Thực tập vi sinh vật học phần 2 đàm sao mai

Thông qua số lượng khuẩn lạc đếm được trên các đĩa petri cho phép xác định được lượng vi sinh vật sống còn khả năng sinh trưởng trong mẫu ban đầu.. Xác định gián tiếp số lượng tế bào bằn

Bài 14 ĐỊNH LƯỢNG TỔNG VI KHUẨN HIẾU KHÍ TRONG

I NGUYÊN T ẮC

Tổng vi khuẩn hiếu khí là tổng số các loại vi khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn hiếu khí tồn

tại trong môi trường Trong quá trình sinh trưởng và phát triển, nhóm vi khuẩn này cần oxy

cho quá trình hô hấp hiếu khí để chuyển hóa các hợp chất hữu cơ thành năng lượng ATP

cung cấp cho hoạt động của chúng Các nhóm vi sinh vật hiếu khí tồn tại trong môi trường

nước chúng sẽ phân giải tích cực các hợp chất hữu cơ tạo thành những sản phẩm cuối cùng

là CO2 và giải phóng ATP Tổng số vi khuẩn hiếu khí là một trong những tiêu chí để đánh

giá mức độ an toàn vệ sinh thực phẩm của thực phẩm Và hầu như trong tất cả các loại thực

phẩm, nước uống, khi phân tích chất lượng vi sinh vật, chỉ tiêu tổng vi khuẩn hiếu khí là

bắt buộc phải phân tích Các bộ tiêu chuẩn về thực phẩm, nước uống luôn có mức giới hạn

cho tiêu chuẩn này Ví dụ: theo tiêu chuẩn TCVN 7046 : 2002 giành cho sản phẩm thịt

tươi, chỉ tiêu tổng số vi khuẩn hiếu khí là: 106

khuẩn lạc/1g thịt Nếu vượt quá giới hạn,

thực phẩm được xem là không an toàn cho người sử dụng

Tổng số các nhóm vi khuẩn hiếu khí trong mẫu thực phẩm có thể được xác định bằng

phương pháp nuôi cấy trải trên bề mặt thạch hoặc bằng phương pháp tạo hộp đổ Thông

qua số lượng khuẩn lạc đếm được trên các đĩa petri cho phép xác định được lượng vi sinh

vật sống còn khả năng sinh trưởng trong mẫu ban đầu Phương pháp định lượng này dựa

trên nguyên tắc: một vi sinh sống, trên môi trường dinh dưỡng, sau một khoảng thời gian

xác định sẽ phát triển và hình thành nên một khuẩn lạc

Tuy nhiên, để kết quả đếm chính xác nhất, số lượng khuẩn lạc trên đĩa petri phải

trong giới hạn nhất định Ví dụ, nếu lượng mẫu cấy vào đĩa là 1 ml thì số lượng khuẩn lạc

vi khuẩn trong đĩa phải trong giới hạn 25-250 khuẩn lạc, đối với nấm mốc là 30-50 khuẩn

lạc Nếu số lượng vượt quá giới hạn thì phải tiến hành pha loãng và chọn những độ pha

loãng lớn hơn

II D ỤNG CỤ, MÔI TRƯỜNG VÀ HÓA CHẤT

1 D ụng cụ

STT Tên d ụng cụ, thiết bị mỗi

nhóm (3 sinh viên) Đơn vị tính S ố lượng Ghi chú

1 Giá ống nghiệm Cái 1

STT Tên d ụng cụ, thiết bị mỗi

nhóm (3 sinh viên) Đơn vị tính S ố lượng Ghi chú

11 Nồi hấp cao áp Cái 1

12 Tủ cấy vô trùng Cái 1

14 Máy dập mẫu Cái 1

15 Bút đếm khuẩn lạc Cái 1

2 Môi tr ường và hoá chất

- Môi trường Plate count agar (PCA)

+ Casein peptone: 5,0 g + Cao nấm men: 2,5 g + Dextrose: 1,0 g + Agar: 15,0 g + Nước cất đủ 1000 ml Cân đầy đủ các thành phần môi trường, phối trộn, điều chỉnh pH = 7,0 ± 0,2 Nấu

sôi nhẹ cho tan agar Phân phối môi trường vào bình tam giác Hấp tiệt trùng ở 121o

C/20 phút, để ấm (45-50o

C) phân phối vào các đĩa petri

- Nước muối sinh lý 0,9%

- Tùy theo loại vật phẩm cần xác định mà ta lấy mẫu để nghiên cứu với số lượng và

khối lượng khác nhau cho phù hợp

ORIGINAL

- Quá trình lấy mẫu có những yêu cầu sau:

+ Lấy các mẫu có tính chất đại diện, lượng mẫu vừa đủ

+ Dụng cụ lấy mẫu, chứa mẫu phải vô trùng

+ Mẫu lấy xong, phải phân tích ngay, không được để quá 24 giờ

+ Mẫu lấy phải có nhãn ghi ký hiệu đồng thời phải ghi vào sổ những đặc điểm của mẫu và nơi thu mẫu

2 Pha loãng m ẫu

- Chuẩn bị một số bình tam giác chứa 90 ml nước muối sinh lý 0,9% hoặc nước peptone 1,0% vô trùng, một số ống nghiệm chứa 9 ml nước muối hoặc nước peptone vô trùng và một số pipette 1 ml vô trùng

* Với mẫu ở dạng lỏng

- Hút 1 ml mẫu nghiên cứu cho vào ống nghiệm có 9 ml nước muối sinh lý vô trùng Trộn đều dung dịch bằng cách hút lên, thổi xuống 3 - 5 lần Ta được độ pha loãng 1/10 hay 10-1

- Tiếp tục hút 1 ml ở ống nghiệm 1 cho vào ống nghiệm có 9 ml nước muối sinh lý

vô trùng thứ 2 Trộn đều dung dịch bằng cách hút lên, thổi xuống 3 - 5 lần Ta được độ pha loãng 1/100 hay 10-2

- Tiếp tục như vậy hút từ ống 2 sang ống 3, từ ống 3 sang ống 4 ta sẽ có được các

độ pha loãng tương ứng 10-3

* Với mẫu ở dạng đặc

Chuẩn bị hai bình tam giác có dung tích 250 ml:

- Bình 1 chứa 90 ml nước muối sinh lý hoặc nước peptone 1,0% vô trùng

- Bình 2 đã vô trùng và không chứa gì cả

- Cho một ít cồn vào cối chày sứ và đốt lên để khử trùng Để nguội

- Cân 10 g mẫu, cho vào cối chày sứ, nghiền nát mẫu hoặc đồng nhất mẫu trong túi

dập mẫu với máy dập mẫu

- Dùng toàn bộ nước ở bình 1 để chuyển mẫu sang bình 2 Lắc 5 phút

- Để lắng 30 giây rồi tiếp tục pha loãng như trong trường hợp mẫu ở trạng thái

lỏng

- Tùy theo sự ước đoán số lượng vi sinh vật trong mẫu mà pha loãng nhiều hay ít

- Sau khi có độ pha loãng thích hợp thì tiến hành xác định số lượng vi sinh vật

3 Xác định gián tiếp số lượng tế bào bằng cách đếm số lượng các khuẩn lạc mọc trên môi tr ường thạch (ISO 4833:1991)

C ấy theo phương pháp tạo hộp đổ

- Pha loãng dịch huyền phù ở các nồng độ khác nhau: 10-3

- Cho khoảng 15ml môi trường PCA ở nhiệt độ khoảng 45o

C vào hộp petri Xoay

chậm cho hỗn hợp trộn đều Để yên cho nguội Lật ngược cho vào tủ ấm Nuôi cấy ở 30o

C trong 72 giờ

- Mỗi mẫu cấy ba nồng độ Mỗi nồng độ cấy ba hộp petri

- Sau đó lấy ra kiểm tra kết quả

ORIGINAL

Hình 14.2 Quy trình t ạo hộp đổ

Ph ương pháp cấy bề mặt

- Dịch huyền phù được chuẩn bị tương tự như phương pháp tạo hộp đổ

- Môi trường PCA sau khi hấp tiệt trùng, được làm nguội đến khoảng 50-60o

C sau

đó đổ vào đĩa petri vô trùng

- Đĩa petri chứa môi trường được làm khô bề mặt bằng cách sấy trong tủ sấy ở nhiệt

độ 35o

C hoặc chuẩn bị trước 2 ngày

- Dùng pipet vô trùng hút chính xác 0,1 ml hoặc 0,3 ml nhỏ lên bề mặt môi trường trong đĩa petri

- Trải đều dung dịch vi sinh vật lên bề mặt môi trường bằng que trải tam giác thủy tinh

- Các đĩa petri được để ở nhiệt độ phòng 15-20 phút cho khô bề mặt Lật ngược cho vào tủ ấm Nuôi cấy ở 30o

C trong 72 giờ

- Mỗi mẫu cấy ba nồng độ Mỗi nồng độ cấy ba hộp petri

- Sau đó lấy ra kiểm tra kết quả

Đĩa petri vô

1 ml

L ắc đều đĩa petri

Để nguội Lật ngược đĩa

Hình 14.3 Ph ương pháp cấy trải bề mặt

c) Cách đếm

- Lấy bút chì kẻ hai đường vuông góc ở đáy hộp petri và đánh dấu thứ tự từng vùng

I, II, III, IV

- Đếm số lượng khuẩn lạc từng vùng Nhớ đánh dấu các khuẩn lạc đã đếm

- Số lượng tế bào trong một gram mẫu được tính theo công thức sau đây:

)

()//

ghayCFU CFU

N

++

ni : số hộp petri cấy tại độ pha loãng thứ I;

di: hệ số pha loãng tương ứng;

v: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa

Ví dụ: trong một trường hợp phân tích 1 g mẫu cụ thể nhận được kết quả sau:

66010

121013

3626198246

4

x x x

x

+

++++

ORIGINAL

- Vậy số lượng khuẩn lạc có trong 1 ml mẫu hoặc trong 1 gam mẫu (CFU/g hay CFU/ml) là 2.3x105

* Trong trường hợp số lượng khuẩn lạc có trong cả hai hộp petri nhỏ hơn 15 ta tính

như sau:

- Gọi m là lượng khuẩn lạc trung bình có trên hai hộp petri

- Lượng khuẩn lạc có trong mẫu lỏng là: NE = m/ml

- Nếu là mẫu đặc thì lượng khuẩn lạc có trong 1 gam mẫu sẽ là: NE = mxd-k

, với d

là hệ số pha loãng

* Trong trường hợp số lượng khuẩn lạc trong cả hai hộp petri nhỏ hơn 1 tính như sau:

- Lượng khuẩn lạc có trong mẫu lỏng là: NE nhỏ hơn 1/ml

- Nếu là mẫu đặc thì lượng khuẩn lạc có trong 1 gam mẫu sẽ là: NE nhỏ hơn 1xd-k

,

với d là hệ số pha loãng

Chú ý: Độ pha loãng thích hợp nhất nếu ở nồng độ này cấy trên thạch đĩa cho số khuẩn lạc trung bình từ 50 - 150 với vi khuẩn, xạ khuẩn; 30 - 50 với nấm

Bút đếm khuẩn lạc Bàn đếm khuẩn lạc Máy đếm khuẩn lạc tự động

Hình 14.4 Các lo ại dụng cụ đếm khuẩn lạc

IV NH ỮNG ĐIỂM CẦN LƯU Ý

- Khi tiến hành pha loãng mẫu, các dung dịch phải được hút đúng thể tích yêu cầu

- Đối với phương pháp tạo hộp đổ, môi trường nuôi cấy sau khi hấp tiệt trùng phải được làm nguội đến 45-50o

C bằng bể ổn nhiệt trước khi đổ vào đĩa petri chứa dung dịch vi sinh vật

- Các đĩa petri nuôi cấy vi sinh vật phải được lật úp trước khi nuôi ủ để tránh các khuẩn lạc ở bề mặt mọc loang

- Trong quá trình đếm khuẩn lạc, không được mở hộp petri

- Que trải thủy tinh dùng để trải dung dịch vi sinh vật được khử trùng bằng cách nhúng vào cồn 96o

rồi đốt, không được hơ trực tiếp trên ngọn lửa đèn cồn

ORIGINAL

- Tính số CFU/ml mẫu nước ban đầu

S Ơ ĐỒ KIỂM NGHIỆM TỔNG SỐ VI SINH VẬT HIẾU KHÍ

Tiêu chuẩn áp dụng: ISO 4833: 2003 Microbiology of food and animal feeding stuffs

Horizonrtal method for the enumeration of microorganisms Colony – count technique at

Pha loãng m ẫu

Pha loãng mẫu thành các nồng độ 10-1

,10-2,10-3

C ấy mẫu

Chọn ba nồng độ pha loãng thích hợp

Phương pháp đổ đĩa Phương pháp cấy trải

Cấy 1 ml mẫu vào đĩa petri vô trùng Cấy 0,1 ml mẫu vào môi trường thạch (mỗi nồng độ cấy hai đĩa), đổ vào mỗi PCA, dùng que cấy dàn đều mẫu đĩa 12-15 ml PCA đã làm nguội 44 -47o

Bài 15 ĐỊNH LƯỢNG COLIFORMS BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN

(MOST PROBABLE NUMBER)

I NGUYÊN T ẮC

Từ coliform được Blachstein sử dụng đầu tiên vào năm 1893 để nói về những vi

khuẩn bacilli có đặc điểm hình thái giống E coli Coliform là những trực khuẩn, Gram (-),

không sinh bào tử, hô hấp tùy tiện, có khả năng lên men lactose sinh acid và sinh hơi ở

37oC trong 24-48 giờ Nhóm coliforms hiện diện rộng rãi trong tự nhiên, trong ruột người, động vật Số lượng coliforms trong mẫu được dùng để chỉ thị khả năng có mặt của các vi sinh vật gây bệnh khác, chỉ thị cho mức độ an toàn vệ sinh của một môi trường hay một

sản phẩm Nhóm coliforms gồm bốn giống là: Escherichia với một loài duy nhất là E coli;

Citrobacter; Klebsiella và Enterobacter

Coliform chịu nhiệt là những coliform có khả năng lên men lactose sinh hơi khi ủ ở

44oC/24 giờ trong môi trường EC Coliform phân (Faecal Coliform hay E coli giả định) là

coliforms chịu nhiệt có khả năng sinh indole khi ủ ở 44.5o

C trong 24 giờ trong tryptone

E coli có mặt rất nhiều trong phân người và động vật Trong phân tươi, đậm độ của chúng có thể đến 109

/g Chúng được tìm thấy trong nước cống rãnh, trong các công đoạn

xử lý và trong tất cả các nguồn nước và đất vừa mới bị nhiễm phân từ người, động vật hoặc

do sản xuất nông nghiệp Gần đây người ta đã nghĩ đến E coli có thể tồn tại hoặc thậm chí

phát triển trong những nguồn nước ở vùng nhiệt đới không phải là đối tượng bị ô nhiễm phân Từ phân, coliform có thể xâm nhiễm trực tiếp vào thực phẩm trong các công đoạn

chế biến, canh tác hoặc phân phối

Hình 15.1 C ấu trúc nhóm coliforms

ORIGINAL

Nhóm coliform trong thực phẩm có thể được xác bằng phương pháp MPN

Phương pháp MPN (phương pháp có xác suất cao nhất, số tối khả) còn được gọi là

phương pháp pha loãng tới hạn hay phương pháp chuẩn độ Đây là phương pháp dùng để

đánh giá số lượng vi sinh vật theo số lượng vi sinh vật có xác suất lớn nhất có mặt trong

một đơn vị thể tích mẫu hay nói cách khác phương pháp MPN dựa trên nguyên tắc xác suất

thống kê sự phân bố vi sinh vật trong các độ pha loãng khác nhau của mẫu Đây là phương

pháp định lượng dựa trên kết quả định tính của một loạt thí nghiệm được lặp lại ở một số

độ pha loãng khác nhau Thông thường, việc định lượng này được thực hiện lặp lại ba lần ở

ba độ pha loãng bậc 10 liên tiếp, tổng cộng 9 ống nghiệm Các độ pha loãng được chọn lựa

sao cho trong các lần lặp lại có một số lần dương tính và có một số lần âm tính

Từ kết quả của các thí nghiệm định tính, dựa vào bảng Mac Crady để suy ra mật độ

ước đoán số lượng vi sinh vật có trong mẫu, được trình bày dưới dạng số MPN/100 ml hay

số MPN/g mẫu Độ chính xác của phương pháp MPN phụ thuộc vào số lượng ống nghiệm

lặp lại trong mỗi độ pha loãng: số lượng ống nghiệm lặp lại càng cao thì độ chính xác của

+ Sự tạo hơi: Coliform …

+ Sự đổi màu: S aureus

- Cho phép định lượng được mật độ vi sinh vật thấp trong thể tích mẫu lớn

II D ỤNG CỤ, MÔI TRƯỜNG VÀ HÓA CHẤT

1 D ụng cụ

STT Tên d ụng cụ, thiết bị mỗi

nhóm (3 sinh viên) Đơn vị tính S ố lượng

1 Giá ống nghiệm Cái 1

STT Tên d ụng cụ, thiết bị mỗi

nhóm (3 sinh viên) Đơn vị tính S ố lượng

D ụng cụ dùng chung

12 Nồi hấp cao áp Cái 1

13 Tủ cấy vô trùng Cái 1

Điều chế: Cân 40 g bột môi trường BGBL, bổ sung nước cất cho đủ 1000 ml,

khuấy đều Phân phối vào các dụng cụ chứa Đặt ống Durham vào môi trường Đem hấp

- Thịt tươi, mẫu nước thải

- Túi nilon dập mẫu

III TI ẾN HÀNH THÍ NGHIỆM

1 L ấy mẫu phân tích

- Mẫu thực phẩm từ các cơ sở chế biến được lấy theo tiêu chuẩn ISO: 5667 hoặc

TCVN 5994:1995

- Các dụng cụ chứa mẫu được bảo quản ở 4o

C trong thời gian ngắn (68 giờ) và ở

-20oC trong thời gian dài (không quá 36 giờ) Tránh ánh sáng trực tiếp

- Trước khi phân tích, các mẫu nước bảo quản lạnh đông phải được rã đông hoàn

toàn ở nhiệt độ phòng hoặc ở nhiệt độ 45o

C trong 15 phút

ORIGINAL

2 Chu ẩn bị mẫu phân tích

- Nếu là mẫu lỏng, lắc nhẹ bình mẫu, dùng pipette vô trùng, hút chính xác 10 ml dung dịch mẫu cho vào một bình tam giác có chứa sẵn 90 ml dung dịch nước muối sinh lý 0,9% hoặc nước muối peptone 1% Nếu là mẫu rắn, dùng đĩa cân, kẹp inox vô trùng cân chính xác 10 g mẫu cho vào một bình tam giác có chứa sẵn 90 ml dung dịch nước muối sinh lý 0,9% hoặc nước muối peptone 1%

- Lắc đều bình tam giác để hòa đều mẫu, ta được độ pha loãng 10-1

- Dùng micropipette với đầu tuýp vô trùng, hút cho vào các ống nghiệm (loạt 9 ống

hoặc 15 ống được phân thành ba nhóm cho ba nồng độ) có chứa môi trường thích hợp (ví dụ: BGBL dùng cho coliforms) cho sự tăng trưởng của đối tượng vi sinh vật cần định lượng một

thể tích chính xác (thường là 1ml) dung dịch mẫu ở ba nồng độ pha loãng liên tiếp

- Các ống nghiệm môi trường được ủ ở nhiệt độ và thời gian thích thích hợp (37o

C trong 24-36 giờ)

- Xác định số ống dương tính (có biểu hiện sinh hơi, đổi màu, đục…) ở các loạt ống thí nghiệm ở 3 nồng độ pha loãng tương ứng

3 Tính toán k ết quả

- Từ trị số của số ống có biểu hiện dương tính tương ứng ở ba nồng độ pha loãng liên

tiếp, tiến hành tra bảng MPN (Bảng tra Mac Crady) cho loạt 9 ống hoặc 15 ống, xác định

trị số MPN/100 ml của mẫu ban đầu

- Dựa vào độ pha loãng của các nồng độ chọn phân tích và thể tích mẫu pha loãng

cấy vào mỗi ống nghiệm môi trường BGBL, tính toán mật độ của coliforms có mặt trong

100 ml hoặc 100 g mẫu ban đầu Đối chiếu với TCVN, xác định chất lượng của mẫu thực

phẩm hoặc mẫu nước

IV NH ỮNG ĐIỂM CẦN LƯU Ý

- Các ống nghiệm chứa môi trường BGBL có ống Durham phải hấp tiệt trùng cẩn

thận đế tránh làm lẫn bọt khí vào ống Durham

- Trong trường hợp tất cả các ống nghiệm môi trường thử nghiệm đều dương tính

hoặc đều âm tính thì phải tăng hoặc giảm số lần pha loãng để trong loạt thí nghiệm phải có ống âm tính và ống dương tính

V BÁO CÁO TH ỰC TẬP

- Trình bày đặc điểm của nhóm vi khuẩn coliform Tác hại của chúng đối với con

người và đối với thực phẩm

- Trình bày nguyên tắc và phương pháp định lượng coliforms trong thực phẩm theo

phương pháp MPN

ORIGINAL

SƠ ĐỒ KIỂM NGHIỆM COLIFORM – E.COLI

M ẫu

Đồng nhất mẫu

Cân 10 g mẫu trong 90 ml nước peptone

Pha loãng m ẫu

Pha loãng mẫu thành các nồng độ 10-2

Tiêu chu ẩn sử dụng

- ISO 4831:1991 Microbiology – General guidance for the enumeration of coliforms –

Most probable number technique

- ISO 7251: 2005 Microbiology of food and animal feeding stuffs – Horizontal method

for the detection and anumerration of presumptive Escherichia coli – Most probable

number technique

- Water quality – Detection and enmeration of coliforms arganisms, thermotolerant

coliforms organisms and presumptive Escherichia coli – Part 2: multiple tube (most

probable number) method

- Water quality – Detection and enmeration of Escherichia coli and coliform bacteria

in surface and waste water – Part 3: Miniaturized method (most probable number)

by inoculation in liquid medium ORIGINAL

Bài 16 ĐỊNH LƯỢNG VI SINH BẰNG PHƯƠNG PHÁP

DÙNG PETRIFILM

I NGUYÊN T ẮC

Petrifilm là màng quét lên một lớp chất dinh dưỡng và tác nhân tạo gel Khi tiến hành

xét nghiệm, 1 ml mẫu được cấy vào petrifilm và ủ Chất màu đặc biệt trên đĩa khiến các

khuẩn lạc có màu đặc trưng dễ dàng phân biệt bằng mắt thường Các đường kẻ ô giúp cho

việc đếm số lượng khuẩn lạc dễ dàng hơn Các phương pháp petrifilm đã được thử nghiệm

và được AOAC công nhận

Đĩa petrifilm E coli/Coliform Count (EC) có chứa violet red bile (VRB) - chất gel

tan được trong nước lạnh, chất chỉ thị hoạt động của glucuronidase và một chất chỉ thị giúp

cho việc đếm khuẩn lạc dễ dàng hơn Hầu hết E coli (khoảng 97%) sinh

beta-glucuronidase, chất này tạo tủa màu xanh gắn kết với khuẩn lạc Tấm film phía trên giữ bọt

khí sinh ra từ quá trình lên men lactose của E coli và coliforms Khoảng 95% E coli có

sinh bọt khí, cho khuẩn lạc có màu từ xanh đến xanh – đỏ kèm theo bọt khí trên đĩa

petrifilm

AOAC International và U.S FDA Bacteriological Analytical Manual (BAM) xác định

coliform là trực khuẩn gram âm, hình que, sinh hơi và acid suốt quá trình lên men chuyển

hoá lactose Khuẩn lạc coliform phát triển trên đĩa petrifilm EC sinh acid, chất chỉ thị pH

trong đĩa làm cho lớp keo có màu đỏ Khí sinh ra được giữ lại xung quanh khuẩn lạc

coliform màu đỏ là dấu hiệu để xác định coliform

Trong bài thực hành này chúng ta sẽ tiến hành định lượng coliforms trong nước giải

khát ngoài đường phố (giới hạn cho nước giải khát không cồn không đóng chai đối với

coliforms chai 10 CFU/1g, theo QĐ 867/1988 của Bộ Y tế) bằng petrifilm và phương pháp

đổ đĩa truyền thống để so sánh

II D ỤNG CỤ, MÔI TRƯỜNG VÀ HÓA CHẤT

1 D ụng cụ

STT Tên d ụng cụ, thiết bị mỗi

nhóm (3 sinh viên) Đơn vị tính S ố lượng

1 Giá ống nghiệm Cái 1

STT Tên d ụng cụ, thiết bị mỗi

nhóm (3 sinh viên) Đơn vị tính S ố lượng

10 Nồi hấp cao áp Cái 1

11 Tủ cấy vô trùng Cái 1

13 Máy dập mẫu Cái 1

14 Bút đếm khuẩn lạc Cái 1

2 Môi tr ường và hóa chất

- Tấm petrifilm dùng phân tích coliform và Escherichia coli

- Nước muối sinh lý 0,9%

- Nước cất vô trùng

- Cồn 96o

3 Nguyên li ệu khác

- Thịt tươi

- Túi nilon dập mẫu

- Dịch vi khuẩn E coli kiểm chứng

III TI ẾN HÀNH THÍ NGHIỆM

1 Chu ẩn bị mẫu phân tích

- Dùng pipette vô trùng hút chính xác 10 ml dung dịch mẫu nước cần phân tích cho

vào một túi dập mẫu hoặc một bình tam giác vô trùng Đối với mẫu rắn cân chính xác 10 g

mẫu bằng cân phân tích trong điều kiện vô trùng

- Bổ sung thêm 90 ml dung dịch nước muối peptone 1% hoặc nước muối sinh lý vô trùng

- Lắc đều bình tam giác hoặc đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu trong 60 giây, 6-7

nhịp/giây, ta được độ pha loãng 10-1

ORIGINAL

Hình 16.1 Quy trình chu ẩn bị mẫu phân tích

- Tiến hành pha loãng mẫu: Dùng pipette vô trùng hút chính xác 1ml dung dịch mẫu

ở độ pha loãng 10-1

, tiến hành pha loãng tiếp thành các độ pha loãng 10-2

, 10-3, 10-4 trên các ống nghiệm đã chuẩn bị sẵn chứa 9 ml dung dịch nước muối peptone 1% vô trùng hoặc

nước muối sinh lý vô trùng

2 C ấy mẫu

- Tiến hành cấy mẫu quy trình đếm Coliforms bằng phương pháp đổ đĩa và ủ ở

37oC/2 ngày để làm mẫu đối chứng

- Cấy dịch kiểm chứng trên một đĩa Petrifilm theo quy trình như sau:

+ Đặt tấm petrifilm lên mặt bàn phẳng vô trùng

+ Dùng tay hoặc dùng kẹp inox lật màng film nilon phủ bề mặt đĩa petrifilm

+ Dùng pipette vô trùng hoặc micropipette với đầu tuýp vô trùng hút chính xác 1

ml dung dịch mẫu ở các độ pha loãng đã lựa chọn nhỏ lên giữa màng môi trường trên đĩa petrifilm

+ Lật cuộn màng nilon trở lại cẩn thận để tránh tạo bọt khí, không được để tấm màng film nilon rơi xuống

+ Dùng tấm nhựa chặn có mặt phẳng ở bên dưới dàn mỏng giọt dung dịch đều khắp màng môi trường trong vùng cấy Dùng một lực nhẹ ấn lên tấm nhựa chặn trải đều mẫu lên vùng cấy trước khi lớp gel hình thành Tránh xoay hay trượt tấm nhựa chặn mẫu

+ Lấy tấm nhựa chặn ra để lớp keo đông lại

- Tấm petrifilm được nuôi ủ ở nhiệt độ 35-37o

C trong thời gian 18-24 giờ Các tấm petrifilm có thể chồng lên đến 20 đĩa

- Đếm số lượng khuẩn lạc đặc trưng của coliforms và tính kết quả theo phương pháp

đếm khuẩn lạc trực tiếp bằng mắt hay bằng máy đếm khuẩn lạc Khuẩn lạc E coli có màu

xanh và sinh khí; khuẩn lạc Coliforms có màu đỏ và sinh khí

ORIGINAL

Coliform

E coli

Không phải coliform

Hình 16.2 Quy trình c ấy mẫu vào đĩa petrifilm và cách nh ận diện khuẩn lạc coliforms (màu h ồng), E coli (màu tím xanh) trên đĩa petrifilm

ORIGINAL

4 Nh ững điểm cần lưu ý

- Không sử dụng đĩa này riêng rẽ để phát hiện E coli O157 Như hầu hết những môi

trường kiểm tra E coli/coliform khác, đĩa này sẽ không hiển thị đặc biệt với bất kì dòng

O157 nào có mặt

- Thao tác cấy mẫu vào đĩa petrifilm phải cẩn thận tránh làm lẫn bọt khí vào lớp gel

- Các tấm petrifilm có thể dùng để phân lập định danh vi sinh vật

- Sau khi đếm kết quả, các tấm petrifilm phải được hấp tiệt trùng ở nhiệt độ 121o

C trong 30 phút trước khi loại bỏ

V BÁO CÁO TH ỰC HÀNH

- Trình bày nguyên tắc định lượng coliforms bằng phương pháp dùng petrifilm

- Trình bày phương pháp định lượng coliforms bằng phương pháp dùng petrifilm

- Giải thích sự hình thành màu và bọt khí của khuẩn lạc coliforms trên đĩa petrifilm

- Tính mật độ coliforms có trong mẫu ban đầu, đơn vị CFU/ml ORIGINAL

Bài 17

ỨNG DỤNG VI SINH VẬT TRONG SẢN XUẤT THỰC

I NGUYÊN T ẮC

Tương là loại nước chấm giàu đạm được chế biến với nguyên liệu gạo nếp hoặc

ngô đồ lên và ủ mốc để làm men chuyển hóa protein từ hạt đậu nành Tương được sử dụng

hàng ngày rất lợi cho sức khỏe, đặc biệt phù hợp trong các món ăn chay

Trong quá trình làm tương, protein khó tiêu trong hạt đậu tương được hỗn hợp

enzyme protease và peptidase tiết ra bởi các chủng mốc tương (thường nhất là Aspergillus

oryzae) phân giải thành các peptid và acid amin dễ tiêu Dịch acid amin có thể được chiết

một phần để làm nước tương Phần bã đậu qua quá trình ngâm ủ có thể được sử dụng để

làm tương hột

II D ỤNG CỤ, MÔI TRƯỜNG VÀ HÓA CHẤT

1 D ụng cụ

STT Tên d ụng cụ, thiết bị mỗi

nhóm (3 sinh viên) Đơn vị tính S ố lượng

1 Đĩa petri Cái 2

5 Nồi inox Cái 1

6 Chảo inox Cái 1

8 Lọ thủy tinh có nắp đậy Cái 1

D ụng cụ dùng chung

9 Nồi hấp cao áp Cái 1

10 Tủ cấy vô trùng Cái 1

C trong thời gian 40-60 phút

- Để nguội cơm và cấy bào tử mốc tương Aspergillus oryzae vào

- Ủ đĩa petri ở nhiệt độ phòng

- Sau 36-48 giờ, quan sát thấy mốc mọc kín hạt cơm (hạt cơm có màu vàng hoa cau) là có thể sử dụng được

2 S ơ chế nguyên liệu

- 100 g hạt đậu nành sau khi lựa chọn, loại bỏ hạt lép và sâu mọt, đem rang vàng và

bỏ vào nồi nấu cùng với nước (khoảng 100 g đậu với 300 ml nước), nấu chín trong 3 - 4

giờ

- Vớt hạt đậu nành ra rổ, trải mỏng, để nguội Phần nước nấu đậu được bổ sung

muối đến nồng độ 15% trữ lại sử dụng trong giai đoạn sau

- 20 g bột mì hoặc bột gao rang vàng và trộn đều vào đậu để tạo lớp áo bột, tạo điều

kiện cho mốc phát triển thuận lợi

3 Giai đoạn ủ mốc

- Trộn 10 g mốc giống vào 100 g đậu đã được chuẩn bị ở trên

- Hỗn hợp đậu mốc được đặt trong rổ nhựa, để nơi thoáng mát, bề mặt được phủ

giấy báo để tránh ruồi nhặng

- Mỗi ngày, dùng muỗng đảo đều giúp mốc phát triển thuận lợi

- Sau 3-4 ngày, khi mốc phát triển kín hạt đậu, có thể dừng quá trình ủ mốc lại Khi

mốc phát triển đều khắp và chằng chịt là lúc các enzyme do nấm mốc sản xuất đang tiến hành phân giải protein trong hạt đậu thành các axit amin tự do, tinh bột thành đường

ORIGINAL

- Quá trình ủ mốc phải đảm bảo nhiệt độ và ẩm độ thích hợp cho mốc phát triển

Loại mốc Aspergilluss oryzae, có nhiệt độ phát triển là 30-32o

C, ẩm độ 80-90%

4 Giai đoạn hãm mốc và ngả tương

- Toàn bộ đậu sau khi ủ mốc được cho vào một lọ thủy tinh

- Dung dịch nước nấu đậu bổ sung muối đến 15% đã chuẩn bị ở trên, được đổ vào bình cho ngập đậu Dùng giấy báo đậy kín để tránh ruồi nhặng

- Đem phơi nắng bình thủy tinh trong thời gian 15-20 ngày Trong thời gian phơi

phải theo dõi thường xuyên để tránh mưa và đậy kín vào ban đêm Định kỳ 3-4 ngày, dùng đũa đảo đều lọ tương

- Sau thời gian này, gạn nước cốt để riêng, được nước tương loại 1 Sau đó, bổ sung

nước muối 8%, tiếp tục đem phơi nắng lọ tương trong thời gian 7-10 ngày Sau thời gian này, hạt đậu sẽ có màu vàng nâu đẹp, hương đậm đà

- Sau 7 ngày, gạn nước cốt lần 2, được nước tương loại 2 Trộn nước cốt này với

nước cốt lần 1

- Bổ sung 60 g đường mía vàng vào 100 g bã đậu Đem nấu sôi, sẽ được tương hột

- Phần hỗn hợp nước cốt được bổ sung 20 g đường mía vàng, nấu sôi sẽ được nước

tương Nếu màu chưa đẹp thì có thể bổ sung nước màu dừa

IV NH ỮNG ĐIỂM CẦN LƯU Ý

- Khi ngả tương (phơi tương) phải đậy kỹ tránh để ruồi muỗi và nước mưa rơi vào hũ

- Trình bày vai trò của nấm mốc Aspergillus oryzae trong quá trình làm tương

- Trình bày sự biến đổi của thành phần hạt đậu tương trong quá trình làm tương

- Trình bày tác động của nước muối 15% ở gian đoạn hãm mốc

ORIGINAL

Bài 18 ỨNG DỤNG VI SINH VẬT TRONG SẢN XUẤT THỰC

I NGUYÊN T ẮC

Sản xuất rượu vang dựa trên cơ sở về hóa sinh xảy ra trong quá trình lên men các

loại nước quả dưới tác dụng của enzyme của nấm men Dưới tác dụng hệ thống enzyme

của nấm men, đường được chuyển hóa thành rượu ethanol và CO2 cùng lúc sản sinh ra

năng lượng Quá trình này gọi là quá trình lên men ethanol Phản ứng cần sự có mặt của

phosphat vô cơ:

C6H12O6 + H3PO4→ CH3CH2OH + H2O + CO2 + FDP

Hầu hết các giống Saccharomyces (tác nhân chính trong lên men rượu vang) đều

lên men đường: glucose, galactose, saccharose, maltose, manose và không lên men lactose

Các loại đường trên có mặt trong trái cây chín (nho, mận, dâu, dứa, mơ ) với nồng độ

khác nhau Do đó, trái cây chín là nguyên liệu quan trọng trong quá trình lên men rượu để

sản xuất những thức uống có giá trị: rượu vang, nước trái cây lên men

Trong quá trình lên men, đường trong dịch quả được nấm men sử dụng để tăng sinh

khối và tổng hợp một số sản phẩm (rượu, khí CO2 và glycerin, acid acetic, acid lactic, este

etylacetat) Các alcol bậc cao, aldehyd acetic được tạo thành từ các acid amin Các chất

pectin bị thủy phân kéo theo sự tạo thành một lượng nhỏ metanol

Lên men rượu vang thường chia thành các giai đoạn: lên men chính ở nhiệt độ từ

20 – 30oC khoảng 7 ngày hoặc dài hơn Ở cuối giai đoạn lên men chính, dịch lên men trong

dần vì protein và pectin lắng xuống Lên men phụ ở nhiệt độ từ 15 - 18o

C Khi lắng cặn hoàn toàn, dịch trong thì gạn, lọc xong sẽ được rượu vang có thể uống được, nhưng chưa

ngon, cần phải tàng trữ để rượu vang hoàn thiện hương vị đặc trưng Thời gian tàng trữ có

thể là vài tháng, vài năm, thậm chí hàng chục hoặc hàng trăm năm

Do thời lượng của bài thí nghiệm, quá trình lên men rượu vang chỉ thực hiện ở hai

giai đoạn cơ bản là lên men chính và lên men phụ

II D ỤNG CỤ, MÔI TRƯỜNG VÀ HÓA CHẤT

1 D ụng cụ

STT Tên d ụng cụ, thiết bị mỗi

nhóm (3 sinh viên) Đơn vị tính S ố lượng

1 Đĩa petri Cái 2

ORIGINAL

4 Rổ nhựa Cái 1

6 Lọ thủy tinh có nắp đậy Cái 1

D ụng cụ dùng chung

7 Nồi hấp cao áp Cái 1

8 Tủ cấy vô trùng Cái 1

Thí nghiệm được thực hiện với hai nghiệm thức:

- Nghiệm thức 1: lên men với nguồn vi sinh vật sẵn có trên nguyên liệu nho

- Nghiệm thức 2: lên men với sự bổ sung chủng nấm men thuần: Saccharomyces

cerevisiae

1 Chu ẩn bị nguyên liệu

- Cân 3 kg nho đỏ chín

- Loại bỏ cuống, đánh nát nho

- Cho tất cả nước nho vào lọ thủy tinh

- Bổ sung thêm NaHSO3 với hàm lượng 100mg/lít có tác dụng chống oxy hóa dịch

nho, loại bỏ các vi sinh vật có hại

- Kiểm tra độ Brix, pH, hàm lượng acid tổng của dịch lên men Dịch lên men có

đặc điểm: pH 2,8-3,6, độ Brix từ 21,1-25,5 Nếu chưa đạt được điều kiện này, cần điều

chỉnh để quá trình lên men đạt hiệu quả tốt nhất Sử dụng đường saccharose để điều chỉnh

độ Brix Sử dụng acid tartaric để điều chỉnh pH:

+ Nếu hàm lượng acid tổng khoảng 3g/lít, bổ sung 0,5 g acid tartaric

+ Nếu hàm lượng acid tổng nhỏ hơn 3g/lít, bổ sung 1,0 g acid tartaric

ORIGINAL

+ Nếu hàm lượng acid tổng ≥ 10g/lít, có thể dùng CaCO3điều chỉnh để làm

giảm độ acid xuống

- Đậy kín nắp bình để tiến hành lên men

- Đối với nghiệm thức có bổ sung nấm men, dịch nấm men được bổ sung với hàm

lượng khoảng 106

CFU/ml

2 Lên men chính

- Trong 1-2 ngày đầu của quá trình lên men, tiến hành sục khí vào dịch nho, đảm

bảo oxy cần thiết cho nấm men hoạt động Sau thời gian này, tạo điều kiện kị khí cho bình lên men để thực hiện lên men

- Bình lên men được đặt ở nhiệt độ 25o

C trong thời gian 7 ngày Trong giai đoạn lên men chính, đường trong dịch quả sẽ được chuyển hóa thành rượu Nồng độ rượu đạt khoảng 8-10%

- Sau thời gian này, toàn bộ hỗn hợp rượu và bã nho trong bình lên men được ép để

loại bỏ bã nho

- Dịch rượu thu được, rót trở lại vào bình lên men, đậy kính bình để tiến hành lên men phụ

3 Lên men ph ụ

- Bình lên men được đặt trong tủ mát ở nhiệt độ 18-25o

C trong thời gian 25-30 ngày

- Trong thời gian này, nấm men và cặn nguyên liệu sẽ lắng dần xuống Dịch rượu

sẽ dần trong hơn Trong giai đoạn lên men phụ, quá trình lên men malolactic xảy ra sẽ chuyển hóa acid malic làm rượu có vị dịu hơn

- Tiến hành gạn dịch rượu, và lọc để thu được rượu vang trong hơn

Rượu vang sau giai đoạn lên men phụ có mùi thơm đặc trưng, vị nồng nhẹ của

rượu, vị hơi chua ngọt của dịch trái cây còn sót lại Rượu này có thể uống được Để ngon

hơn, dịch rượu cần được ủ (tàng trữ) ở nhiệt độ thấp 13-15o

C trong thời gian lâu hơn (tối thiểu là một năm với vang đỏ và sáu tháng với vang trắng)

IV NH ỮNG ĐIỂM CẦN LƯU Ý

- Khi chọn nho dùng cho lên men, cần loại bỏ các quả bị dập nát hoặc bị lên men để tránh nhiễm tạp các vi sinh vật có hại

- Trong quá trình lên men, bình lên men cần được đậy kín để tạo điều kiện kị khí cho quá trình lên men Tuy nhiên, do có sự sinh ra của CO2 trong suốt quá trình lên men, vì

vậy cần làm airlock để thoát khí

- Trong quá trình tách chiết dịch rượu, tránh dùng các vật liệu bằng sắt, nhôm để tránh làm tủa rượu

- Không được làm dập nát hạt nho để tránh giải phóng tanin làm giảm chất lượng rượu

V BÁO CÁO TH ỰC TẬP

- Trình bày cơ chế của quá trình lên men rượu

- Trình bày các quá trình sinh hóa xảy ra trong giai đoạn lên men chính và lên men phụ

- Nêu những yêu cầu về chất lượng của rượu vang nho

ORIGINAL

Bài 19

I NGUYÊN T ẮC

Escherichia coli lần đầu tiên được Escherich phân lập từ phân người vào năm 1855

Đây là vi khuẩn được chú ý nhiều và nghiên cứu kỹ lưỡng nhất Chúng cư trú ở đường ruột

của người và động vật máu nóng Chúng có thể là vi khuẩn gây bệnh cơ hội E coli là vi

sinh vật chỉ thị tiêu biểu nhất Sự có mặt cũng như số lượng của chúng chỉ ra mức độ vệ

sinh trong quá trình chế biến, bảo quản, vận chuyển thực phẩm, nước uống cũng như sự ô

nhiễm phân trong môi trường Từ năm 1982 đã phát hiện thấy bốn loài E coli có khả năng

gây bệnh có nguồn gốc thực phẩm (Enteropathogenic-EPEC; Enteroinvasive-EIEC;

Enteroinvasive- EIEC; Enterotoxigenic - ETEC, trong đó có chủng O157:H7)

Phương pháp phân tích E coli trong bài này được dựa trên quy trình MPN bằng sử

dụng canh thang Lauryl sulphate tryptose (LST) vào test đoán chừng (presumptive test),

sau đó dùng canh thang BGLB (Brilliant Green Lactose Bile Broth) và ủ ấm ở 37o

C/24-48

giờ (để kiểm tra coliforms) Tiếp theo chuyển sang môi trường canh EC (E coli medium) ủ

ở 44.5o

C để kiểm tra coliforms chịu nhiệt Sau đó xác định coliforms phân (E coli giả

định) bằng cách cấy sang môi trường EMB (Eosine Methylene Blue Agar), chọn khuẩn lạc

điển hình và thử khả năng sinh Indol (I) Để xác định E coli, cần thử ba phản ứng sinh hóa

tiếp theo là Methyl Red (MR), Voges-Proskeur (VP) và Citrate (iC) E coli là coliforms

phân và cho kết quả thử nghiệm IMViC là + + - -

II D ỤNG CỤ, MÔI TRƯỜNG VÀ HÓA CHẤT

1 D ụng cụ

STT Tên d ụng cụ, thiết bị mỗi

nhóm (3 sinh viên) Đơn vị tính S ố lượng Ghi chú

1 Giá ống nghiệm Cái 1

STT Tên d ụng cụ, thiết bị mỗi

nhóm (3 sinh viên) Đơn vị tính S ố lượng Ghi chú

12 Tủ cấy vô trùng Cái 1

- Môi trường EC broth

- Môi trường EMB

- Môi trường triptose broth

- Môi trường MR-VP

- Môi trường Simmon citrate

- Nước muối sinh lý 0,9%

- Cồn 96o

3 Nguyên li ệu khác

- Thịt tươi

- Túi nilon dập mẫu

- Dịch vi khuẩn Escherichia coli kiểm chứng

III TI ẾN HÀNH THÍ NGHIỆM

1 Chu ẩn bị mẫu phân tích

- Dùng pipette vô trùng hút chính xác 10 ml dung dịch mẫu nước cần phân tích cho

vào một túi dập mẫu hoặc một bình tam giác vô trùng Đối với mẫu rắn cân chính xác 10 g

mẫu bằng cân phân tích trong điều kiện vô trùng

- Bổ sung thêm 90 ml dung dịch nước muối peptone 1% hoặc nước muối sinh lý vô trùng

- Lắc đều bình tam giác hoặc đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu trong 60 giây, 6-7

nhịp /giây, ta được độ pha loãng 10-1

Hình 19.1 Quy trình chu ẩn bị mẫu phân tích

- Tiến hành pha loãng mẫu: Dùng pipette vô trùng hút chính xác 1ml dung dịch mẫu

ở độ pha loãng 10-1

, tiến hành pha loãng tiếp thành các độ pha loãng 10-2

, 10-3, 10-4 trên các ống nghiệm đã chuẩn bị sẵn chứa 9 ml dung dịch nước muối peptone 1% vô trùng hoặc

nước muối sinh lý vô trùng

ORIGINAL

2 Nuơi cấy Escherichia coli

- E coli là dạng coliform cĩ nguồn gốc từ phân, phát triển được ở 44 ± 0,5o

C, sinh indol, sinh acid, khơng sinh aceton và khơng dùng citrat làm nguồn cacbon

- E coli được phát hiện do khả năng lên men lactose sinh hơi ở 44 ± 0,5o

C và cĩ

kết quả nghiệm pháp IMVIC phù hợp

- Qui trình phân tích định lượng E coli theo phương pháp MPN thực hiện như sau:

Lấy 10g (10ml) mẫu đồng nhất vào 90 ml nước muối sinh lý, được 10 -1

Pha loãng mẫu 10 -2 , 10 -3 , 10 -4 …

Chuyển 1ml dung dịch 10 -2 , 10 -3 , 10 -4 vào 10 ml canh BGBL, mỗi nồng độ 3 ống lặp lại,

ủ 37 o C, 36 gi ờ Chọn ống (+), cấy sang canh EC, ủ 44.0 ± 0.5 o C trong 24-48 giờ

Ủ ở 37.0 ± 0.5 o C trong 24 giờ

Chọn khuẩn lạc dẹt, có ánh kim tím, đường kính khoảng 1mm để cấy sang TSA

Ủ ở 37.0 ± 0.5 o C qua đêm

Cấy chuyển vào các môi trường thử nghiệm sinh hoá: Canh trypton (1), MRVP (2), Simmon Citrate (1) để thử nghiệm pháp IMViC

Kết luận: Phát hiện (không phát hiện) E.coli/g

E coli có biểu hiện sinh hoá: Indol (+), MR (+), VP (-), Citrate (-) Một trong số các

phản ứng trên sai là không phải E.coli

Xác định ống (+) ở mỗi nồng độ, cấy sinh khối vi sinh vật từ các ống (+) sang đĩa mơi

trường EMB hoặc Endo để phân lập E coli

ORIGINAL

a Môi tr ường nuôi cấy

Môi trường tăng sinh: môi trường BGBL 2% hoặc Lauryl sulphat tryptose

* Môi trường BGBL 2% (Brilliant Green Bile Lactose 2%)

Hòa tan peptone và lactose trong 500 ml nước cất Hòa 20 g mật bò trong 200 ml

nước cất, trộn hai dung dịch, thêm nước cất tới 975 ml Chỉnh về pH 7,4 ở 25o

C Cho thêm 13,3 ml dung dịch Brilliant Green 0,1% trong nước cất Thêm nước cất cho đủ 1000 ml Rót vào các ống nghiệm cỡ 16mm có ống Durham, hấp thanh trùng ở 1210

- Lấy 1 ml ở 3 độ pha loãng cuối cấy vào các ống nghiệm chứa 10 ml môi trường

tăng sinh BGBL hoặc LSB Để ở 37 ± 0,5o

C trong 24-48 giờ

- Tiến hành ba ống nghiệm mỗi nồng độ pha loãng

- Chọn các ống dương tính (ống có biểu hiện sinh hơi, đổi màu, hóa đục), cấy chuyền sang các ống môi trường canh EC Ủ ở 44 ± 0,5o

C Ghi chú nồng độ tương ứng cho các ống canh EC ứng với các ống BGBL hoặc LSB dương tính

2 Phân lập Escherichia coli

* Môi trường EMB (Eosine Methylen Blue agar)

Đun để hòa tan các thành phần trên trong nước cất Hấp thanh trùng ở 121o

C trong

15 phút Điều chỉnh pH là: 7,4 ở 25o

C

b) Hóa chất, môi trường thử phản ứng sinh hóa

Môi tr ường MRVP (Metyl Red Voges Prokauer)

C không quá một tháng

Thu ốc thử Kovac

- Được sử dụng để thử phản ứng indol

ORIGINAL

- Hòa 5 g p-dimetylaminobenzaldehyd vào 75 ml amyl alcohol, đun nhẹ ở 50 ÷

55oC đến tan hết, để nguội và cho thêm 25 ml H2SO4đậm đặc

c Phương pháp tiến hành

Phân l ập

- Xác định số ống môi trường canh EC dương tính (ống có biểu hiện hóa đục, sinh

hơi) Chọn các ống nghiệm có phản ứng dương tính để cấy sang môi trường phân lập (môi

trường EMB hoặc Endo), để ở 37o

C trong 24 giờ

- Nhân dạng khuẩn lạc E coli:

+ Trên môi trường EMB: khuẩn lạc màu tím, ánh kim, tròn, bờ đều, đường kính khoảng 0,5 mm

+ Trên môi trường Endo: khuẩn lạc màu đỏ, ánh kim, tròn, bờ đều, đường kính khoảng 0,5 mm

Hình 19.1 Khu ẩn lạc đặc trưng của Escherichia coli trên môi trường EMB

Th ử phản ứng sinh hóa

- Tiến hành thử phản ứng sinh hóa các khuẩn lạc nghi ngờ là E coli

- Phản ứng Indol: Cấy khuẩn lạc nghi ngờ vào ống nghiệm chứa 5 ml nước peptone

- Phản ứng MR (metyl red): cấy khuẩn lạc nghi ngờ vào hai ống nghiệm, mỗi ống

chứa 5ml môi trường MRVP để ở 37o

C từ 48-96 giờ Cho vào một ống nghiệm vài giọt metyl red ở pH trung tính hoặc kiềm yếu

+ Môi trường chuyển màu đỏ: MR (+)

ORIGINAL

+ Môi trường không đổi màu: MR (-)

- Phản ứng VP (Voges Proskauer) cho vào ống nghiệm chứa môi trường MR-VP còn

lại khoảng 0,6 ml dung dịch α- naphtol và 0,2 ml dung dịch KOH lắc đều, để yên trong 2 giờ

+ Môi trường đổi sang màu đỏ eosin hoặc có vệt đỏ eosin phát triển trong vòng 15 phút : VP (+)

+ Môi trường không chuyển màu đỏ: VP (-)

- Phản ứng citrat: Cấy ria khuẩn lạc nghi ngờ lên mặt nghiêng của môi trường Simmon citrat, để ở 37o

- Môi trường EC: hóa đục, và sinh hơi

- Có khuẩn lạc điển hình trên môi trường EMB hoặc Endo

- Trực khuẩn Gram âm

- Các phản ứng sinh hóa: I (+); MR (+); V(-) ; Citrat (-)

3 Xác định kết quả

- Ống nghiệm cho kết quả (+) trong môi trường canh EC và khuẩn lạc E coli giả

định trên môi trường EMB hoặc Endo cho kết quả thử nghiệm IMViC như trên là ống nghiệm có E coli Thực hiện tương tự cho tất cả các ống nghiệm cho kết quả (+) trong môi

trường EC và tạo được khuẩn lạc E coli giả định trên môi trường EMB hoặc Endo Ghi

nhận số lượng các ống nghiệm có E coli (+) ở mỗi độ pha loãng

- Dùng bảng tra MPN để xác định mật độ vi sinh vật trong mẫu và biểu diễn dưới

dạng chỉ số MPN/g hay MPN/ml mẫu ban đầu chưa pha loãng

Hình 19.2 K ết quả thử nghiệm IMViC (+ + - -) xác định E coli

ORIGINAL

IV NH ỮNG ĐIỂM CẦN LƯU Ý

- Tiến hành nhuộm Gram vi sinh vật phân tích ở tất cả các bước thí nghiệm

- Các ống nghiệm môi trường tăng sinh chứa một lượng lớn vi sinh vật gây bệnh, tránh không làm rơi đổ ra môi trường

- Các thử nghiệm sinh hóa được nhận định kết quả bằng các thuốc thử Cần sử dụng đúng thuốc thử cho từng thử nghiệm

- Thuốc thử Methyl red được pha trong cồn 96o

, cần chú ý tránh không được để gần

lửa đèn cồn

V BÁO CÁO TH ỰC TẬP

- Trình bày đặc điểm của vi khuẩn E Coli

- Trình bày quy trình phân tích định lượng E coli trong thực phẩm theo phương pháp

MPN

- Giải thích cơ chế của các thử nghiệm sinh hóa để xác định E Coli

- Xác định mật độ MPN/ml của E coli trong mẫu thực phẩm ban đầu

ORIGINAL

Bài 20

I NGUYÊN T ẮC

Salmonella là vi khu ẩn thuộc họ Enterobacteriaceae, có hình que, Gram âm,

không sinh bào tử, sống hiếu khí tùy nghi nhưng phát triển tốt trong điều kiện hiếu khí

Hầu hết chúng có khả năng di động nhờ tiên mao và có khả năng tạo H2S (trừ S typhi)

Mặt khác, có khả năng lên men sinh acid từ glucose, mannitol, không lên men lactose,

sucrose, không tạo Indol; có khả năng tạo enzyme lysine decarboxylase Chúng có mặt

trong nhiều loại thực phẩm Đây là nhóm đối tượng vi sinh vật nguy hại, có thể gây ngộ

độc với mật độ thấp (khoảng 1 triệu tế bào/g) Trong hầu hết các loại thực phẩm, chỉ tiêu

Salmonella luôn bằng 0 (không được phép phát hiện trong thực phẩm)

Quá trình phân tích Salmonella thường bao gồm bốn bước: tăng sinh, tăng sinh chọn

lọc, phân lập và khẳng định Bước tăng sinh chọn lọc thường dùng các loại môi trường

chuyên biệt tùy vào nguồn mẫu thu nhận được Bước khẳng định nhằm xác nhận các khuẩn

lạc đặc trưng cho Salmonella xuất hiện trên môi trường phân lập Bước này dựa trên việc sử

dụng các thử nghiệm sinh hóa và thử nghiệm huyết thanh đặc trưng cho Salmonella

II D ỤNG CỤ, MÔI TRƯỜNG VÀ HÓA CHẤT

1 D ụng cụ

STT Tên d ụng cụ, thiết bị mỗi

nhóm (3 sinh viên) Đơn vị tính S ố lượng

1 Giá ống nghiệm Cái 1

10 Nồi hấp cao áp Cái 1

11 Tủ cấy vô trùng Cái 1

2 Môi tr ường và hóa chất

- Dung dịch BPW

- Môi trường SCB

- Môi trường XLD

- Môi trường KIA

- Nước muối sinh lý 0,9%

- Túi nilon dập mẫu

- Dịch vi khuẩn Salmonella kiểm chứng

III TI ẾN HÀNH THÍ NGHIỆM

1 Ti ền tăng sinh và tăng sinh chọn lọc

- Thực hiện đồng nhất 25 g mẫu thực phẩm vào trong 225 ml dịch BPW Ủ ở 37o

C trong 16-24 giờ

- Sau thời gian ủ, tiến hành cấy chuyền 0,1 ml dịch vi sinh vật được tiền tăng sinh sang môi trường tăng sinh chọn lọc là SCB hoặc RV (nên dùng cả hai loại môi trường đồng thời) Ủ ở 37o

C trong 24 giờ

- Các ống dương, nghi ngờ có mặt Salmonella, khi môi trường có màu đỏ gạch, có

cặn lắng, có thể có váng

2 Phân lập Salmonella

Phân lập Salmonella trên một trong các môi trường sau:

* Môi trường SS Agar (Salmonella - Shigella agar)

Đun sôi môi trường, không hấp, để nguội đến 50o

C rồi đổ đĩa, không giữ quá 1 ngày

b) Cách ti ến hành

Quan sát mẫu cấy trong môi trường tăng sinh Sau 24 giờ Salmonella làm đục đều

môi trường Selenite Broth, có thể hơi lắng cặn và tạo váng mỏng, màu môi trường chuyển

từ trong suốt ban đầu sang màu đỏ gạch Làm biến màu môi trường Muller - Kauffmann từ xanh lục sang vàng

Phân l ập

- Dùng que cấy vòng cấy ria canh trường từ môi trường tăng sinh lên đĩa petri chứa môi trường phân lập KIA và HE Cần cấy thưa để tạo khuẩn lạc riêng biệt Để ở 37o

C trong

24 giờ Trên các môi trường phân lập, Salmonella tạo các khuẩn lạc tròn, hơi lồi trong, bờ

đều có đường kính khoảng 2-4 mm, đôi khi có tâm đen

- Nhuộm Gram các khuẩn lạc nghi ngờ Thử phản ứng sinh hóa nếu Gram (-)

Hình 20.1 Khu ẩn lạc của

Salmonella trên môi tr ường Hình 20.2 Khu Salmonella trên môi tr ẩn lạc của ường HE

ORIGINAL

3 Thử phản ứng sinh hóa xác định Salmonella

a) Môi trường và hóa chất thử phản ứng sinh hóa

* Môi trường KIA (Kligler's Iron Agar)

- Nước cất đủ : 1000 ml

Cách pha: Đun sôi để hòa tan hoàn toàn thành phần trên trong nước cất, để nguội đến

45oC trong nồi cách thủy, chỉnh pH là 7,3 ở 25o

C Rót vào các ống nghiệm để làm thạch nghiêng một lượng sao cho khi môi trường đông lại thì thể tích phần đáy gấp đôi phần nghiêng

* Môi trường MIU (Motility Indol Urea Medium)

trường Rót vào ống nghiệm có dung tích phù hợp từng lượng 5 ml và để thẳng đứng

Dung dịch ure được pha bằng nước cất và khử trùng bằng lọc khuẩn

* Môi trường Lysine Decacboxylase broth (LDC)

b) Ti ến hành

- Cấy đâm sâu rồi cấy ria vi khuẩn từ những khuẩn lạc nghi ngờ lên ống thạch nghiêng chứa môi trường TSI hoặc KIA Cấy đâm sâu vào môi trường MIU Cấy sinh khối vào môi trường LDC, Manitol phenol red broth, MR-VP Các ống nghiệm được ủ ở 37o

C trong 24 giờ

- Trên môi trường TSI hoặc KIA các khuẩn lạc Salmonella có màu đen: dihydrosunfu (+), giữ nguyên màu đỏ của phần nghiêng: lactose (-), saccharose (-); phần đáy đổi màu từ đỏ sang vàng: dextrose hoặc glucose (+), tạo những bọt khí trong nền

thạch, có sinh hơi

ORIGINAL