh ng x c đ nh hoặckhó bi n luận, khi đó Western-blot được cân nhắc sử dụng để x t nghi m [28]

Theo WHO xét nghi m Western Blot HIV-1 dương tính khi xuất hi n ít nhất 02trong 03 dải băng protein vỏ Env (gp160, gp120, gp41) có thể có hoặc không có cácdải băng Gag hoặc Pol Trường hợp âm tính khi không có bất cứ dải băng n o Ngo i

ti u chuẩn dương tính v âm tính l trường hợp kết quả kh ng x c đ nh (hình 1.12) [28]

Hình 1.12 Hình ảnh kết quả Western blot HIV-1 [3]

Chú thích: 1 - chứng dương, 2 - chứng âm, 3 - kết quả mẫu dương tính

1.4.2 h ơng pháp t nghiệm chẩn đoán trực tiếp

L phương ph p tóm bắt trực tiếp tác nhân gây b nh (hay còn gọi là xét nghi m

vi r t học) như ph t hi n kháng nguyên virut trong máu (P24), các axit nucleotit của virut:ARN hoặc ADN provirut (tế bào nhiễm) hoặc phân lập virut bằng nuôi cấy tế bào [3]

Phương pháp xét nghi m trực tiếp được dùng để phát hi n nhiễm HIV ở trẻ dưới 18 tháng tuổi [11] Đối với trẻ em sinh ra từ mẹ nhiễm HIV, kháng thể kháng

28

HIV của mẹ có thể tồn lưu trong máu trẻ cho đến trước 18 tháng tuổi do đó x t nghi

m phát hi n kháng thể dương tính ở trẻ chưa thể kết luận trẻ b nhiễm HIV mà cầnthực hi n các xét nghi m virut học Xét nghi m chẩn đo n nhiễm HIV cho trẻ sinh từ

mẹ có huyết thanh dương tính n n được tiến hành từ 4 - 6 tuần sau khi sinh hoặc sau

đó c ng sớm càng tốt với các kỹ thuật phát hi n ADN/ARN provirut hoặc khángnguyên P24 của HIV [120,121] Kỹ thuật PCR phát hi n HIVADN thường được chỉ

đ nh do có độ nhạy, độ đặc hi u cao, có thể sử dụng lấy trên giấy thấm giọt máu khô(DBS) dễ bảo quản và vận chuyển từ những nơi xa ph ng x t nghi m [96] Trẻ cầnđược khẳng đ nh sớm tình trạng nhiễm HIV để được điều tr sớm không cần chờ cócác dấu hi u lâm sàng hoặc suy giảm miễn d ch [13]

C c phương ph p trực tiếp phát hi n tác nhân virut c n được dùng trong cáctrường hợp chẩn đo n sớm nhiễm HIV ở người lớn trong giai đoạn cửa sổ chưa có sựchuyển đổi huyết thanh hoặc khi xét nghi m bằng phương ph p gi n tiếp tìm kháng thể cókết quả không rõ ràng [3, 8]

1.4.2.1 Các k thu t phát hiện kháng nguyên P24 (antigen P24)

Kháng nguyên P24 là protein cấu thành của lõi vi r t, bao bọc các chất li u ditruyền và là một chỉ số phản ánh sự nhân lên của vi r t h ng nguy n P24 tồn tại dướidạng tự do hoặc trong phức hợp kháng nguyên-kháng thể [45, 56] Phát hi n khángnguyên P24 th ng thường được sử dụng trong:

- Chẩn đo n nhiễm HIV ở trẻ sơ sinh [11]: Đây l một kỹ thuật kém nhạynhưng rất đặc hi u Hi n nay, các sinh phẩm phát hi n kháng nguyên P24 đã đượchoàn thi n để nâng cao độ nhạy

- Phát hi n sớm giai đoạn mới nhiễm HIV [3]: Trong giai đoạn đầu mớinhiễm HIV, kháng nguyên P24 có thể được phát hi n trước khi có sự biến đổi huyếtthanh, ở giai đoạn cửa sổ khi chưa có kh ng thể

- Theo dõi diễn tiến nhiễm HIV [14]: Kháng nguyên P24 có thể được phát hi

n rất sớm ở giai đoạn mới nhiễm Cùng với sự xuất hi n kháng thể, nồng độ khángnguyên P24 tự do trong máu giảm Ở giai đoạn cuối, cùng với sự giảm kháng thểkháng P24, sự tái xuất hi n v gia tăng nồng độ P24 tự do là một ti n lượng chuyểnsang AIDS

29

- Theo dõi đ p ứng điều tr với thuốc kh ng vi r t [4,12].

- Phát hi n có sự nhân lên của vi r t trong nu i cấy tế bào

1.4.2.2 Các k thu t sinh h c phân tử phát hiện ARN hoặc ADN provirut HIV

- Các kỹ thuật PCR và Real Time PCR phát hi n ADN tiền vi r t trong tế bàonhiễm hoặc HIV - ARN trong huyết tương, được áp dụng trong xét nghi m phát hi n sớmnhiễm HIV [63, 11]; đo tải lượng vi r t trong theo dõi điều tr [4, 7]

- Các nguyên tắc của các kỹ thuật sinh học phân tử HIV: Phản ứng PCR là kỹthuật cho phép khuếch đại một lượng rất nhỏ phân tử ADN đích được tách chiết từcác tế bào nhiễm hoặc được tổng hợp từ các ARN của vi r t nhờ enzym sao chépngược RT (ADNc) [96]; kỹ thuật Real time PCR - cho phép khuếch đại v x c đ nh

số lượng các chuỗi ADN được tạo ra trong từng chu kỳ nhi t [3]

Các sinh phẩm dùng trong xét nghi m HIV phải có độ nhạy tối thiểu > 99,5%với các sinh phẩm xét nghi m nhanh, 100% với các kỹ thuật ELISA/hóa phát quang

đi n hóa phát quang và độ đặc hi u tối thiểu > 98% Các tiêu chuẩn này cần dựa theocác đ nh giá tiêu chuẩn của WHO, CDC Hoa kỳ hoặc đ nh giá của Quốc gia và các

tổ chức có uy tín khác [8]

1.5 Các kỹ thuật xét nghiệm xá định tỷ lệ mới nhiễm HIV

Từ năm 2008, WHO UNAID đã th nh lập một nhóm chuyên gia kỹ thuật đểphát triển c c hướng dẫn quốc gia, đ nh gi và sử dụng các xét nghi m phát hi n mớinhiễm HIV Đến năm 2017, t m kỹ thuật xét nghi m mới nhiễm HIV đã được sửdụng trên thế giới (bảng 1.1) Một vài kỹ thuật phát triển đặc bi t với mục đích

x c đ nh tỷ l mới nhiễm trong quần thể, trong khi một số kỹ thuật kh c được

thương mại hóa sử dụng cho mục đích chẩn đo n [119] Với một số ít các kỹ thuậtđược chấp nhận trong xét nghi m HIV, hầu hết các kỹ thuật được li t kê ở bảng 1.1đều chưa được đ nh gi phù hợp để đạt được các giá tr chính xác của giá tr trung bìnhthời gian mới nhiễm và tỷ l phân loại sai trong các phân nhóm HIV-1 [73,88,108]

30

Bảng 1.1 Tổng hợp tám kỹ thuật phát hiện mới nhiễm HIV đ n sử dụng trên thế giới

K thu t miễn dịch gắn enzym Đ nh lượng - Hạn chế sử dụng trong các quần thể, ưu ti n Aviod [68]

kém nhạy, sinh phẩm gồm: HIV -1 phân nhóm B,

-Ora Quick Advance Rapid HIV- (calibrator) cho từng phân nhóm riêng bi t Điều

khác nhau cho từng phân nhóm

- PLS là mới nhiễm với: những người nhiễm

HIV lâu có miễn d ch tốt và những người đangđiều tr ARV

K thu t đo tỷ lệ, sinh phẩm gồm: Tỷ l PLS là mới nhiễm với: những người nhiễm HIV - Sedia BioCences Corporration

K thu t ái lực, sinh phẩm gồm: Ái lực PLS là mới nhiễm với: những người nhiễm HIV

- Anti-HIV 1+2 lâu có miễn d ch tốt và những người đang điều - Ortho Clinical Diagnostic [37],

- AxSYM HIV-1/2 gO, tr ARV - Abbott [105, 106],

- Avidity Index và LAg-Avidity - Kỹ thuật nội bộ [117],

- Biorad HIV1/2+O Avidity EIA

31

Kỹ thuật xét nghiệm Loại hình xét nghiệm Hạn chế của sinh phẩm Đã đƣợ t ƣơn mại hóa (nếu có)

K thu t ưu thế miễn dịch, sinh Miễn d ch trội Kỹ thuật có độ nhạy thấp Kỹ thuật nội bộ [24]

phẩm gồm: IDE-V3

K thu t phát hiện kháng nguyên Phát hi n trực tiếp - P24 dương tính c n kh ng thể kháng HIV âm

- Yêu cầu một số lượng mẫu lớn trong quần

thể để đạt l m được c c ước tính mới nhiễm

K thu t phát hiện ARN HIV Phát hi n trực tiếp Yêu cầu một số lượng mẫu lớn trong quần thể để COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan

ARN đạt l m được c c ước tính mới nhiễm HIV-1 Qualitavie test v2.0 – Roche

[96]

K thu t phát hiện kháng thể Phản ứng với kháng Các kết quả t m ra chưa được đ nh gi tr n c c Kỹ thuật nội bộ [125]

kháng P24 IgG3, sinh phẩm gồm: thể kháng P24 quần thể nhiễm HIV khác nhau với các phân

K thu t miễn dịch dòng, sinh Kỹ thuật miễn d ch Kỹ thuật này có chi phí cao, chỉ nên sử dụng Innogenetic – Bỉ [99]

phẩm gồm: INNO-LIA HIVI/II dòng trong xét nghi m khẳng đ nh thường quy

Score

32

1.5.1 Kỹ thuật miễn dịch gắn enzym kém nhạy (Less-sensitive enzym immunoassay)

Kỹ thuật này dựa trên nguyên lý miễn d ch gắn enzym (EIA) đã thay đổi mộtchút cho phù hợp với các xét nghi m phát hi n sớm nhiễm HIV: x c đ nh được nồng

độ kháng thể tăng dần trong một khoảng thời gian [68]

Các mẫu đã được khẳng đ nh nhiễm HIV sẽ được pha loãng 1/20 000 và giảmthời gian ủ mẫu trong quá trình xét nghi m lại bằng kỹ thuật miễn d ch gắn enzymkém nhạy Những người mới nhiễm HIV v đ p ứng miễn d ch sớm sẽ có nồng độkháng thể thấp vì vậy sẽ cho kết quả âm tính trong xét nghi m miễn d ch gắn enzymkém nhạy này [65]

Hai kỹ thuật xét nghi m miễn d ch gắn enzym kém nhạy đã ph t triển thànhsinh phẩm thương mại tr n thi trường (Abbott 3A11 và Avioq HIV-1) [68] Tuynhiên sinh phẩm Abbott 3A11 hi n nay đã ngừng sản xuất Các sinh phẩm xét nghi

m nhanh đang được phát triển thay thế dần cho các xét nghi m EIA [69] Hạn chếcủa các sinh phẩm là chỉ phù hợp với phân nhóm B của HIV-1, mặt khác giá trtrung bình về thời gian mới nhiễm HIV cho kết quả khác nhau với các phân nhómkhác nhau vì vậy không được ứng dụng rộng rãi trên thế giới [114]

1.5.2 Các kỹ thuật ác định tỷ lệ kháng thể IgG

Các kỹ thuật này được ứng dụng để x c đ nh tỷ l kháng thể IgG kháng HIVtrên toàn bộ kháng thể IgG có trong huyết thanh/huyết tương Kháng thể IgG khángHIV ở người mới nhiễm sẽ thấp hơn so với người đã nhiễm lâu Sinh phẩm BED-CEIA được phát triển dựa trên nguyên lý này: sử dụng một peptide phân nhánh,gồm các trình tự đặc hi u trên gp41 của ba phân nhóm B, E v D; đoạn peptide chungcho nhiều phân nhóm n y sau đó được dùng để đo tỷ l đang tăng l n của kháng thểIgG đặc hi u HIV so với IgG toàn phần sau giai đoạn chuyển đổi huyết thanh Sinhphẩm BED được ứng dụng để ước tính tỷ l mới nhiễm trong quần thể [91]

1.5.3 Các kỹ thuật ái lực

Ái lực có li n quan đến sức mạnh liên kết giữa kháng nguyên và kháng thể đặc

hi u HIV Các kỹ thuật ái lực dựa trên giả thuyết rằng các kháng thể có ái lực thấp

sẽ được nhận đ nh là mới nhiễm gần đây Theo c ch đo tổng số kháng thể kháng

33