Đề tài : áp dụng kỹ thuật phản ứng chuỗi polymerase (PCR-RFLP) để phân biệt giun đũa người và giun đũa lợn

Đề tài : áp dụng kỹ thuật phản ứng chuỗi polymerase (PCR-RFLP) để phân biệt giun đũa người và giun đũa lợn Tác giả : Hoàng văn tân Viện sốt rét kí sinh trùng trung ương

BỘ Y TẾ

VIỆN SỐT RÉT- KÝ SINH TRÙNG - CÔN TRÙNGTRUNG ƯƠNG

BÁO CÁO KẾT QUẢ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU CẤP VIỆN

AP DUNG KY THUAT PHAN UNG CHUO!

POLYMERASE (PCR-RFLP) DE PHAN BIET

GIUN DUA NGƯỜI VẢ GIUN ĐÙA LỢN

Chủ nhiệm đề tài: Th.s Hoàng Văn Tân

Cơ quan chủ trì để tài: — Viện Sốt rét- Ký sinh trùng- Côn trùng

Trung ương

Hà Nội, năm 2007

Fu Lh

3 Jhj\J

BỘ Y TẾ

VIEN SOT RÉT- KÝ SINH TRÙNG - CÔN TRÙNGTRUNG ƯƠNG

BÁO CÁO KẾT QUẢ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU CẤP VIỆN

ÁP DỤNG KỸ THUẬT PHẢN ỨNG CHUÔI

POLYMERASE (PCR-RFLP) ĐỂ PHÂN BIỆT

GIUN DUA NGUGI VA GIUN DUA LON

Chủ nhiệm đề tài: Th.s Hoàng Văn Tân

Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Sốt rét- Ký sinh trùng- Côn trùng

Trung ương Cấp quản lý đề tài : Viện Sốt rét- Ký sinh trùng- Côn trùng

Trung ương

Mã số đề tài:

Thời gian thực hiện để tài: Từ tháng 5 năm 2006 đến tháng 12 năm 2007

Hà Nội - 2007

BÁO CÁO KẾT QUẢ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU CẤP VIỆN

Tên đề tài: Áp dụng kỹ thuật phản ứng chuỗi polymerase (PCR-RELP) để

phân biệt giun đũa người và giun đũa lợn

1.Chủ nhiệm đề tài: Th.s.Hoàng Văn Tân

2.Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Sốt rét- Ký sinh trùng- Côn

trùng Trung ương

3.Cơ quan quản lý đề tài: Viện Sốt rét- Ký sinh trùng- Côn

trùng Trung tơng

4.Danh sách những người thực hiện chính:

Th.s Hoàng Văn Tân Viện Sét rét-KST- CITU

Th.s.Nguyén Thi Huong Binh Viện Sốt rét-KST- CTTƯ PGS.TS.Nguyễn Đức Mạnh Viện Sốt rét-KST- CTTƯ Th.s Lê Đức Đào Viện Sốt rét-KST- CITƯ

Th.s Hà Viết Viên Viện Sốt rét-KST- CTTƯ

5 Thời gian thực hiện: Từ tháng 5 năm 2006 đến tháng 12 năm 2007

CAC CHU VIET TAT

PCR-RELP: Phản ứng chuỗi Pholymerase phan tich tính đa hình độ

đài đoạn phân cắt giới hạn

KST : Ký sinh trùng

§L : Số lượng

ITS-1 : Vung phiên mã trong

TTS-2 : Vùng phiên mã trong

ADN : axit dezoxyribonucleic

dNTP, : dezoxy nucleotide triphophate

dATP : dezoxy adenosine triphophate

dGTP :.dezoxy guanidine triphophate

‘ dCTP : dezoxy cytosine triphophate

dTTP : dezoxy thymidine triphophate

Taq - Polymerase: enzym polymerase cua Themophilus

Buffer : Dung dich dém

Primer: Méi

TE: (Tris-base + EDTA)

EB: Extraction buffer

PBS _: phophate buffered saline (Dém phốt phát)

bp : base pair ( Doi bazo nit )

- HỈ : microlit

Marker: Thang đo trọng lượng phân tử

WHO, : Tổ chức Y tế thế giới

Loi cam on

Đề tài được hoàn thành tại Khoa Sinh học Phân tử Viện Sốt rét - Ký

sinh trùng - Côn trùng Trung Ương

Hoàn thành đề tài này tôi đã nhận được sự giúp đỡ nhiệt tình của Th.s

Nguyễn Thị Hương Bình, sự giúp đỡ chu đáo của GS.TS Nguyễn Đức Mạnh,

sự cộng tác nhịp nhàng của Th.s Hà Viết Viên và các anh chị em trong Khoa Chúng tôi vô cùng cảm ơn sự tạo điều kiện thuận lợi của Lãnh đạo

Viện, đặc biệt là sự giúp đỡ và tạo điều kiện của Khoa Sinh học Phân tử,

Phòng Quản lý Khoa học Viện, Phòng Kế hoạch Tổng hợp và Phòng Kế Toán tài chính, cùng các phòng chức năng có liên quan đã giúp chúng tôi

hoàn thành đề tài đúng tiến độ

Tôi xin trân trọng cảm ơn mọi sự giúp đỡ qúi báu đó !

Hà Nội, ngày 20 tháng 8 năm 2007

[Ue

Lo

Th.s Hoang Van Tan

MỤC LỤC

PHẦN A.TÓM TẮT KẾT QUẢ NỔI BẬT CỦA ĐỀ TÀI me

1.KẾT QUẢ NỔI BẬT CỦA ĐỀ TÀI 2.2 n2 1 ve, 1

2.ÁP DỤNG VÀO THỰC TIỀN SẲN XUẤT VÀ ĐỜI SỐNG XÃ HỘI 2

3.ĐÁNH GIÁ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI ĐỐI CHIẾU VỚI ĐỀ CƯƠNG NGHIÊN

ˆ CỨU ĐÃ ĐƯỢC DUYỆT - 1 1 1112 2211 1112121211211 2

4 CÁC Ý KIẾN ĐỂ XUẤT - G1 SE1E112152112111121111 1x1 xe 2

PHAN B NO! DUNG BAO CAO CHI TIET KET QUA NGHIÊN CỨU 3

2.TỔNG QUAN TAI LIEU LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI 4

2.1.Nghiên cứu trong nước . -‹- sàn nọ n* He nàn HH Hàn Hàn hen

2.2.Nghiên cứu nước ngoài

3 THỜI GIAN, ĐỊA ĐIỂM, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

211" 8

3.1.Thời gian nghiên eee entree et nee renee nent tenet res 8

3.2.Địa điểm nghiên cứu - HH HH ng HH nh ng nh kh 8 3.3 D6i tugng nghién CUU cece cece e tence cee ee nae te etree a see ene teeees 8

3.4.Phương pháp nghiên CỨU - on nh nh Hà 8

3.4.1 Thiết kế nghiên cứu - .c- cu SH HY nh nh nh nhe oe 9

3.4.3.Các kỹ thuật sử đụng trong nghiên cứu .- - sàn cà ec 8 3.4.3.1.Thu thập mẫu và bảo quản mẫu nàn se 8

3.4.3.2.Phân biệt giun đũa người và giun đũa lợn bằng dấu hiệu hình thái 8

3.4.3.3 Phân biệt giun đữa người và giun đữa lợn bằng kỹ thuật PCR 8

4.1:Tình hình nhiễm giun tại điểm nghiên cứu cà cse 12

4.2.Phân biệt giun đũa người và giun đũa lợn à cà nànseehheneeeiee 13 :_4.2.1.Phân biệt hình thể giun đữa người và giun đữa lợn : kim 13

4.2.2.Phân biệt giun đũa người và giun đũa lợn bằng kỹ thuật PCR-

REP ooo cence eect eee nà TH TK TK SH Tà kh cà th nh ác cơn l6

4.2.2.1 Sản phẩm PCR của giun đũa người và giun đữa lợn khi chưa cắt enzym Hately ha ee eeeeeeteeeteeeanebbeaeeeweneereeeegs 16 4.2.2.2.Sản phẩm PCR của giun đũa người và giun đũa lợn đã cất enzym

210 e ic cccecne eee eect e eee nee ten een ete ees neeegeneceaeseeteseesetenaeetiees 17

5 BÀN LUẬN L2 S2 22221 1H 1 2 tk te 18 S.1.Kích thước g1un - -c HH ni ch kg 18 5.2.Hinh ảnh răng của ascaris lumbricoides và asCariS suum

5.3.Phan biệt giun đũa người và giun đũa lợn bằng kỹ thuật

0 18 6.KẾT LUẬN VÀ ĐỂ NGHỊ - Q ST HH ng HH Huệ 20 TAL LIEU THAM KHẢO L0 L2 nh HH HH Hàn 2n tàn 21

PHẦN A.TÓM TẮT KẾT QUẢ NỔI BẬT CỦA ĐỀ TÀI

1.KẾT QUÁ NỔI BẬT CỦA ĐỀ TÀI

1.1.Đóng góp mới của đề tài: Đã bổ sung cho phương pháp định loại một phương pháp chẩn đoán mới (Phương pháp chẩn đoán bằng kỹ thuật PCR)

1.2 Kết qủa cụ thể của đề tài:

Chúng tôi đã tiến hành phân tích 119 mẫu giun đũa, trong đó có 68 mẫu giun đũa người

(Ascaris lumbricoides) và 51 mẫu giun đũa lợn của hai xã Phương Trung, huyện Thanh Oai

và xã Phụng Châu, huyện Chương Mỹ tỉnh Hà Tây, bằng phản ứng chuỗi polymerase (PCR - RFLP)

Áp dụng kỹ thuật PCR để nhân vùng phiên mã thứ nhất (ITS-1) ở giun đũa, sau đó cắt sản phẩm PCR bang enzym Haelll tai vị trí 358 đối với giun đữa người cho ra 2 băng, với kích thước các băng lần lượt là 610 bp và 370 bp Enzym HaelII cat san phẩm PCR của giun đũa lợn tại hai vị trí 131 và 358 cho ra 3 băng, với kích thước các băng lần lượt là 610 bp, 230

bp va 140 bp

Dựa vào số lượng băng cắt và kích thước của các băng, ta có thể phân biệt được giun đữa người, giun đũa lợn Tuy nhiên trong nghiên cứu này chúng tôi phát hiện được 14,7% giun đữa người có 4 băng, trong đó có một băng chung cho cả giun đũa người và giun đữa lợn (kích thước 610 bp) và một băng của giun đũa người (kích thước 370 bp), hai băng còn lại có kích thước trùng với kích thước hai băng của giun đũa lợn (230 bp và 140 bp)

1.3 Hiệu quả tào tạo: Nâng cao trình độ thực hành kỹ thuật PCR cho các cán bộ nghiên cứu

1.4 Hiệu quả kinh tế và xã hội

Áp dụng phản ứng chuỗi polymerase (PCR - RELP) phân biệt giun đũa người và giun đũa lợn đã khấc phục được những khó khăn mà phương pháp định loại bằng hình thái gặp phải Mặt khác thông qua kỹ thuật này ta có thể xác định được khả năng nhiễm chéo giun đũa lợn trên người và ngược lại -

2 AP DUNG VAO THUC TIEN SAN XUAT VA DOI SONG

Ứng dụng thực tiễn tại các labo sinh học phân tứ về ky sinh trùng đường ruột trong việc

chẩn đoán phân biệt giun đũa người và giun đũa lợn

3 ĐÁNH GIÁ ĐỀ TÀI VỚI ĐỀ CƯƠNG NGHIÊN CỨU ĐÃ ĐƯỢC DUYỆT

a Dé tài đã thực hiện đúng tiến độ ( từ tháng 5/ 2006 -L2/ 2007)

b Da thuc hiện thành công phân biệt giun đũa người và giun đũa lợn bằng kỹ thuật PCR

c Dé tai đã có báo cáo tiến độ và báo cáo tổng kết đúng thời hạn

PHAN B NOI DUNG BAO CAO CHI TIET KET QUA NGHIEN CUU 1.DAT VAN DE

Bệnh giun đũa là một bệnh xã hội Bệnh nhiễm ở hầu hết mọi lứa tuổi, mọi

giới, từ nông thôn, thành thị đến các vùng núi cao Tác hại bệnh chủ yếu là chiếm chất bổ đưỡng từ thức ăn của vật chủ, làm chậm lớn, chậm phát triển trí

tuệ, bệnh có thể gây tử vong do giun chui ống mật, tắc ruột đo giun v v

Nước ta là nước nông nghiệp, nằm trong vùng nhiệt đới gió mùa có điều kiện khí hậu, nhiệt độ, ẩm độ và thổ nhưỡng rất thích hợp cho các bệnh ký sinh

trùng đường ruột phát triển, đặc biệt là bệnh giun truyền qua đất rất phổ biến và

nhiễm ở hầu hết mọi lứa tuổi, mọi giới nhưng cao hơn ở lứa tuổi trẻ em Vì vậy

việc phòng và chống bệnh giun đường ruột là một việc làm rất cần thiết và đã từ

lâu là nỗi mong mỏi của nhiều người Trước tình hình đó, nhiều nhà khoa học đã

đi sâu nghiên cứu để tìm ra các biện pháp phòng chống bệnh thích hợp nhằm

làm giảm tỷ lệ và cường độ nhiễm giun trong nhân dân, đặc biệt là lứa tuổi học

sinh

Các nghiên cứu về giun truyền qua đất trước đây chủ yếu nghiên cứu về

bệnh học, điều tra và điều trị bệnh, song do dân cư sống tập trung, điều kiện vệ sinh môi trường còn yếu, môi trường sống quanh ta bị ô nhiễm trứng giun rất

trầm trọng (Võ Viết Hưu và cộng tác viên,1960; Đỗ Dương Thái, Nguyễn Phan

Long, 1973; Hoàng Thị Kim và cộng tác viên, 1987 )[2,3,4] Vì vậy ở miền Bắc

chỉ sau một thời gian ngắn 6 tháng sau điều trị có tới 90% số người bị tái nhiễm

giun đũa ( Đễ Dương Thái và CS (1976) [5]

Trong những năm gần đây, tình hình các bệnh giun truyền qua đất ở nước

ta vẫn chưa được cải thiện đáng kể Theo điều tra của Viện Sốt rét Ký sinh trùng-

Côn trùng trung ương (KST-CT.TƯ)1998, cho thấy tỷ lệ nhiễm bệnh giun truyền

qua đất vẫn còn cao ở cả 3 miền Ở miền Bác tỷ lệ nhiễm giun đũa từ 50-95%,

giun tóc từ 58-89%, giun móc từ 3-67% Ở miền Trung tỷ lệ nhiễm giun đũa từ 12,5-70,5%, giun tóc từ 12,7- 47%, giun móc tit 36- 69% Ở miền Nam tỷ lệ

nhiễm giun đũa từ 10- 60%, giun tóc từ O,5-1,7%, giun móc từ 47- 68% [1]

Mặt khác, ở nước ta giun đũa người và giun đũa lợn luôn song song tồn tại

Để góp phần vào công tác phòng chống bệnh có hiệu qủa cao, việc phân biệt hai

loại giun đũa nói trên có một ý nghĩa hết sức quan trọng trong công tác phòng

chống bệnh tại cộng đồng Về mặt hình thái, kích cỡ trứng giun và giun đũa trưởng thành từ người và từ vật chủ lợn là tương tự nhau, chu kỳ sống của hai

loại giun này giống nhau, do vậy khó có thể phân biệt được bằng hình thể giữa hai loại giun nói trên Để giải quyết vấn đề này, việc áp dụng kỹ thuật phân tích

tính đa hình độ dài đoạn phân cắt giới hạn từ sản phẩm PCR để phân biệt giun đũa từ người và từ vật chủ lợn là rất cần thiết Do vậy chúng tôi tiến hành đề tài:

“Áp dụng kỹ thuật phản ững chuỗi polymerase (PCR- RFLP) để phân biệt giun đũa người và giun đũa lợn '°

Mục đích đề tài:

Ấp dụng kỹ thuật phản ứng chuỗi pholymerase (PCR-RFLP) để phân biệt giun

đũa người và giun đũa lợn

2.TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1.Nghiên cứu trong nước

Định loại dựa vào các đấu hiệu hình thái được áp dụng từ xa xưa và rất phổ biến ở nhiều nước trên thế giới Phương pháp này đã đóng góp to lớn vào việc xác định thành phần loài trong nghiên cứu nói chung và nghiên cứu các bệnh ký sinh trùng nói riêng, phương pháp dựa vào dấu hiệu hình thái vừa kinh tế, vừa đơn giản, lại nhanh và có thể áp dụng ngay tại thực địa Tuy nhiên, phương pháp này

cũng bộc lộ những hạn chế nhất định trong những trường hợp mẫu vật không

điển hình, mẫu vật không còn nguyên vẹn, các mẫu vật có mức độ tương đồng cao v.v thì việc xác định thành phần loài cũng gặp phải những khó khăn nhất định

Đỗ Dương Thái,(1971) khi nghiên cứu về hình thể trứng, ấu trùng và giun trưởng thành thấy rằng hiện vẫn còn khó khăn, chưa phân biệt được giữa giun đũa người và giun đũa lợn, do vậy chưa giúp được cho dịch tế học một cách có hiệu quả Ở nước ta, giun đũa người và giun đũa lợn rất phổ biến và song song tồn tại

Việc xác định hai loại giun là đồng nhất hay tách rời vẫn còn là một vấn đề

nghiên cứu rất cần thiết, vừa có tính ứng dụng trong phân loại, vừa ứng dụng

trong địch tế, bệnh học[ 1]

Theo nghiên cứu của Đỗ Dương Thái (1973), hình thể bên ngoài của trứng,

ấu trùng giun đũa và giun đũa trưởng thành được tác giả mô tả không có gì đặc biệt so với tài liệu cổ điển Theo tác giả, mầu sắc của giun trưởng thành có sự

thay đổi tuỳ theo từng cơ thể và từng mẫu giun Thường giun đũa có mầu sắc thay đổi từ mầu trắng sữa đến mầu hồng nhạt, mầu sắc có liên quan đến sức để

kháng của giun Tác giả cho biết, giun có mầu hồng nhạt thường có khả năng

sống lâu hơn trong môi trường bảo tổn gồm nước sinh lý và glucoza, mầu sắc

giun cũng không giúp gì cho công tác định loại[4]

Một số tác giả lại dựa vào vị trí lỗ sinh duc va 16 bài tiết của giun cái để xác định, nhưng các đặc điểm này thường không ổn định và có thay đổi giữa giun

đũa người A iumbricoides và giun đũa lợn A.suwm Do vậy Krotor, Phạm Hoàng

Thế (1973) đề xuất không dựa vào đặc điểm này để định loại [1]

Ở một số giun đũa người phần đuôi có mấu thịt hình cánh, nhưng mấu thịt

này chỉ có trên một số giun (20%) và chưa xác định được tính chất liên quan đến

định loại (Đỗ Dương Thái, Phạm Hoàng Thế, 1973) So với tài liệu cổ điển,

những dẫn liệu mới và cấu tạo cơ quan sinh dục của giun đũa không có gì khác trước và không có gì sai khác với tài liệu nước ngoài Ngay cả những hình thể của

mẫu vật cắt mảnh cũng không sai khác với kết quả nghiên cứu của thế giới (Đỗ Dương Thái và CS,1973) đo vậy cũng không thể dựa vào những đặc điểm đó để

định loại [1]

Những nghiên cứu phân loại bằng hình thể giữa giun đũa người và giun đũa lợn trước đây chưa thực sự có tính thuyết phục cao, mặt khác nhằm mở ra triển vọng nghiên cứu về gen học trong tương lai, Đoàn Hạnh Nhân (1971) đã bắt đầu nghiên cứu thể nhiễm sắc trên giun đũa của người Tác giả đã dùng tinh hoàn

của giun đực để tách và đếm số thể nhiễm sắc, sau đó cố định thể nhiễm sắc với dung dịch carnoy rồi nhuộm Giêm sa và quan sát Theo tác giả, nhân tế bào của

giun đũa có 24 nhiễm sắc thể, mặt khác hình dạng thể nhiễm sắc giun đũa người

có hình thể từng đôi dạng V, dạng chấm, đạng que, dạng chùy thắt [1]

2.2 Nghiên cứu ngoài nước:

Đã nhiều năm qua, những tranh luận về giun đũa từ người Ascaris

lumpricoides (Linnaeus, 1758) với A.suum (Goeze, 1782) từ lợn có phải là cùng

loài hay là hai loài riêng biệt đã được hàng loạt các nghiên cứu khác tìm đến địa chỉ của câu hỏi này [9,14 ] Với những điều tra cắt ngang, chứng minh giun đũa

ở người có thể nhiễm sang lợn và ngược lại, người cũng có thể nhiễm giun đũa từ vật chủ lợn [14,16,27] Để làm rõ vấn đề này, một số tác giả khác đã nghiên cứu

hai loại giun nói trên dựa vào hình thể {[16, 17, 25, 26], hình thể của ấu trùng giun đũa rất đơn giản và nhỏ, do vậy việc xác định chính xác loài là gặp nhiều khó

khăn [24,26]

Một số nghiên cứu dựa vào răng của giun đũa (Linnaeus,1758;

Sprent,1952; By W.Crewe va David H.Sminth,1970) Theo tác gia Linnaeus

1758, răng của giun đũa nhỏ, răng có hình tam giác nằm ở phía trong và cuối bờ môi của giun [17]

Sri S.Abdulrachimax và Lie kian Joe (1954) [25] cũng đồng ý với Sprent, răng của hai loài này là khó xác định, từ nhiều góc độ khác nhau của răng, cả về

hình thái cũng như về kích cỡ nhiều khi không rõ ràng Theo tất giả, răng của giun đũa người có chiều dài 2-7H (thường thường 4-5H) và chiều rộng 2-6 H

(thường thường 4-5H) Trong khi đó giun đũa từ lợn răng có chiều đài 2-11 H (thường thường 5 Ù), chiều rộng 3.9 H (thường thường 5-6H) Các tác giả cho rằng răng của giun đũa lợn thường lớn hơn và có thể nhìn rõ hơn răng của giun

đũa người khi soi dưới kính hiển vi [25]

Khi nghiên cứu 93 mẫu giun đũa trong đó có 50 mẫu giun đũa từ người và

43 mẫu giun đũa từ lợn, tác giả chỉ thấy 38/50 mẫu giun đũa từ người có răng trong đó có 12 mẫu có kiểu răng điển hình còn 26 mẫu có kiểu răng của loại

khác

Ở giun đữa lợn phát hiện 31/ 43 mẫu có răng trong đó có 3 mẫu có răng nhỏ kiểu giun đũa người còn lại 28 mẫu có kiểu răng của loại khác Tuy nhiên, cũng khá nhiều trường hợp răng của giun đũa người thường khó nhìn thấy được

do nó có lớp màng có các hạt nhỏ bao phủ còn ở giun đũa lợn, răng gần như nhìn

thấy rõ hơn [25]

Theo đánh giá của Sri S Abdulrachimax va Lie kian Joe (1954), nhin

chung rang của giun đũa người có kích cỡ nhỏ hơn răng giun đũa lợn và sự khác biệt về răng của hai loại giun nói trên là không rõ ràng[25]

Ngoài việc dựa vào răng để phân biệt giun đữa người và giun đũa lợn, M

Ansel và M.Thibaut (1972) còn dựa vào miệng giun đũa để định loại Theo các tác giả, lỗ miệng của giun đũa lợn hình lục giác còn giun đũa người lỗ miệng có hình

tứ giác [8]

Một nhóm nghiên cứu khác lại giám định Ascaris lumbricoides va Ascaris suum bằng các protein Trong quá trình nghiên cứu, các tác giả đã phát hiện ra 6 protein đặc trưng cho giun đũa Ascaris iumbricoides mà không có ở giun đũa lợn Theo các tác giá thì 6 protein đặc trưng đó là:1, 2, 3, 4, 5, 6 tương ứng

118kDa, 116kDa, 110kDa,105kDa, 25kDa va17kDa [29]

Bằng kỹ thuật PCR, các tác giả sử dụng enzym phân cắt giới hạn HaelII, cắt sản phẩm PCR của giun đũa Sau đó, các tác giả sử dụng kỹ thuật điện di,

thấy giun đũa lợn có 3 băng, trong khi đó giun đũa người cho ra 2 băng từ đó tác

giả có thể nhận biết được giun đũa người và giun đữa lợn, thông qua số lượng

băng và kích thước của các băng khi soi dưới đèn cực tím [27, 28]

Anderson 1994, bằng kỹ thuật PCR cho thấy ở Bắc nước Mỹ đã tìm thấy

giun đũa lợn nhiễm trên người Điều đó càng lo ngại khi có nhiều trứng giun đũa được tìm thấy trong đất và có khả năng nhiễm nhiều hơn nếu như phân lợn được

sử dụng bón cây ở vườn và cây nông nghiệp Mặc dù vậy, sự nhiễm chéo trong tự nhiên là có giới hạn (Anderson và CS, 1997), khi tác giả không phát hiện ra trường hợp nào người bị nhiễm giun đũa lợn ở làng Guatemala[7]

Năm 2004, nhóm nghiên cứu hợp tác giữa Đan Mạch và Bangladesh gồm Perter Nejsum, E Davis Parker, Jane Frydenbeng đã tiến hành phân tích 135

mẫu giun đũa ở 5 quốc gia khác nhau trên thế giới, gồm 71 mẫu thu thập từ người

và 64 mẫu thu thập từ lợn, trong đó có 32 mẫu từ 29 người Đan Mạch Khi phân tích 32 mẫu này bằng PCR-RFLP thì có 27 trường hợp do bị nhiễm giun đũa có nguồn gốc từ lợn nội địa Trong số này có trên 80% được biết có tiếp súc với lợn hoặc phân lợn Từ đó các nhà nghiên cứu ra khuyến cáo Đan Mạch cần quan tâm

nhiều đến các bệnh từ thú [23]

Ở Trung Quốc, nghiên cứu về sự thay đổi gen của quần thể giun đũa người

và lợn ở cùng điểm phân bố WelDong Peng; TJ.C Anderson; Xingquan Zhu va

Wkennedy1998, đã chỉ ra một vấn đề quan trọng là có rất ít gen bắt nguồn giữa

quần thể KST người và quần thể KST lợn, mặc đầu lịch sử tiếp súc giữa người và lợn đã có từ rất lâu ở Trung Quốc, đồng thời qua nghiên cứu này các tác giả cũng

không gặp trường hợp nhiễm chéo nào tại điểm nghiên cứu [27].

`

3 THỜI GIAN, ĐỊA ĐIỂM, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1.Thời gian nghiên cứu : 18 tháng (5/2006-12/2007)

3.2 Địa điểm nghiên cứu:

- Địa điểm thu mẫu: xã Phương Trung, huyện Thanh Oai và xã Phụng Châu,

huyện Chương Mỹ, tỉnh Hà Tây

- Địa điểm phân tích mẫu: Labo Sinh học Phân tử Viện Sốt rét- KST- CTTƯ Khái quát một số nét về điểm nghiên cứu:

a/ Xã Phương Trung:

Xã Phương Trung, huyện Thanh Oal, tỉnh Hà Tây là một xã nông nghiệp,

có dân số 14 nghìn dân (theo thống kê 3/2006), diện tích lúa nước là chủ yếu chiếm 4/5 diện tích canh tác, diện tích trồng mầu chỉ chiếm 1/5 diện tích canh tác Ngoài vấn đề làm nông nghiệp, nhân dân ở xã còn có nghề phụ làm nón, làm

lá và buôn bán, kinh doanh nhỏ

bí Xã Phụng Châu:

Xã Phụng Châu, huyện Chương Mỹ, tỉnh Hà Tây có diện tích trồng mầu

chiếm khoảng 2/3 điện tích canh tác.Trong nông nghiệp, hầu hết các gia đình sử

dụng hai nguồn phân chính là phân chuồng và phân hoá học Nguồn phân chuồng được sử dụng để bón lót là chính và đều quan trọng là phân chuồng hầu hết được ủ kỹ trước khi sử dụng Tuy nhiên thỉnh thoảng vẫn còn một vài gia đình còn dùng phân tươi hoà nước lã để tưới cho ngô, bầu, bí và lúa

3.3 Đối tượng nghiên cứu:

- Giun đũa nhiễm ở người Ascaris lumbricoides (Linnaeus, 1758)

- Giun đũa từ vật chủ lợn Áscaris suwm (Goeze,1782)

3.4.Phương pháp nghiên cứu :

3.4.1.Thiết kế nghiên cứu : Nghiên cứu mô tả cắt ngang

3.4.2 Cỡ mẫu: Cỡ mẫu được chọn theo cỡ mẫu sinh học, tối thiểu 30 mẫu mỗi loại Tổng số 60 mẫu, trong đó có 30 mẫu giun đũa nhiễm ở người và 30 mẫu

giun đũa nhiễm ở vật chủ lợn

3.4.3 Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu

3.4.3.1.Thu mẫu vật và bảo quản mẫu

-Thu thập mẫu giun đũa người (Ascaris lumbricoides): (Theo phương pháp

thường quy của Viện Sốt rét -KST-CTTU)

Xét nghiệm phân tìm người nhiễm giun đũa bằng phương pháp Kato

(Theo WHO, 1991), sau đó tiến hành tẩy giun và thu thập mẫu giun đũa từ người bằng đãi phân tìm giun đũa sau uống thuốc tẩy giun trong thời gian từ l-5 ngày, nếu không thu được giun thì thôi không phải đãi phân những ngày tiếp theo

Phác đồ điều trị giun đũa:

Thuốc tẩy giun đữa trên thị trường hiện nay có rất nhiều loại, tuy nhiên

chúng tôi chọn những thuốc đặc hiệu với giun đũa như thuốc pyrantel pamoate

125mg/viên do Canada sản xuất tiến hành điều trị theo hướng dẫn của nhà sản xuất và được Bộ Y Tế cho phép lưu hành tại Việt Nam Ngoài ra chúng tôi còn

sử dụng thuốc đã được Viện Sốt rét KST- CTTƯ và Dự án Phòng chống giun sán

do WHO tài trợ điều trị hàng loạt nhiều năm tại địa phương đó là thuốc :

Mebendazonle 500mg liều duy nhất

(Phác đồ điều trị theo Dự án Phòng chống giun sán do WHO tài trợ giai đoạn

2002-2005)

-Thu thập mẫu giun đũa trên vật chủ lợn (Ascaris suum):

Tại địa điểm mổ lợn của điaạ phương ( Phương thức thu mẫu giun đũa lợn và bảo quản mẫu giống như giun đũa người)

-Bdo quản mẫu: (Bảo quản mẫu theo theo Anderson va CS, 1993a)

Giun sau khi thu thập được rửa bằng nước muối sinh lý 0,9/%, sau đó cho vào lọ có đựng sẵn cồn 70C, nghi rõ ngày thu mẫu, nguồn gốc lợn từ đâu và bảo

quản mẫu ở tủ lạnh sâu (-20°C đến - 30 °C) cho đến khi sử dụng

3.4.3.2 Phân biệt giun đũa người và giun đũa lợn bằng dấu hiệu hình thái

Phương pháp định loại bằng hình thể có sử dụng kính lúp, kính hiển vi đối pha để quan sát và chụp ảnh nghỉ hình

Dùng thước đo có chia vạch, đo chỉ tiết từng giun, làm tiêu bản phần miệng

để quan sát chỉ tiết răng và so sánh giữa hai loài Asccaris lumbricoides, Ascaris suum (Tiêu bản làm theo kỹ thuật thường qui của Viện Sốt rét-KST-CTTU) 3.4.3.3 Phân biệt giun đũa người và giun đũa lợn bằng kỹ thuật PCR

Áp dụng kỹ thuật phản ứng chuỗi polymerase phân tích tính đa hình độ dài đoạn

phân cắt giới hạn (PCR- RFLP) theo Xingqua Zhu và CS,1998