PHẢN ỨNG CHUỖI POLYMERASE(PCR)

A-PHẢN ỨNG CHUỖI POLYMERASE(PCR): I. ĐẠI CƯƠNG:  Việc triển khai các ứng dụng của sinh học phân tử thường vấp phải trở ngại về số lượng vật chất di truyền .Các phương pháp tạo dòng in vivo tuy giải quyết được vấn đề về số lượng nhưng đòi hỏi thao tác phức tạp và thời gian dài .Sự ra đời của nhiều phương pháp khuếch đại in vitro có chọn lọc,trong đó nổi tiếng nhất phải kể đến phương pháp PCR,đã đảo lộn nguyên tắc của việc tạo dòng cổ điển ,mở ra những triển vọng ứng dụng to lớn .  Bằng cách sử dụng enzyme DNA polymerase và Oligonucleotid tổng hợp nhân tạo các mồi primer, một đoạn DNA bất kỳ có thể được nhân lên nhanh chóng hàng tỷ lần mà không cần đưa vào tế bào vi khuẩn. Đó là kết quả tuyệt vời của PCR.  PCR (Polymerase Chain Reaction): phản ứng dây chuyền tổng hợp nhờ polymerase do Karry Mullis và các cộng sự phát minh vào năm 1985. Từ một vi khuẩn có tính chịu nhiệt Thermus Aquaticus (được tìm thấy tại YelloustonePark), sống ở vùng nước nóng, người ta đã phân lập được Taq polymerase cho phép ta khuếch đại một đoạn DNA ở một vùng bất kì trong hệ gen khi trình tự hai đầu đoạn DNA đã biết có tính lập đi lập lại và số lượng tăng lên theo hàm số mũ.  Dựa vào trình tự Nu ở hai đầu đoạn, các cặp oligonucleotic được tổng hợp nhân tạo, mỗi oligo tạo liên kết bổ sung với từng sọi đơn.Chúng được sử dụng làm mồi để tổng hợp in vitro nhờ enzyme DNA polymerase.  Như vậy, PCR là kỹ thuật xử lý in vitro các chuỗi mã hoá di truyền DNA bằng cách phát triển một cách đồng loạt trên các dây đơn DNA. Toàn bộ tiến trình được hoàn thiện do sự biến chất của DNA cần thiết, sự tác động của primer tại đầu các dây đơn DNA này. Kế đến là sự phát triển của các primer nhờ DNA polymerase. Thông qua phương pháp PCR hàng triệu đoạn DNA đồng nhất có thể được thu thập một cách dễ dàng từ một hỗn hợp các phân tử bao gồm: RNA, protein, polysaccharide, DNA không có chức năng và DNA có chức năng di truyền. Đây là công cụ khá mới của sinh học phân tử, đánh dấu một bước tiến cực kì quan trọng và hiện đang được sử dụng rộng rãi nhất trong thực tiễn cũng như trong nghiên cứu. Vì sao phải dùng kĩ thuật PCR ?  Kiểm tra nhanh  Áp dụng cho cả nguyên liệu và kiểm soát quá trình  Trong số các phương pháp kiểm tra nhanh thì PCR là phương pháp đáp ứng cao các chỉ tiêu quan trọng : Thời gian cho kết quả Độ nhạy Độ đặc hiệu Ngay cả giá thành Đơn giản

A-PHẢN ỨNG CHUỖI POLYMERASE(PCR):

to lớn

 Bằng cách sử dụng enzyme DNA polymerase và Oligonucleotid tổng hợp nhân tạocác mồi primer, một đoạn DNA bất kỳ có thể được nhân lên nhanh chóng hàng tỷ lần

mà không cần đưa vào tế bào vi khuẩn Đó là kết quả tuyệt vời của PCR

 PCR (Polymerase Chain Reaction): phản ứng dây chuyền tổng hợp nhờ polymerase

do Karry Mullis và các cộng sự phát minh vào năm 1985 Từ một vi khuẩn có tính chịunhiệt Thermus Aquaticus (được tìm thấy tại YelloustonePark), sống ở vùng nước nóng,người ta đã phân lập được Taq polymerase cho phép ta khuếch đại một đoạn DNA ở mộtvùng bất kì trong hệ gen khi trình tự hai đầu đoạn DNA đã biết có tính lập đi lập lại và sốlượng tăng lên theo hàm số mũ

 Dựa vào trình tự Nu ở hai đầu đoạn, các cặp oligonucleotic được tổng hợp nhân tạo,mỗi oligo tạo liên kết bổ sung với từng sọi đơn.Chúng được sử dụng làm mồi để tổng hợp

in vitro nhờ enzyme DNA polymerase

 Như vậy, PCR là kỹ thuật xử lý in vitro các chuỗi mã hoá di truyền DNA bằng cáchphát triển một cách đồng loạt trên các dây đơn DNA Toàn bộ tiến trình được hoàn thiện

do sự biến chất của DNA cần thiết, sự tác động của primer tại đầu các dây đơn DNA này

Kế đến là sự phát triển của các primer nhờ DNA polymerase

Thông qua phương pháp PCR hàng triệu đoạn DNA đồng nhất có thể được thu thập mộtcách dễ dàng từ một hỗn hợp các phân tử bao gồm: RNA, protein, polysaccharide, DNAkhông có chức năng và DNA có chức năng di truyền Đây là công cụ khá mới của sinhhọc phân tử, đánh dấu một bước tiến cực kì quan trọng và hiện đang được sử dụng rộngrãi nhất trong thực tiễn cũng như trong nghiên cứu

Vì sao phải dùng kĩ thuật PCR ?

 Kiểm tra nhanh

 Áp dụng cho cả nguyên liệu và kiểm soát quá trình

 Trong số các phương pháp kiểm tra nhanh thì PCR là phương pháp đáp ứng cao các chỉ tiêu quan trọng :

Thời gian cho kết quả

PCR là kỹ thuật xử lý in vitro các chuỗi mã hoá di truyền DNA, dựa trên cơ sở phảnứng sinh tổng hợp DNA theo 3 trình tự sau:

1 Biến thành dây đơn (denature)

2 Phản ứng của primer gắn vào đầu dây chuỗi mã đối xứng với chuỗi mã trên dâytemplate (gọi là tiến trình annealing) để có phân tử DNA mới Kéo dài dây mới nhờprimer (extension)

Những phản ứng này được thực hiện nhờ polymerase như Taq polymerase và sự thay đổichu kỳ nhiệt một cách hợp lý, đặc biệt là nhiệt độ cho denature và nhiệt độ cho annealing

• Hồi phục sau khi phục hồi nhiệt không cần kéo dài

• Enzyme này hoạt động ở nhiệt độ cao, lúc đó việc tác động của các primer ởđầu dây đơn và sinh tổng hợp DNA sẽ nhanh hơn

 PCR chuẩn: DNA mục tiêu mở dây đôi,sau đó 2 primer tác động ở hai đầudây đơn,rồi DNA mới tổng hợp nhờ Taq với 4 deoxiribonucleotide

 PCR neo:chỉ cần một primer,một đuôi dG nhân tạo được gắn vào đầu 3’của DNA mục tiêu,DNA được khuếch đại nhiều lần nhờ một primer có chuỗi mã

đã biết trước,và một primer thứ hai có oligo dC

 PCR đảo, người ta dùng nó để khuếch đại đoạn phân tử kế cận chuỗi mãDNA đã biết trước,phân tử DNA này được phân cắt và nối lại bởi enzyme để tạothành một vòng tròn có tính chất monomer, sau đó DNA được khuếch đại nhờ mộtprimer tương đồng với đầu của chuỗi mã đựơc biết trước

2.Thiết kế chu kỳ với nhiệt độ tương thích

Nhiệt độ sử dụng trong phản ứng PCR phải được xác địnhchính xác

Mỗi chu kỳ của PCR có ba nhiẽt độ cần được xác định nhưsau:

Thời kỳ biến tính DNA, tách dây đôi thành dây đơn,nhiệt độ được thiết kế là 940C, với nhiệt độ này DNA sẽ tạo

ra sợi đơn DNA, hoạt động như dây nền (template) cho quátrình tổng hợp DNA mới

 Thời kỳ lai giữa primer và DNA (annealing), nhiệt

độ thay đổi 50-600C Nhiệt độ này tuỳ thuộc vào loại marker mà chúng ta đang sử dụng,với chiều dài cụ thể của oligonucleotide Chúng ta phải thử từng bước để biết chắc nhiệt

độ cần được thiết kế là bao nhiêu

 Thời kỳ kéo dài dây DNA mới được tổng hợp nhờ Taq polymerase(extension),nhiệt độ được thiết kế là 720C

Giai đoạn annealing là quan trọng nhất, bởi vì trong giai đoạn này, sự kiện sự laiDNA-DNA xảy ra Nếu nhiệt độ quá cao, không lai được DNA; nếu nhiệt độ quá thấp, việclai DNA sẽ bị nhiều lỗi Chính vì thế để thiết lập nhiệt độ cho chu kỳ PCR, người ta xácđịnh nhiệt độ nóng chảy Tm với từng nhóm primer riêng biệt

3.Chu kỳ khuếch đại

a Số chu kỳ

Thường dùng là 30 chu kỳ cho quá trình khuếch đại PCR Nếu thêm nhiều chu kỳ thìphản ứng rất chậm và năng suất thu hoạch cho các băng không cao Nhìn chung số chu kỳtuỳ thuộc vào phương pháp và đối tượng sử dụng

b.Nhiệt độ cho thời kỳ lai với primer (annealing): tuỳ thuộc vào primer mà chúng tađiều chỉnh nhiệt độ (56-600C)

c.Taq polymerase: Taq polymerase có thể 2-4Kb (trên phút), tức 35-70 base trong một giờ Vì thế 1 Kb,1 phút nhiệt độ 72 0 C sẽ thành công cho quá trình khuếch đại

d.Chú ý với 20 mer với thành phần GC trên 60% thì phải tính toán nhiệt độ trong quá trình sắp xếp polymer.

4 DNA mục tiêu

 Người ta cần phải có các đoạn DNA mang mật mã đã biết trước ”DNA mục tiêu”.Trong kĩ thuật PCR, người ta sẽ nhận được những kết quả tốt nhất, nếu DNA thật sựthuần khiết DNA của thực vật thường được ly trích từ mô lá Số lượng DNA cần chophản ứng không nhiều lắm, chỉ cần từ 5-10ng DNA thuần khiết, đủ dể cho kết quả theo

mong muốn Người ta cần có ethanol trong lần cuối của qui trình chuẩn bị DNA Với10% ethanol, nó vẫn chưa có thể gây ảnh hưởng đến hoạt động của Taq polimerase.

 Điều ghi nhận quan trọng là: phải có một mM EDTA trong chất đệm TE, trong khi

sử dụng để hoà tan DNA.EDTA sẽ gắn với Mg++, để thể tích của DNA mục tiêu khôngvượt quá 1/15 của thể tích PCR

5.Primer và DNA

Trong PCR tiêu chuẩn, người ta cần có một căp mồi Sự khuếch đại chuyên biệt nào đốivới một đoạn DNA cần nghiên cứu, đều phải tuỳ thuộc vào các cặp mồi tương xứng.C ả haiyếu tố: chiều dài primer và thành phần C-G đều có ảnh hưởng quan trọng đối với nhiệt độtrong quá trình tác động ở đầu dây đơn Nhiệt độ này là:

2x (A+T)+4x (G+C) +5oC

Nếu có 50%G+C, thì chiều dài của primer phải có kích thước tương ứng là 18-20 Nu Người ta mua các nucleotide ở các công ty hoá chất, có chất lượng tốt, nếu có được bảoquản ở dạng bột đông khô (freeze-dried powder) Sau đó nguời ta phải điểu chỉnh lại độ pHtruớc khi sử dụng

nhiệt (e.g Taq DNA polymerase chịu nhiệt được tách biệt từ vi khuẩn Thermus aqaticus),

và bốn loại deoxyribonucleotide Nhiệt độ là nhu cầu tối thiểu trong giai đoạn này

2.Hồi tính (annealing):

Đối với bước thứ hai này, nhiệt độ của hỗn hợp giảm từ từ xuống 550C Trong suốtgiai đoạn này, những base mồi sẽ bắt cặp với mạch gốc theo nguyên tắc bổ sung

3.Kéo dài (extension)

Nhiệt độ tăng đến 75oC, ở nhiệt độ này thuận lợi cho chức năng xúc tác của TaqDNA polymerase DNA được kích thích tổng hợp theo chiều 3’-OH

Đối với một qui trình chuẩn thì chu kỳ 25-35 phải thực hiên trong điều kiện:

“Denature” 94-960C 15 giây (hoặc lâu hơn)

“annealing” 550C(50-560C) 30giây

“extention” 720C 1,5 phút

 Chu kỳ được kết thúc bằng một “extension”ở 720C trong 1,5 phút Sau đó người tacho dừng hẳn bằng cách tồn trữ sản phẩm PCR ở 40C

 Phức tạp nhất là nhiệt độ trong giai đoạn “annealing” Chúng ta phải điều chỉnh để

có khuếch đại tốt nhất và ghi nhận được đa hình tốt nhất khi điện di trên gel.

 Tóm lại trong qui trình chuẩn này, chúng ta cần tuân thủ các qui định sau:

 Phuơng tiện và hóa chất:

 Máy Thermal cycler (PE 9600 Perkin-Elmer)

 Mẩu DNA ly trích 100ng/µl

 Dung dịch stock của dNTP(mỗi dNTP là 5 mM)

 Taq polymerase (5U/µl Perkin-Elmer)

 Dung dịch stock của 10xPCR buffer (buffer cuả Perkin-Elmercó 15mM MgCl2,500mM kCl 100mM Tris-HCl, pH 8,4, 0,1% gelatin,1% Triston X- 100

Thêm nước cất hai lần, sao cho đủ 25µl

Chu kỳ nhiệt trong thermal cycler thí dụ tìm đa hình của Sacl, clon BS3, 4kb trongnguời)

940C trong 5 phút, theo sau là 30 chu kỳ

1 Kích thước của trình tự cần khuếch đại là giới hạn đầu tiên: PCR cho kết quả tốt với

những đoạn DNA có độ dài nhỏ hơn 1,5 Kb Trong vài trường hợp PCR không hoạt độngvới những đoạn lớn hơn 3Kb Với những độ dài lớn hơn điều kiện tối ưu cho phản ứng phảiđược xác định qua thực nghiệm

2 Mức độ ngoại nhiễm cao: nguồn ngoại nhiễm lớn nhất là các sản phẩm khuếch đại của

những lần thao tác trước: việc mở nắp các ống nghiệm sau mỗi lần khuếch đại trongkhoảng không gian kín như phòng thí nghiệm khiến các phân tử đã được khuếch đại thoát

ra khỏi ống nghiệm bay lơ lửng trong không khí sẽ bám vào tường, dụng cụ, thiết bị dễdàng nhiễm vào phản ứng tiến hành sau đó Biện pháp khắc phục:

- Các công đoạn thao tác khác nhau: thiết lập phản ứng PCR, phân tích sản phẩmkhuếch đại …phải tiến hành ở những địa điểm khác nhau

- Dụng cụ của từng công đoạn, thao tác phải sử dụng riêng biệt khi hút dung dịchphản ứng - Dùng tia tử ngoại để loại bỏ các phẩn tử còn lại từ các lần khuếch đại trước

- Mọi thành phần của phản ứng phải chia thành nhiều lượng nhỏ (đủ với 1,2 lần thaotác)

Trước lần phản ứng kế tiếp, thêm vào dung dịch phản ứng enzyme uracylglycosylase,

có tác dụng phân huỷ tất cả các DNA mang dUTP nhiễm từ lần trước đồng thời enzyme sẽ

bị phân huỷ bởi nhiệt ngay từ lần biến tính đầu tiên

3 Sự kém trung thực của quá trình tổng hợp bởi Taq polymerase: việc tổng hợp DNA

in vitro nhờ Taq polymerase có độ chính xác không cao: 2.10-4.Trong một phản ứng với 30chu kì, tần suất sai số tổng thể 0,25% Do đó bất kì một trình tự nào có được từ phươngpháp PCR đều cần được xác nhận lại bằng cách xác định trình tự của nó Taq polymerasebiểu hiện tính chính xác khá thấp in vitro, làm xuất hiện các đột biến ngẫu nhiên bên trongvùng khuếch đại, vì thế đoạn được khuếch đại phải được xác định trình tự càng khó nếukích thước lớn

Ngày nay nhờ sự phát triển của khoa học công nghệ có thể làm đơn giản hoá phản

ứng PCR cho phép nó được sử dụng rộng rãi trong hầu hết các phòng thí nghiệm sinh họcphân tử như là một routine procedure

IV THIẾT KẾ CÁC PRIMER

Việc chọn lọc primer nào đó là một thử thách cực kỳ quan trọng khi chúng ta muốn

sử dụng PCR có hiệu quả và độ trung thực cao

Nhằm đạt được thành công trong việc khuếch đại của PCR, chúng ta phải có mộtthiết kế chính xác về oligonucleotide primer

Sequence của primer được chọn chính xác kích thước, vị trí của sản phẩm PCR, cũngnhư nhiệt độ Tm vùng được khuếch đại Primer được thiết kế đúng có thể giúp chúng tatránh tạo ra những sản phẩm PCR không chuyên biệt, giống như hiện tượng phân biệt giữacDNA và DNA của genome trong RNA-PCR

4.1.Thông số cơ bản để thiết kế primer

Mục đích của thiết kế primer là có được một cân bằng giữa hai kết quả: sự chuyên tính

và sự hiệu quả của PCR:

 Sự chuyên tính được xem xét trên cơ sở xuất hiện bao nhiêu lần hiện tượng primingnhầm trên tổng số lần priming (sự lai giữa primer và dây template tại vị trí mục tiêu củanó)

 Tính hiệu quả của một primer là làm thế nào tiếp cận với lý thuyết về kết quả sảnphẩm, trong mỗi chu kỳ PCR, một cặp primer có thể khuếch đại ra một sản phẩm

Mỗi chuỗi mã DNA nào đó đã được cung cấp,người ta có thể phân tích primer trên phầnmềm máy tính,để có thể cân bằng giữa hai mục tiêu nói trên

4.1.1 Chiều dài primer

Sự chuyên tính thường được điều khiển bởi chiều dài của primer và nhiệt độ trongquá trình annealing Oligonucleotid có kích thước 18-25 base có xu thế trở thành squencerất chuyên tính, nếu nhiệt độ annealing của PCR được thiết kế xê xích vài độ so với Tm củaprimer (nhiệt độ lý thuyết ) Primer có chiều dài càng lớn, sự chia các template để đượcquấn đôi với primer càng nhỏ Trong khi khuếch đại theo hàm số mũ, một sự cố nhỏ củaquá trình annealing cũng sẽ làm suy giảm kết quả của sản phẩm PCR

Để tối ưu hoá PCR, người ta sử dụng primer có chiều dài tối thiểu sao cho đảm bảo nhiệt

độ melting khoảng 540C, hoặc hơn chút ít, điều này sẽ cung cấp những cơ hội tốt nhất đểduy trì sự chuyên tính và mức độ hiệu quả cao

 Những oligonucleotide ngắn (15 base hoặc ngắn hơn) được dùng một cách hạn chếtrong nhiều qui trình PCR, thí dụ như primer ngẫu nhiên trong mapping các genome đơngiản (Liang và Pardee 1992, Wiliam 1990) Tuỳ thuộc vào kích thước genome của sinhvật, chúng ta sẽ có một độ dài tối thiểu cho hầu hết các ứng dụng PCR là 18 nucleotide

 Nếu cDNA thuần khiết được sử dụng, hoặc nếu DNA của genome không có, thìchiều dài có thể giảm xuống, để mức độ rủi ro do hiên tượng tương tác không chuyên

tính giữa primer và dây template sẽ giảm Người ta thường thiết kế primer có độ dài

Có hai khả năng áp dụng trong thiết kế chiều dài của primer:

Khuếch đại nhhững phần tử có tính đồng dạng (isoform)của protein hoặc một họprotein trong cùng một loài sinh vật, cũng như cloning một gen của loài khác mà sequencecủa nó rất cần thiết cho nhà nghiên cứu (dveksler và ctv.1993)

Khuếch đại những sequence của virut như HIV-1, mà sự biến thiên của sequence, sự

có mặt của sequence, sẽ xác nhận sự có mặt của bệnh do virut gây ra

Trong cả hai trường hợp, người ta đều nhờ phần mềm của máy tính để thiết kế primer,nhằm so sánh tất cả các sequence có liên quan và mô tả vùng của DNA mục tiêu với sốlượng thấp nhất sự biến thiên của chuỗi mã

Khi chọn lựa primer để khuếch đại DNA từ những loài sinh vật khác nhau, chúng ta nêntránh chuỗi mã ở vùng không giải mã được 5’-3’ của mRNA Bởi vì nó có thể không có bất

cứ một mức độ tương đồng nào (homology)

Vị trí đầu 3’ của primer nên được xác định cẩn thận, vì nó có tính chất quyết định cho sựthành công của PCR Khi chúng ta xác định được một amino acid, hai base đầu tiên trongcodon của nó, hoặc base trong trường hợp nó được mã hoá bằng codon đơn (methionine vàtryptophan), thì 2 hoặc 3 base đầu tiên này được dùng như đầu 3’

Những cặp base hoàn chỉnh giữa những đầu 3’ của primer và template cho phép chúng

ta có được kết quả mong muốn và giảm thiểu tối đa hiện tượng không tương xứng(mismatches) trong khoảng 5-6 nucleotide tại đầu 3’ của primer

Thông thường, sự thêm vào sequence không có liên quan tại đầu 5’ của primer vẫn khônglàm thay đổi quá trình annealing Trong một vài trường hợp, khi số lượng base nhiều lên có

ý nghĩa, những base này không tương xứng với sequence của dây template, được thêm vàoprimer Sự khuếch đại 4-5 chu kỳ sẽ có thể hoàn tất, trong điều kiện nhiệt độ annealingthấp

Đối với những primer ngắn hơn 20 mer, Sugg và ctv (1981) đã đề xuất một công thứctính Tm liên hệ với các base: Td=4(G+C)+2(A+T)

Trong khi primer dài hơn, tính toán này chỉ có giá trị gần đúng Sau này nhờ phương tiệncomputer, Breslauer và ctv (1986),Freier và ctv(1986)đã thiết kế PCR primer theo chươngtrình cài đặt sẵn, khá tiện lợi

4.1.2.N ucleotide cuối cùng của primer

Nhiệm vụ của đầu 3’ trong primer là kiểm soát hiện tượng priming nhầm (Kwok và ctv.1990).nhiệm vụ khác của nó là ngăn ngừa hiện tượng tương đồng (homology) trong cùngmột cặp primer, chúng ta phải thận trọng vì primer không phải là sự kiện cái này bổ sungcho cái kia, đặc biệt tại đầu 3’ của nó nếu không thận trọng trong việc xác định đầu 3’,hiệntượng primer –dimers sẽ xẩy ra,với tính chất bổ sung cho nhau, sản phẩm PCR lúc bấy giờ

sẽ là một sự khuếch đại của chính primer, chớ không phải DNA template mà ta mongmuốn trong trường hợp có nhiều cặp primer đưa vào trong cùng một phản ứng (multiplexPCR),

Chúng ta cần phải kiểm tra gấp đôi hiện tượng bổ sung cho nhau của tất cả primer.thông thường trong chương trình cài đặt sẵn của computer, không cho phép cặp primer có

sự tương đồng về đầu 3’,nhằm giảm cơ hội xuất hiện hiện tượng primer-dimers(Chouvàctv.1992)

Do đó khi thiết kế primer, chúng ta phải chú ý đến hàm lượng GC, đôi khi do làm nhiềumẫu, chúng ta sẽ có những kinh nghiệm riêng trong thiết kế primer, nhất là việc chuyển đổisequence của RFLP sang STS marker.

4.1.4 Chon loc không dưa trên computer

Primer phải được chọn lọc từ những vùng được cô tả rất kỹ ở đầu 3’và đầu 5’của mộtsequence rất chuyên tính nào đó Phương pháp thiết kế primer đơn giản ở đây là: chọnnhững vùng có thiếu một nucleotide đơn nào đó.Phương pháp chọn lọc primer như vậy làcách làm giảm cơ hội xẩy ra hiện tượng tương đồng primer-primer.một lần nữa, chúng taphải thận trọng cân nhắc về chiều dài cặp primer, hàm lượng base,để giá trị Tm của primer

và đang được áp dụng

Người ta thực hiện các phương án để dự đoán giá trị Tm trên cơ sở các thông số nhiệt độnghọc Trong chương trình khác, người ta mô hình hoá nhiệt độ annealing dựa trên công thứcđược phát triển từ các đoạn phân tử DNA có độ dài hơn 100 nucleotide (MeConaughy vàctv.1969).Công trình nghiên cứu của Rychlik và ctv(1990)cho phép chúng ta mô hình hoá

về nhiệt độ annealing tối hảo của một cặp primer Sau đó, Wu và ctv (1991)đã dựa trênchiều dài primer, hàm lượng GC,để mô hình hoá nhiệt độ tối hảo này

Hầu hết các chương trình đều nhằm tìm một nhiệt độ annealing thích hợp cho PCR Ngàycàng có nhiều chương trình cải tiến với độ chính xác càng cao, đã được nhiều phòng thínghiệm ứng dụng

Để thiết kế tốt các primer cấn chú ý những điểm sau:

1 Oligo nucleotide không có quá nhiều A hoặc T

2 Tuỳ vào phần mền của chương trình thiết kế trong máy tính

3 Có kinh nghiệm trong việc thiết kế primer

4 Chuỗi mã primer (mã di truyền không quá ngắn)

5 Nhiệt độ trong khi tách và tổng hợp primer phải hợp lý

6 Nếu mã di truyền phải thiết kế là 20 base thì nhiệt độ phải là: Tm=4x(G+C)+2x(A+T)

1) DNA mẫu

Phản ứng khuếch đại tối ưu xảy ra trên DNA thật tinh sạch nhưng nhiều kỹ thuậtchẩn đoán bằng PCR vẫn đạt kết quả tốt với DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào.Lượng DNA mẫu sử dụng cũng có khuynh hướng giảm (1µg xuống còn 100 ng) với việc

sử dụng các polymerase cho hiệu quả cao Hơn nữa việc, giảm lượng mẫu ban đầu cònhạn chế được khuếch đại “kí sinh” tạo những sản phẩm phụ không mong muốn Một ưuđiểm khác của phương pháp PCR là cho phép khuếch đại cả những mẫu DNA khôngđược bảo quản tốt, đã bị phân huỷ từng phần như trong các vết máu lâu ngày, tinh dịch

đã khô, hoá thạch, tóc, móng tay,của người đã chết …

2) Enzyme

Enzyme được sử dụng đầu tiên là đoạn Klenow của DNA polymerase I vì đây làkhông chịu nhiệt nên thao tác phức tạp và hiệu quả thấp ( phải thêm enzyme mới vàophần phản ứng sau mỗi lần biến tính vì enzyme cũ đã bị phân huỷ do nhiệt, nhiệt độ laithấp khiến sự khuếch đại ký sinh rất cao, …) Phương pháp PCR chuyển sang một bướcngoặt mới cùng với sự phát hiện một DNA polymerase chịu nhiệt được tách chiết từ một vikhuẩn suối nước nóng, Thermus aquaticus En zym này – Taq polymerase không bị pháhuỷ ở nhiệt độ biến tính và xúc tác sự tổng hợp từ đầu đến cuối quá trình phản ứng

Ngày nay, nhiều polymerase chịu nhiệt khác đã được đưa ra thị trường với nhiều chức năngchuyên biệt hay hoàn thiện hơn Tth polymerase, một enzyme chiết tách từ Thermusthermophilus, có khả năng hoạt động như một enzyme phiên mã ngược khi có mặt RNAkhuôn và ion Mn++; nhưng với sự hiện diện của DNA khuôn và ion Mg++, Tth pol lại xúctác phản ứng khuếch đại bản mẫu là RNA khuôn thông qua sự hình thành cDNA

3) Mồi và nhiệt độ lai

Mồi là chỉ tiêu quan trọng nhất để đạt được một sự khuếch đại đặc trưng và có hiệu quảcao Việc chọn mồi là giai đoạn quyết định của phương pháp PCR, và phải tuân thủ một

số nguyên tắc:

 Trình tự của mồi được chọn sao cho không thể có sự bắt cặp bổ sung giữa mồi

“xuôi” và mồi “ngược”, và cũng không có cấu trúc “kẹp tóc” do sự bắt cặp bổ sung giữacác phần khác nhau của một mồi

 Tm của mồi xuôi và mồi ngược không cách biệt quá xa Thành phần nucleotid củacác mồi cân bằng tránh các cặp GC lặp đi lặp lại nhiều lần

 Các mồi phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại, không trùng với trình tựlặp lại trên gen

 Trình tự nằm giữa mồi xuôi và mồi ngược không quá lớn ; phản ứng PCR sẽ tối ưutrên những trình tự nhỏ hơn 1kb

4) Các phần khác của phản ứng PCR

Bốn loại nucleotide thường được sử dụng ở nồng độ là 20-200µM/mỗi loại nucleotide.Nồng độ cao hơn dễ dẫn đến sự khuếch đại “kí sinh” Sự mất cân bằng trong thành phần cácnucleotide lại làm tăng các lỗi sao chép của polymerase

Nồng độ ion Mg ++ cũng là một nhân tố ảnh hưởng mạnh đến quá trình PCR Tuy nhiênkhông có quy luật chung cho vấn đề này Nồng độ tối ưu phải được xác định cho từng phảnứng qua nhiều thử nghiệm

5) Số lượng chu kỳ phản ứng PCR :

Trong thực tế, người ta không vượt quá 40 chu kỳ cho một phản ứng PCR Sở dĩ như vậy

là vì phản ứng PCR diễn tiến qua 2 giai đạn, trong giai đoạn đầu số lượng bản sao tăngtheo cấp số nhân với tỉ lệ với lượng mẫu ban đầu, sau đó hiệu quả khuếch đại giảm dần vìnhững nguyên nhân sau:

•Sự phân huỷ cạn và kiệt các thành phần của phản ứng

•sự xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế phản ứng

•Các bản sao vừa được tổng hợp không két hợp với mồi mà bắt cặp với nhau…

•Số chu kỳ cho một phản ứng tuỳ thuộc vào số lượng bản mẫu ban đầu Ví dụ, nếu

số lượng bản mẫu là 105 thì cần 25-30 chu kì, nếu số lượng bản mẫu là 102 – 103

Hơn nữa, ống nghiệm dùng cho phản ứng của cùng một nghiên cứu phải thuộc cùng mộtkiểu vì đặc tính truyền nhiệt của các ống này cũng như độ tiếp xúc giữa ống và bộ phận tạonhiệt của thiết bị có ảnh hưởng lớn đến quá trình khuýech đại

VI.TỐI ƯU HÓA CÁC ĐIỀU KIỆN CHO PHẢN ỨNG PCR

1.Sequence của primer

Thông thường người ta cần có primer chuỗi dài cỡ 18 nucleotide trở lên, áp dụng chogenome của những sinh vật thuộc eukaryote, và primer ngắn –khoảng 10 nucleotidechonhững DNA được clone hóa như cosmid Tuy nhiên tùy theo loại primer tương hợp với mụctiêu lựa chọn marker phân tử trong xét nghiệm PCR, người ta thường có những primer củanhững marker có tính ngẫu nhiên như RAPD rất ngắn (10-16 mer), hoặc STS marker cầnprimer có độ dài 20-24 mer

Tuy nhiên, chúng ta nên nhớ rằng, DNA không phải là chuỗi mã của nhữngnucleotide một cách ngẫu nhiên, mà nó còn có đặc tính của những họ (gene families),những nguyên tố có tính lập lại,sự lập đoạn đơn giản, hay những chuỗi mã lập lại phức tạp(thí dụ những alpha satellite sequence của nhũng genome người) Tùy theo loài sinh vật

và tùy theo cách thể hiện của sequence dây đơn đối lập (templat), người ta sẽ thiết kế chuỗi

mã của primer, và kiểm tra chuỗi mã cẩn thận so với số liệu lưu trữ trước đây, nhằm loại trừcác sai sót về kỹ thuật Gần đây, người ta thường sử dụng phần mềm trong puter để thiết kế

ra những primer theo mục tiêu nghiên cứu

2.Nhiệt độ trong quá trình annealing

Suggs và ctv (1981) đã đề nghị một công thức để ước đoán nhiệt độ Td,mà ở nhiệt độ ấy,một nửa các primer sẽ được phản ứng annealing với sequence mục tiêu.công thức được sửdụng trong điều kiện primer có khoảng 20 oligonucleotide:

Td=4(G+C)+2(A+T)

A,T,G,C là số lượng các base cp1 trong oligonucleotide

Tuy nhiên việc tính toán này chỉ có tính chất tạm thời, chúng ta phải điều chỉnh lạinhiệt độ này để có sự khuếch đại cao nhất và thu nhận tần suất đa hình cao nhất bằng kinhnghiệm, và thực nghiệm xét nghiệm nhiều lần, chúng ta mới có thể có số liệu đúng về nhiệt

độ cho các annealing.số base càng ít, nhiệt độ này càng thấp, và ngược lại hiện nay có

những máy thermal cycler được thiết kế cho phép chung ta đưa vào nhiều nghiệm thức Td

để xác định nghiệm thức tối hảo

3.Phản ứng dung dịch đệm

Một trong những ảnh hưởng có tính chất quyết định là nồng độ Mg2+,kể cả về tác dụngchuyên biệt và kết quả PCR.môi trường có tính chất ion như vậy làm cho dung dịch đệm trởnên năng động hơn rất nhiều do đó nồng độ Mg2+ cao hay thấp đều tạo ra ảnh hưởng rấtkhác nhau trong phản ứng PCR nồng độ cao của Mg2+ sẽ làm cho phân tử DNA dây đôi

ổn định hơn, và ngăn ngừa sự biến chất hoàn toàn (sự mở dây để cho dây đơn)của sản phẩmtrong mỗi chu kỳ, làm cho kết quả PCR ít hơn Lượng dư thừa Mg2+ còn làm cho hiệntượng annealing giả xẩy ra thêm ổn định hơn, tại những vị trí không đúng của dây đơn,cho

ra nhửng sản phẩm không mong muốn với số lượng khá lớn, nhưng mức độ chuyên tính rấtthấp (Oste 1989)

Ngược lại, nếu nồng độ Mg2+quá thấp (<0,5µM),nó sẽ làm xấu đi quá trình extension(kéo dài chuỗi mã đối lập với dây gốc),trong đó Mg2+đóng vai co factor của Taqpolymerase Một vài ion Mg2+ sẽ được kẹp giữ bởi Dntp trong phản ứng Do đó, người tacần phải xác định nồng độ tối ưu của Mg2+ nhằm đảm bảo kết quả số lượng sản phẩm và sựchuyên tính của sản phẩm PCR trong một vài vùng có tính chất recalcitrant nghĩa là có rấtnhiều cặp GC,thì chỉ cần có một khoảng biến thiên rất hẹp về nồng độ Mg2+,đủ cho ra kếtquả PCR và sự chuêyn tính mong muốn

Môi trường đệm KCl đã và đang được áp dụng rộng rãi, cũng có thể là buffer rất hữudụng cho kỹ thuật PCR Tuy nhiên trong một vài loci, người ta thấy môi trường đệm này rấtkhó dùng cho khuếch đại sản phẩm, chỉ trừ Mg2+ đã được lựa chọn

PCR của những loci giàu GC cho thấy: mức độ chuyên tính gia tăng khi khuếch đạitrong dung dịch đệm NaCl,nhờ sự biến chất hoàn toàn (complete denature) (Holm và ctv1991)

Người ta còn tìm thấy dung dịch đệm ammonium sulpate –dung dịch được sử dụngrất sớm –làm giảm những sản phẩm được phát triển một cách không hoàn toàn trong PCRvới Taq phương pháp này dùng để phát hiện những băng có trọng lựơng phân tử thấp chạytrên acrylamide gel,đối với những sản phẩm PCR được theo dõi nhờ đánh dấu phóng xạ

pH của dung dịch đệm cũng được xem xét trong kỹ thuật PCR Hầu hết các dungmôi phản ứng được đệm trong môi trường 10-50 Mm Tris –HCl ở pH=8,3, nhiệt độ

20oC.tuy nhiên pH sẽ giảm khi nhiệt độ tăng Theo chu kỳ nhiệt độ của PCR, pH sẽ thay đổi

từ 7,8 đến 6,8.với khoảng giá trị như vậy, pH được xem như tạm chấp nhận

5 polymerase chịu nhiệt

Nếu DNA polymerase dư thừa, chúng ta sẽ thấy hiện tượng tổng hợp DNA do phản ứnggiả của primer trên dây đơn trong hầu hết các protocol, người ta khuyến cáo nồng độ Taqpolymerase nên sử dụng là 0,5 U /25µl,sẽ cung cấp emzyme có nồng độ phân tử thấp nhấtcho mọi hợp phần của phản ứng, 1Nm Sau khi khuếch đại 106-fold ở vùng mục tiêu khởiđầu, 1 Fm, chúng ta sẽ có một số lượng phân tử tương đối với phân tử enzyme Nồng độ ít