* Các bước tiến hành: - chuẩn bị kháng nguyên nghi: lấy 1 mẩu da tai, hoặc mẩu xương, đôi khi có thể lấy 1 chút lách của con vật đã chết lâu ngày vì trong cấu trúc của VK NT, để tránh bị[r]
Trang 11
CONTENTS Bài 1: Pasteurella multocida - Staphylococcus aureus - Bacillus anthracis
1 Quan sát tính ch ất mọc của 3 loại vi khuẩn trên môi trường nuôi cấy thông thường
Vi khu ẩn
Môi trường
Pasteurella multocida
Là loại vi khuẩn
hiếu khí
Staphylococcus aureus
Là loại vi khuẩn
hiếu khí hoặc hiếu khí tùy tiện
Bacillus anthracis
Là loại vi khuẩn
hiếu khí
Nước thịt 24 sau khi cấy vẩn
đục như sương mù,
có cặn nhầy ở đáy,
có sinh màng mỏng
ở trên bề mặt môi trường, môi trường
có mùi tanh của nước dãi khô
24h sau khi nuôi
cấy, môi trường đục đều, không có màng, có cặn ở đáy ống, cặn màu trắng sau màu vàng
24 sau khi cấy, hình thành những sợi bông, sợi chỉ, lơ
lửng dọc theo ống nghiệm, rồi lắng
cặng xuống đáy ống, môi trường trong Khi lắc nhẹ
nổi lên thành sợi
chỉ xoăn uốn cong
rồi lại rơi xuống đáy thành cặn bông
trắng, căn bông này
gồm những bó chuỗi vi khuẩn dài
Vi khuẩn không làm thành màng trên mặt môi trường
Th ạch thường Khuẩn lạc nhỏ, lấm
tấm giống như hạt sương, trong suốt,
mặt vồng, rìa gọn, khuẩn lạc màu
trắng ngà và dính
24h sau khi cấy, hình thành khuẩn
lạc dạng S, tròn,
lồi, ướt, bóng, màu
trắng (nếu là Sta
albus), màu vàng
thẫm (nếu là Sta
24h sau khi cấy, hình thành khuẩn
lạc dạng R, xù xì, rìa không đều, không gọn Khuẩn
lạc dính mặt thạch khó lấy ra bằng que
Trang 22
aureus), màu vàng chanh (nếu là Sta
citrus)
cấy
Th ạch máu Không dung huyết,
trên môi trường
thạch máu phát triển tốt hơn trên
thạch thường
24h sau khi cấy, tụ
cầu có độc lực cao
sẽ làm dung huyết thành vùng rõ rệt
Không làm dung huyết thạch máu, khuẩn lạc dạng S nhiều hơn dạng R
2 Quan sát hình thái c ủa 3 loại vi khuẩn
Làm tiêu bản, nhuộm và soi dưới kính hiển vi
* Các bước làm tiêu bản vi sinh vật?
B1: chuẩn bị phiến kính
- Chọn một phiến kính trong sáng, sạch sẽ, mỏng Trước khi dùng phải vô trùng (bằng cách hơ trên ngọn lửa đèn cồn)
- Dung bút viết kính đánh dấu diện tích phiết vi sinh vật ở mặt sau của phiến kính B2: Phiết vi sinh vật
Vi khuẩn có thể lấy từ nhiều nguồn khác nhau thì cách lấy cũng khác nhau:
- Nếu lấy vi sinh vật ở môi trường lỏng: trước khi lấy ta phải lắc nhẹ để vi sinh vật hòa đều trong ống đựng môi trường, dùng que cấy vô trùng lấy một giọt canh khuẩn,
nhỏ lên diện tích mà ta đã đánh dấu và dàn mỏng ra
- Nếu lấy vi sinh vật ở môi trường đặc: dùng que cấy vô trùng, lấy một giọt nước sinh
lý, nhỏ lên diện tích phiết vi sinh vật mà ta đã đánh d ấu, sau đó dùng que cấy vô trùng lấy “một ít” khuẩn lạc (chạm nhẹ), rồi trộn với nước sinh lý, dàn mỏng ra
- Nếu lấy vi sinh vật từ trong bệnh phẩm (gan, lách, phổi)? trong bài này ta sẽ lấy gan
của gà gây bệnh tụ huyết trùng: dùng kéo cắt 1 mẩu nhỏ độ 1cm, dùng panh cặp lấy
mẫu bệnh phẩm đó, lướt nhẹ lên phiến kính độ 2 vệt
B3: Cố định vi sinh vật:
- Mục đích:
+ Giết chết vi sinh vật đỡ nguy hiểm cho người sử dụng
Trang 33
+ Vi sinh vật chết thì bắt màu thuốc nhuộm tốt hơn
+ gắn chặt vi sinh vật với tiêu bản
- cố định vi sinh vật:
+ Dùng nhiệt cố định: bằng cách hơ cao trên ngọn lửa đèn cồn
+ Dùng hóa chất: dùng cồn tuyệt đối, axeton, metanol (vd: với tiêu bản máudùng hóa chất)
B4: nhuộm màu vi sinh vật:
- Phương pháp nhuộm gram (một trong những phương pháp nhuộm kép):
- Cách nhu ộm:
+ nh ỏ lên tiêu bản một vài giọt thuốc nhuộm tím gentian - 1 phút - Rửa nước
+ nh ỏ lên tiêu bản một vài giọt thuốc nhuộm lugol - 1 phút - Rửa nước
+ Cho c ồn axeton chảy qua diện tích phiết vsv - Rửa nước -
+ Nh ỏ vài giọt thuốc nhuộm đỏ fucsin loãng - 1 phút - rửa nước - vẩy khô - soi kính
Trang 44
Hình thái 3 vi khu ẩn Pasteurella multocida Staphylococcus aureus Bacillus anthracis
- Là loại cầu trực khuẩn nhỏ
ngắn, hình trứng hày hình
bầu dục hoặc hình cầu, là
loại trung gian giữa cầu
khuẩn và trực khuẩn
- Kích thước:
0,25-0,4x0,4-1,5µ
- vi khuẩn có lông, không di
động,
- không hình thành nha bào,
- có giáp mô nhưng khó thấy
- ở trong cơ thể vi khuẩn
nhuộm màu đậm 2 đầu (gọi
là vi khuẩn lưỡng cực)
- bắt màu gram (-)
- hình tròn nhỏ, cầu khuẩn,
- kích thước 0,5 – 1,5µ
- thường tập trung từ 2 - 3 con hoặc thành từng chùm
nhỏ giống như chùm nho,
- không có lông, không di động
- không có nhà bào
- không có giáp mô
- bắt màu gram (+)
- là loại trực khuẩn to, hai đầu vuông (hay hay đầu
bằng)
- kích thước từ 1 - 8x1 - 1,5µ
- đây là trực khuẩn to nhất trong số các loại trực khuẩn gây bệnh
- không có lông, không di động
- hình thành nha bào ở ngoài cơ thể, hình tròn hay hình trứng nằm chính giữa thân con vi khuẩn (kích thước nhà bà chỉ bằng bề
rộng của vi khuẩn nên không làm biến dạng vi khuẩn - phân biệt với trực khuẩn uốn ván)
- hình thành giáp mô trong
cơ thể gia súc ốm, giáp mô
có thể bao bọc một hoặc vài đơn vị vi khuẩn
- ở trong canh trùng: vi khuẩn xếp thành chuỗi dài hay thành sợi dài cong queo
- bắt màu gram (+)
Trang 55
3 Quan sát ph ản ứng sinh Indol của 2 loại vi khuẩn: Pasteurella multocida và Salmonella
Nguyên lý: Trong môi trường peptone không có đường, một số vi khuẩn có khả năng
sản sinh ra enzyme tryptophanaza, chúng phân giải axit amin tryptophan tạo ra Indol Indol kết hợp với chất para dimethyl aminobenzaldehyte (có trong thuốc thử Kowas)
tạo ra hợp chất là Rosidol (màu đỏ)phản ứng (+) là vi khuẩn có sinh ra enzym tryptophanaza Ngược lại là phản ứng (-)
Các tiến hành: Để thử phản ứng sinh Indol, người ta cấy vi khuẩn vào môi trường peptone hoặc môi trường tryptone không có đường, rồi nuôi cấy ở 37oC/24-48h lấy
ra, nhỏ vào đó vài giọt thuốc thử Kowas
+ Nếu trên bề mặt môi trường xuất hiện vòng tròn đỏ phản ứng (+)
+ Nếu trên bề mặt môi trường không xuất hiện vòng tròn đỏ phản ứng (-)
4 Phương pháp mổ khám động vật ( gà gây bệnh tụ huyết trùng)
- Cố định
- Cắt lông vùng ngực bụng
- Sát trùng bằng cồn 70o, cồn Iod
- Mổ: cắt 1 đường dưới da từ bụng tới miệng rồi lật sang 2 bên, sát trùng cồn dưới da
- Mổ bụng cắt vòng 2 bên xương sườn, mở nắp ngực lên
+ Quan sát bệnh tích trong xoang ngực ? tim? Bao tim? (xuất huyết mỡ vành tim, bao tim tích nước)
+ Lấy bệnh phẩm ở gan,hoặc tim cấy vào các môi trường: nước thịt,thạch thường,
thạch máu
Nuôi cấy ở tủ ấm 37oC/24h, lấy ra đọc kết quả, làm tiêu bản, nhuộm xem hình thái + Làm tiêu bản gan gà mắc bệnh tụ huyết trùng, nhuộm và soi dưới kính hiển vi
5 Thao tác trong phòng kính hi ển vi
Xem lai thuc tap vsv dai cuong
Trang 66
Bài 2: Erypsipelothrix rhusiopathiae - Salmonella cholerae suis -
Escherichia coli (E.coli)
1 Quan sát tính ch ất mọc của 3 loại vi khuẩn trên các môi trường nuôi cấy 1.1 Trên m ôi trường nuôi cấy thông thường:
Vi khu ẩn
Môi trường
Đóng dấu lợn
Là loại vi khuẩn
hiếu khí
Salmonella
Là loại vi khuẩn vừa
hiếu khí, vừa yếm khí không bắt buộc,
dễ nuôi cấy, to thích
hợp 37oC (6-42oC),
pH =7(6-9)
E.coli
Là loại vi khuẩn
hiếu khí và yếm khí tùy tiện, to=5-40oC (37oC), pH=5-8(7,2-7,4)
Nước thịt 24 sau khi cấy môi
trường hơi đục rồi
lại trong, lắc lên có
hiện tượng vẩn như mây bay rồi lại mất ngay, không có màng, có ít cặn
trắng ở đáy ống
24h sau khi nuôi
cấy, môi trường đục đều, để lâu có cặn, trên bề mặt có màng
mỏng
24 sau khi cấy, môi trường rất đục, có
cặn màu tro nhạt
lắng xuống đáy, đôi khi có màu xám
nhạt trên bề mặt mt,
mt có mùi phân thối
Th ạch thường Khuẩn lạc rất nhỏ,
dạng S, tròn, gọn, bóng láng, trong
suốt như giọt sương
24h sau khi cấy, hình thành khuẩn
lạc dạng S, tròn,
gọn, trong sáng, ướt,
nhẵn bóng, nhỏ hơn
và trắng hơn khuẩn
lạc E.coli, xq khuẩn
lạc có 1 bờ chất dính lầy nhầy
24h sau khi cấy, hình thành khuẩn
lạc dạng S, tròn ướt, không trong suốt, màu tro nhạt, hơi
lồi, đường kính 2-3mm Nuôi lâu thì khuẩn lạc gần như nâu nhạt và mọc
rộng ra Có thể QS
thấy cả khuẩn lạc
dạng M và R
Thạch máu Không gây dung
huyết, phát triển tốt
24h sau khi cấy, Sal phát triển tốt, không gây dung huyết
Phát triển tốt, một
số chủng gây bệnh gây dung huyết α
hoặc β
Trang 77
1.2 Quan sát tính ch ất mọc của 2 vi khuẩn Salmonella và E.coli trên các môi trường giám định
Vi khuẩn
Môi trường
Màu mt trước khi nuôi cấy
Macconkay Có màu đỏ (kiểu
xi rô)
Hình thành khuẩn lạc không màu, do không lên men đường lactoz, màu môi
trường chuyển sang màu
vàng cánh gián
môi tr ường đỏ đậm hơn, Khuẩn
l ạc màu đỏ và vòng
mờ ở xung quanh,
do lên men đường lactoz, và làm kết
tủa muối mật nên
có vòng mờ xq
Brilliant Green
agar (BGA)
Bình thường có màu vàng sẫm
24h sau khi cấy, hình thành khuẩn lạc dạng S, không màu, môi trường chuyển sang màu đỏ
24h sau khi cấy, hình thành khuẩn
lạc dạng S màu xanh lá cây, môi trường có màu vàng chóe
Kligler ho ặc TSI
(Triple sugar
iron)
Kligler: hấp xong
có màu vàng, đổ nguội có màu đỏ TSI: có màu đỏ khi để nguội (có dạng nửa
thạch đứng và nửa
thạch nghiêng trên cùng 1 ống
nghiệm)
24h sau khi cấy, Sal chỉ lên men đường glucoz mà ko lên men đường lactoz, nên lúc đầu sau khi cấy thạch trở nên vàng, sau đó phần thạch nghiêng hiếu khí glucoz sẽ bị
sử dụng hết, peptone bị tác động làm mt chuyển đỏ,
phần thạch đứng pepton ít bị t/đ nên mt có màu vàng,
- sal còn sinh H2S nên fan
giữa thạch đứng và nghiên
có màu đen
24h, E.coli lên men
cả 2 loại đường glucoz và lactoz nên cả phần thạch đứng và thạch nghiêng đều có màu vàng
Trang 88
2 Quan sát hình thái c ủa 3 loại vi khuẩn trên
- Là loại cầu trực khuẩn nhỏ
hình tăm hay hình gậy, có
khi thẳng, có khi cong
- Kích thước:
0,2-0,4x1-1,5µ
- không có lông, không di
động
- không hình thành nha bào
và giáp mô
- ở trong canh trùng già hay
trong cơ thể lợn mắc bệnh
mạn tính, vi khuẩn có hình
sợi tơ dài, cong queo
- bắt màu gram (+)
- là loại trực khuẩn ngắn, hình gậy,
- kích thước 0,4 - 0,6x1-3µ
- đa số có khả năng di động mạnh, có từ 7-12 lông ở xung quanh thân (trừ có Sal gallinarum pullorum),
- không có nhà bào
- không hình thành giáp
mô
- bắt màu gram (-), bắt màu toàn thân hoặc hơi đậm ở 2 đầu
- là loại trực khuẩn ngắn, hình gậy, hai đầu vuông (hay hay đầu bằng)
- kích thước từ 2 - 3x0,6µ
- trong cơ thể hình cầu trực khuẩn, đứng riêng lẻ thành
từng đôi, có khi xếp thành chuỗi ngắn
- có khi trong môi trường nuôi cấy thây những trực khuẩn dài 4-8µ, những loại này thường gặp trong canh khuẩn già
- phần lớn E.coli di động
và có lông ở xung quanh thân
- không sinh nha bào
- có thể có giáp mô
- bắt màu gram (-), sẫm ở
2 đầu, khoảng giữa nhạt hơn
3 Đọc kết quả phản ứng sinh Indol của 2 loại vi khuẩn Salmonella và E.coli
4 M ổ khám bồ câu gây bệnh đóng dấu lợn
- Dựa vào thao tác trong khi kiến tập mổ khám gà gây bệnh tụ huyết trùng, thực hành
mổ khám bồ câu
Trang 99
Bài 3+4: Vi khu ẩn lao – Nha bào nhiệt thán và các phản ứng huyết thanh học
1 Ph ản ứng kết tủa tạo vòng Ascoli
* M ục đích: chẩn đoán bệnh nhiệt thán Người ta thường làm với kháng nguyên ghi
ngờ và được bào chế cẩn thận
* Nguyên lý: 1 kháng nguyên hòa tan (hay kết tủa tố nguyên) gặp một kháng thể tương ứng (được gọi là kết tủa tố) (Ig này là do KN kích thích sản sinh) với một tỷ lệ thích hợp dẫn đến xảy ra hiện tượng tạo thành cặn trắng kết tủa có thể quan sát được
Hiện tượng kết tủa là do kết tủa tố nguyên + kết tủa tố tạo ra cấu trúc mạng lưới
không gian 3 chiều Sự dư thừa 1 trong 2 tác nhân thì phản ứng vẫn xảy ra nhưng ta
sẽ không quan sát được
* Các bước tiến hành:
- chu ẩn bị kháng nguyên nghi: lấy 1 mẩu da tai, hoặc mẩu xương, đôi khi có thể lấy
1 chút lách của con vật đã chết lâu ngày (vì trong cấu trúc của VK NT, để tránh bị
thực bào thì trong cấu trúc này có kết tủa tố nguyên gây ra phản ứng kết tủa)
+ n ếu là bệnh phẩm tươi: dùng kéo cắt nhỏ ra, đem đun cách thủy (ống, nồi hấp)
trong vòng 1h, rồi cho nước sinh lý vào(thư ờng pha nồng độ 1/10) ngâm ở
4oC/12-24h rồi thu được KN hòa tan, đem ly tâm lấy nước trong
+ n ếu là bệnh phẩm đã chết lâu ngày (mẩu da tai, mẩu xương): làm nhỏ ra đem
hấp ướt ở 120oC/30ph rồi pha với nước sinh lý để ở to là 4oC/12-24h rồi lấy ra đem ly tâm lấy nước trong thu được kháng nguyên nghi ngờ
Trong phản ứng này người ta còn dùng kháng nguyên âm làm đối chứng
- chu ẩn bị kháng thể chuẩn: đã biết bằng cách gây tối miễn dịch cho thỏ, cho ngựa,
lấy máu chắt lấy huyết thanh
* Cách th ực hiện:
- Dùng 2 ống nghiệm nhọn đầu, dùng pipets hút 0,5ml kháng nguyên cho vào ống
nghiệm đó (1 ống là kháng nguyên âm), 1 ống là kháng nguyên nghi
- Dùng pipet hút 0,5ml kháng huy ết thanh chuẩn thả từ từ xuống đáy ống nghiệm,
do chênh lệch về tỷ trọng mà kháng thể đội KN lên trên
Kết quả: - Phản ứng (+) là xuất hiện đĩa tủa tại chỗ tiếp xúc giữa KN và KT
- phản ứng (-) là không có đĩa tủa
Trang 1010
2 Vi khu ẩn lao (Mycobacterium tuberculosis)
* Nguyên lý: Đây là một vi khuẩn kháng axit Do vi khuẩn lao có vỏ sáp bao bọc và trong nguyên sinh chất có mỡ, axit mỡ, nên rất khó nhuộm màu, muốn cho lớp vỏ sáp
và lớp mỡ đó bắt màu thì ta phải dụng một dung dịch thuốc nhuộm mạnh và pha đậm đặc, đồng thời phải đun nóng để phản ứng hóa học tiến hành nhanh hơn Sau khi vi khuẩn lao đã bắt màu rồi thì lại rất khó mất màu, mặc dù tẩy bằng axit và cồn, vì thế nên gọi là vi khuẩn kháng toan và kháng cồn
* Ti ến hành:
- Làm tiêu b ản nhuộm lao: tương tự khi lấy các vsv khác ở môi trường lỏng, cố
định tiêu bản bằng cách hơ trên ngọn lửa đèn cồn
* Phương pháp nhuộm Ziehl - Neelsen:
B1: Nhỏ dung dịch fucsin đặc cho ngập tiêu bản - để trong thời gian 2 - 5 phút
B2: Đung nóng tiêu bản trên ngọn lửa đèn cồn (hơ) đến khi thấy thuốc nhuộm fucsin
bốc hơi thì dừng lại rồi để nguội, lại hơ lại trên ngọn lửa đền cồn cho bốc hơi, rồi để nguội Làm như vậy 3 lần - đem rửa nước
B3: T ẩy mầu nhanh:
- Nhúng nhanh tiêu bản vào cốc đựng axit loãng (làm nhanh vì tiêu bản phai màu rất nhanh)
- Nhúng tiêu bản vào cốc đựng cồn 96o
- Rửa nước cho sạch cồn
B4: Nhu ộm nền:
- nhỏ lên tiêu bản một vài giọt thuốc nhuộm xanh metylen, để trong thời gian 1-2 phút
- Rửa nước, để khổ hoặc thấm khô
- Soi kính
K ết quả: vi khuẩn sẽ bắt màu đỏ trên nền xanh nhạt
Phương pháp nhuộm này còn áp dụng để quan sát nha bào nhiệt thán Kết quả: nha bào b ắt màu đỏ, vi khuẩn bắt màu xanh
* Hình thái c ủa vi khuẩn lao:
Trang 1111
Là trực khuẩn hình gậy nhỏ, kích thước từ 0,2 - 0,5 x 1,5 - 5µ , hai đầu tròn,
bắt màu gram (+), không di động, không hình thành nha bào và giáp mô, thỉnh thoảng
có cấu tạo hình hạt, có khoảng trắng ở giữa do bắt màu không đều, ngoài ra cũng có
thể có hình chuỗi
- Trong canh trùng non tạo thành chuỗi chữ S
- Trong canh trùng già thỉnh thoảng có hình sợi Vi khuẩn lao ở bò ngắn hơn và
mập hơn vi khuẩn lao ở người Trong tổ chức, nó thường đứng riêng lẻ, trong thể
dịch bài tiết có khi thành từng nhóm, thỉnh thoảng song song hay thẳng góc
3 PHẢN ỨNG NGƯNG KẾT (AGGLUTINATION TEST)
Phản ứng ngưng kết là kết quả tác động tương phản giữa ngưng kết tố có trong huyết thanh con vật ốm và ngưng kết tố nguyên có trên thân con vi khuẩn , phản ứng ngưng kết thể hiện bằng một sự tập trung vi khuẩn trong hỗn hợp thành từng đám lấm
tấm, từng hạt lổn nhổn ở trên phiến kính hay lắng xuống đáy ống nghiệm còn phần
nước ở trên trong
* Chuẩn bị kháng nguyên: giống vi khuẩn tiêu chuẩn đã được cấy trên môi trường thích hợp và được rửa bằng nước muối sinh lý 0,85%
* Chuẩn bị huyết thanh: lấy máu tĩnh mạch gia súc ốm và tách lấy huyết thanh
* Nguyên lý: Đối với các kháng nguyên hữu hình (như xác vi khuẩn ) khi g ặp kháng thể đặc hiệu, các vi khuẩn sẽ kết lại với nhau thành đám lớn mà mắt thường có
thể quan sát được Đó là hiện tượng ngưng kết trực tiếp
Khi cơ thể được miễn dịch, trong huyết thanh có chứa nhiều kháng thể đ ặc
hiệu với kháng nguyên tương ứng Khi cho kháng nguyên hữu hình (còn nguyên vẹn
cả tế bào vi khuẩn đã chết) trộn với kháng thể đặc hiệu tương ứng, thì các vi khuẩn phân tán rời xa nhau trong hỗn dịch, kháng nguyên sẽ kết lại với nhau qua cầu lối kháng thể đặc hiệu Do mỗi xác vi khuẩn có nhiều vị trí kết hợp với kháng thể, nên các kháng thể t ạo cầu lối với các kháng nguyên dưới hình thức mạng lưới nhiều chiều, tạo nên những đám ngưng kết biểu hiện bằng những đám lấm tấm hoặc lổn
nhổn như hạt cát hoặc như những cụm bông lơ lửng
Trong thực tế phản ứng ngưng kết xảy ra được còn phụ thuộc nhiều điều kiệt khác nữa
Kháng thể IgG khó xảy ra ngưng kết hơn so với kháng thể IgM, vì IgG chỉ có 2
vị trí liên kết với kháng nguyên trong khi đó IgM có 5 vị trí liên kết với kháng nguyên Khả năng ngưng kết của IgM cao hơn 100 lần so với IgG
Điều đáng chú ý là phản ứng ngưng kết chỉ sinh ra trong trường hợp có chất điện giải (nước muối sinh lý0,85%), nếu dùng nước cất hoặc các dung dịch phi điện
giải thì sẽ không sinh ra phản ứng ngưng kết