Tiểu luận:VACCINE PHÒNG BỆNH DO PASTEURELLA doc

Tám mươi năm sau, Louis Pasteur nghiên cứu bệnh tả khi dịch tả đang tàn sát đàn gà Pasteur đã xác nhận các giả thuyết của Jenner và mở đường cho khoa miễn dịch học hiện đại 2.ĐỊNH NGHĨA

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

TRƯỜNG ĐH NÔNG LÂM ĐỘC LẬP – TỰ DO – HẠNH PHÚC

Tiểu luận

GVHD: PGS.Ts Nguyễn Ngọc Hải SVTH: Phan Thị Anh Văn

Lớp: DH06SH

I.KHÁI QUÁT VỀ VACCINE

1.LỊCH SỬ RA ĐỜI CỦA VACCINE

Vaccine đầu tiên gắn với tên tuổi của Edward Jenner, một bác sĩ người Anh Năm 1796,

châu Âu đang có dịch đậu mùa, Jenner đã thực hiện thành công thử nghiệm vaccine ngừa

căn bệnh này

Thời điểm 1798, khi Jener công bố kết quả thí nghiệm của mình, người ta chỉ hình dung là

có các "mầm bệnh" gây nên sự truyền nhiễm

Tám mươi năm sau, Louis Pasteur nghiên cứu bệnh tả khi dịch tả đang tàn sát đàn gà

Pasteur đã xác nhận các giả thuyết của Jenner và mở đường cho khoa miễn dịch học hiện

đại

2.ĐỊNH NGHĨA

Vaccine là một chế phẩm sinh học chứa vật chất của mầm bệnh được gọi là "kháng

nguyên".Khi đưa vào cơ thể người hoặc động vật sẽ kích thích cơ thể tạo ra một trạng thái

miễn dịch, giúp cơ thể chống lại mầm gây bệnh

Dù chế tạo bằng công nghệ nào đi nữa thì vaccine phải bảo đảm bốn tiêu chuẩn cơ bản sau:

- Không gây phản ứng toàn thân.Có thể có phản ứng cục bộ, nhưng những biểu hiện lâm

sàng phải biến mất 24 giờ sau khi tiêm phòng

- Hiệu lực phòng bệnh cao và kéo dài

- Tiêm nhẹ tay, liều tiêm thấp và bảo quản dễ dàng

- Giá thành hạ

3.THÀNH PHẦN CHỦ YẾU CỦA VACCINE

Có hai thành phần chủ yếu trong vaccine đó là:Kháng nguyên và chất bổ trợ vaccine

- Kháng nguyên:kháng nguyên được hiểu là một chất khi đưa vào cơ thể sẽ kích thích cơ

thể vật chủ sản sinh kháng thể và tạora mộ lớp tế bào mẫn cảm đặc hiệu chống lại sự xâm

nhập và gây bệnh của mầm bệnh

- Chất bổ trợ vaccine: Là những chất được bổ sung vào vaccine, có khả năng kích thích

sinh miễn dịch không đặc hiệu nhằm nâng cao hiệu lực và độ dài miễn dịch của vaccine

Bổ trợ kết hợp với kháng nguyên làm tăng tính lạ của kháng nguyên khi vào cơ thể,nên đáp

ứng miễn dịch mạnh hơn,quá trình tổng hợp protein cao hơn.Vaccine có bổ sung chất bổ

trợ sẽ tạo được miển dịch mạnh hơn ,thời gian miễn dịch kéo dài hơn

4.PHÂN LOẠI VACCINE

Dựa vào thành phần kháng nguyên có trong vaccine, hoặc căn cứ vào hoạt tính của mầm

bệnh hoặc công nghệ chế tạo vaccine để phân loại vaccine

4.1 Dựa vào thành phần kháng nguyên

vaccine thế hệ I – vaccine toàn khuẩn

Vaccine toàn khuẩn có thể bao gồm kháng nguyên thân, vỏ bọc và độc tố của nấm bệnh sản

sinh ra trong quá trình phát triển

Vaccine thế hệ II

Trong vacxin chỉ chứa một số thành phần gây bệnh của mầm bệnh nguyên

Vaccine thế hệ III-Vaccine tái tổ hợp

Vaccine tái tổ hợp được sản xuất bằng nghệ gen ( genetic engeneering ) như vaccine tái tổ

hợp phòng bệnh cúm gia cầm H5N1, vaccine tái tổ hợp LMLM v.v

4.2 Dựa vào hoạt tính của mầm bệnh

Trong nhóm này có hai loại vaccine: vaccine vô hoạt và vaccine nhược độc

a.Vaccine vô hoạt

Vaccine vô hoạt là vaccine chứa mầm bệnh- kháng nguyên đã được vô hoạt bằng các yếu

tố vật lý như: Nhiệt độ, tia tử ngoại, sóng siêu âm; bằng các hóa chất như: Các loại thuốc

nhuộm,các axit, formol v.v

Vaccine vô hoạt không có bổ trợ

Loại vaccine này còn được gọi là bacterin Vaccine bacterin chỉ chứa một thành phần chủ

yếu là kháng nguyên Công nghệ chế tạo bacterin khá đơn giản phù hợp với các nước có

trình độ chế tạo vaccine đơn giản, có giá thành hạ Song hiệu lực vaccine này thấp, độ dài

miễn dịch ngắn Hiện nay loại vaccine này được sản xuất rất ít, thường sản xuất dạng

vaccine chuồng cho một số cơ sở có yêu cầu

*Vaccine vô hoạt có bổ trợ vaccine

Trong vaccine này ngoài kháng nguyên đã được vô hoạt còn có bổ trợ vaccine Các bổ trợ

vaccine hiện nay thường dùng là keo phèn, phèn chua và bổ trợ dầu khoáng

b Vaccine nhược độc

Vaccine nhược độc là vacine chứa mầm bệnh được làm nhược độc hoặc vô độc, nhưng vẫn

bảo toàn tính khàng nguyên

I.2 CƠ CHẾ HOẠT ĐỘNG CỦA VACCINE

Hệ miễn dịch nhận diện vắc-xin là vật lạ nên hủy diệt và "ghi nhớ" chúng

Về sau, khi tác nhân gây bệnh thực thụ xâm nhập cơ thể, hệ miễn dịch đã ở tư thế sẵn sàng

để tấn công tác nhân gây bệnh nhanh chóng hơn và hữu hiệu hơn (bằng cách huy động

nhiều thành phần của hệ miễn dịch, đặc biệt là đánh thức các tế bào lympho nhớ) Đây

chính là các ưu điểm của đáp ứng miễn dịch đặc hiệu

I.3.PHƯƠNG PHÁP CHUNG SẢN XUẤT VACCINE

Tạm hiểu đơn giản việc sản xuất theo cách:

Cách sản xuất cổ điển: Lấy chính vi khuẩn gây bệnh, làm giảm độc lực (tạm gọi là kháng

nguyên) tiêm vào người thì chúng không đủ sức gây bệnh mà kích thích cơ thể tạo ra chất

miễn dịch (gọi là kháng thể) Lần sau gặp lại vi khuẩn, kháng thể chống lại nên cơ thể

không mắc bệnh

Cách sản xuất hiện đại: Chỉ lấy một ít kháng nguyên ở vi khuẩn gây bệnh, “cấy” vào một vi

khuẩn lành tính, làm cho nó sinh sôi nảy nở, rồi “chiết” kháng nguyên từ vi khuẩn lành tính

đó ra làm vacxin Cách điều chế bằng “công nghệ sinh học” này chỉ dùng một lượng kháng

2 sơ đồ sản xuất vaccine trên môt trường tế bào

I.4.ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐỘNG VẬT TRONG SẢN XUẤT

VACCINE

1 DNA TÁI TỔ HỢP

ADN tái tổ hợp là phân tử ADN được tạo thành từ hai hay nhiều trình tự ADN của các loài

sinh vật khác nhau Trong kỹ thuật di truyền, ADN tái tổ hợp thường là được tạo thành từ

việc gắn những đoạn ADN có nguồn gốc khác nhau vào trong vectơ tách dòng Những

vectơ tách dòng mang ADN tái tổ hợp này có thể biểu hiện thành các protein tái tổ hợp

trong các sinh vật

DNA vaccine

Còn gọi là vaccine DNA tái tổ hợp, đây là loại nucleic acid vaccine,

dựa trên nguyên lý một gen mã hóa cho protein kháng nguyên đặc

hiệu được tiêm vào vật chủ (tế bào động vật hoặc vi sinh vật) để sản

xuất các kháng nguyên này và khởi động một phản ứng miễn dịch

Nhiều vaccine phòng virus hiện nay (sởi, bại liệt, dại…) đều được

sản xuất từ nuôi cấy tế bào động vật mà không phải là tế bào vi sinh

vật

Phân lập một hoặc nhiều gen từ tác nhân gây bệnh (pathogen), đưa

các gen này vào trong vòng DNA của plasmid và đóng lại Các vòng

DNA sau đó được đưa vào trong các nhóm tế bào nhỏ, thường bằng cách tiêm vào tế bào

cơ hoặc đẩy vào da nhờ súng bắn gen Các gen được chọn lựa mã hóa cho các kháng

nguyên, các chất có thể gây ra một đáp ứng miễn dịch, thường được sản xuất bởi tác nhân

gây bệnh

2 NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

Tế bào động vật tách từ mô có thể được nuôi cấy trên các loại môi trường dinh dưỡng tổng

hợp bên ngoài cơ thể, chúng sinh trưởng bằng cách tăng số lượng và kích thước tế bào

Mô trường tế bào

Nhiễm vi rút , đẻ tủ ấm

Thu hoạch tế bào có vi rút

Sản xuất vaccine

Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật có vú có thể được ứng dụng để sản xuất các hợp chất hóa

sinh quan trọng dùng trong chẩn đoán như các hormone sinh trưởng của người, interferon,

hoạt tố plasminogen mô, các viral vaccine và các kháng thể đơn dòng

Một số loại vaccine mới đang nghiên cứu

Sử dụng các phụ gia (adjuvant) mới, nhằm gây ra loại đáp ứng miễn dịch mong muốn Thí

dụ, chất nhôm phosphate và các oligonucleotide chứa CpG demethyl hóa đưa vào vaccine

khiến đáp ứng miễn dịch phát triển theo hướng dịch thể (tạo kháng thể) thay vì tế bào

Vaccine khảm: sử dụng một sinh thể quen biết để hạn chế hiện tượng "phản tác dụng", thí

dụ dùng virus vaccinia mang một số yếu tố của virus viêm gan B hay virus dại

Vaccine polypeptidique: tăng cường tính sinh miễn dịch nhờ liên kết tốt hơn với các phân

tử MHC: peptide nhân tạo 1/2 giống virus, 1/2 kia gắn MHC; đoạn peptide mô phỏng 1

quyết định kháng nguyên (epitope)

Anti-idiotype: idiotype là cấu trúc không gian của kháng thể tại vị trí gắn kháng nguyên,

đặc hiệu với kháng nguyên tương ứng Anti-idiotype là các kháng thể đặc hiệu đối với

idiotype, do đó anti-idiotype xét về mặt đặc hiệu lại tương tự với kháng nguyên Vậy, thay

vì dùng kháng nguyên X làm vaccine, người ta dùng idiotype anti-anti-X

II VACCINE PHÒNG BỆNH DO VI KHUẨN PASTEURELLA

II.1 PASTEURELLA

1 Một số bệnh do pasteurella

Pasteurella là giống vi khuẩn gồm nhiều loài khác

nhau, mỗi loài thích nghi gây bệnh ở một loại động

vật khác nhau , nhưng chúng điều gây ra chứng bại

huyết,xuất huyết nên người ta gọi bệnh này ở các loài

gia súc gia cầm bằng một tên chung là bệnh tụ huyết

trùng( pasteurellosis)

Bệnh tụ huyết trùng trâu bò (pasteurelcosis bovum) là

một bệnh truyền nhiễm cấp tính ở trâu, bò gây ra do

pasteurella boviseptica(ở bò) và pasteurlla

bulaiseptica(ở trâu) với các kiểu đặt trưng: tụ huyết

và xuất huyết ở các vùng đặt trưng trên cơ thể, vi

khuẩn thường xam nhập vào máu gây bại huyết

Bệnh tụ huyết trùng ở lợn (pasteurella sunum) là một bệnh truyền nhiễm cấp tính xảy ra ở

lợn, thường phát sinh rải rát,có khi thành dịch địa phương Bẹnh do vi khuẩn pasteurella

suiseptica gây ra, đặc điểm của bệnh là viêm phổi ,viêm màng phổi, màng tim và bại huyết

Ở gia cầm, bệnh tụ huyết trùng do pasteurella aviseptica gây ra với đặc điểm gà ,vịt ,

ngang, ngỗng thường chết nhanh khi nhiễm bệnh như nhiễm đọc cấp tính với tỉ lệ chết rất

cao Bệnh tích thường gặp là viêm bao tim tích nước, mỡ vành tim xuất huyết, gan sưng tụ

máu và có nhiều điểm tụ nước màu vàng

Ngoài ra pasteurella còn gây bệnh trên thỏ, chim và cả cá

Phương thức truyền lây của vi khẩn này là từ con bệnh trực tiếp qua con khỏe hoặc gián

tiếp qua các nhân tố trung gian bị ô nhiễm vi khuẩn cường độc

Lây qua chất thải của gia súc gia cầm hay việc giết mổ bừa bãi

Nhiều khi bệnh tự phát trong đàn gia súc gia càm vì vi khuẩn thường kí sinh trong cơ thể

gia cầm, gia súc khỏe,bình thường¸giũa cơ thể gia súc gia cầm và vi khuẩn có sự cân bằng

sinh học nhưng khi có sự mát cân bằng do ảnh hưởng ngoại cảnh oặc biến đổi gì đó trong

cơ thể vi khuấn sẽ tăng cường độc và gây bệnh

Bệnh thường bùng phát rất nhanh và gây thiệt haị rất nặng nề vì vậy conng tác phòng bệnh

hết sức cần thiết và cấp bách

2 Đặc điểm

Vi khuẩn hình gậy ngắn tròn ở hai đầu ( một cầu trực khuẩn

nhỏ có hình trứng hoặc bầu dục), kích thướt

0.25-0.4x0.4-1.5µm, vi khuẩn không có lông, không di động, không hình

thành nha bào, bắt màu gram âm

Trong cơ thể bệnh vi khuẩn hình thành giáp mô nhưng khó

quan sát và khi nhuộm, vi khuẩn có hiện tượng bắt màu

xám hơn ở hai đầu tế bào nên người ta gọi Pasteurella là vi

khuẩn lưỡng cực (Nguyễn Bá Hiên, 2008)

Mọc được trong môi trường thạch thường và nước thịt

thường

Nhiệt độ tối ưu 36-380C với pH=7.2-7.4

Tùy nghi hiếu khí

Trên thạch mọc thành 3 loại khuẩn lạc S (láng): độc lực cao, M (nhày): độc lực yếu hơn, R

(xù xì): độc lực yếu hoặc không độc lực tính biến dạng rất lớn: khi cấy chuyển qua môi

trường dinh dưỡng nhiều lần hoặc tiêm qua động vật thì dạng S có thể chuyển thành dạng

M hoặc R và ngược lại

Đặc điểm quan trọng của Pasteurella Multocida là đặc tính dung quang của khuẩn lạc khi

chiếu ánh sang xuyên 450nm Đặc điểm này lần đầu tiên do Deruit (1921) phát hiện Khuẩn

lạc dạng S trên môi trường thường có tính dung quan, khuẩn lạc dạng M và R không có đặc

tính nói trên

Theo Smith, đặc tính này có quan hệ chặt chẽ với sự tạo vỏ của chủng tụ huyết trùng Dựa

vào đặc tính này có thể chọn được những chủng tụ huyết trùng có tính kháng nguyên và

miễn dịch cao

Vi khuẩn tụ huyết trùng dễ bị tiêu diệt bởi sức nóng, ánh sang mặt trời và chất sát trùng

Vi khuẩn bị diệt khi đun 580C trong 20 phút; 800C sau 10 phút; 1000C chết ngay

Ánh sang mặt trời chiếu trực tiếp, diệt vi khuẩn trong canh trùng sau một ngày

Trong tổ chức của động vật bị thối nát, vi khuẩn sống được từ 1-3 tháng, các chất sát trùng

thường diệt khuẩn nhanh chóng: axit phenic 5%, crezil 3%, nước vôi 1%, formol 2%

Vi khuẩn sống lâu và sinh sản trong đất ẩm thiếu ánh sang chúa nhiều muối nitrat và chất

hữu cơ

Trong chuồng nuôi súc vật và trên đồng cỏ vi khuẩn sống hang tháng có khi hang năm

3.Cấu trúc kháng nguyên

Từ 1900 Ligninere bắt đầu nghiên cứu cấu trúc kháng nguyên của Pasteurella Năm 1947

bằng thí nghiệm bảo hộ trên chuột Robert đã phân lập được 4 type P Multocida và kí hiệu

là I, II, III, IV

Năm 1952, Carter đã phát hiện kháng nguyên vỏ đặc hiệu ở những biến chủng dạng S dựa

trên phản ứng kết tủa đã phân loại vi trùng này thành 4 type và kí hiệu là A, B, C, D Về

sau, việc phân lập loại này đều dựa trên phản ứng ngưng kết hồng cầu gián tiếp Carter phát

hiện thêm type E và loại ra type C

Nhiều thí nghiệm đã chứng minh được mối quan hệ giữa hai cách phân type của Robert và

Carter như sau

3.1 Kháng nguyên

Có hai loại kháng nguyên là kháng nguyên K và O Kháng nguyên K chỉ có ở vi khuẩn tạo

dạng khuẩn lạc S không có ở dạng M và R kháng nguyên K nhận được bằng cách cho canh

trùng mới nuôi cấy vào nước sinh lý và chiết xuất trong vòng 30 phút ở 580C Kháng

nguyên K có hai thành phần α và β, chúng được cấu tạo từ protein và polysacharid

Các kháng nguyên khác nữa là kháng nguyên thân kí hiệu là kháng nguyên O Có hai nhóm

kháng nguyên O đặc hiệu và kháng nguyên O không đặc hiệu Theo Carter, các chuẩn có

serotype khác nhau sẽ khác nhau theo kháng nguyên O, chỉ có serotype P hầu như đồng

nhất chỉ tồn tại một nhóm kháng nguyên O Các khuẩn lạc chuyển từ dạng láng sang xù xì

vẫn giữ nguyên kháng nguyên O

3.2 Độc tố

Một trong những tính chất quan trọng của P Multocida là tạo nên quá trình bệnh lý là khả

năng tạo độc lực của vi khuẩn này Những độc tố này là loại độc tố mà cấu trúc hóa học

giống kháng nguyên O và chính nó là hợp chất Lipo-polysacharid có trọng lượng phân tử

cao chứa Nito và Photphat

Lipo-polysacharid của Pasteurella đều độc với thỏ, bê, chuột, gà Chúng có tính gây viêm

sốt và tạo miễn dịch chống vi trùng ở nhiều mức độ khác nhau Gần đây, nhiều công trình

đã xác định rằng Pasteurella sản sinh ra một loài độc tố khác, độc tố này là một loại protein

có hằng số sa lắng là 2.99x103 (trong đệm photphat pH=7 và M-0.6) Việc tạo độc tố được

coi như là một trong những yếu tố đánh giá độc tính của vi khuẩn này Cần chú ý rằng

những chuẩn tụ huyết trùng tạo độc tố cũng thường là nguyên nhân sinh bệnh viêm teo mũi

truyền nhiễm ở lợn Nhiều thực nghiệm đã chứng minh rằng dùng độc tố này của

Pasteurella để chế vacxin phòng chống bệnh viêm teo mũi truyền nhiễm ở lợn có hiệu quả

3.3 Tính bám dính vào mô bào

Gần đây, nhiều nhà nghiên cứu chú ý đến sự khu trú và bám dính vào mô bào của

Pasteurella và coi như một chỉ tiêu quan trọng để giải thích quá trình sinh bệnh của vi

khuẩn tạo huyết trùng

Theo Jacques (1987), phát hiện ra rằng các chủng của cả hai sero type A và D bám vào tế

bào biểu bì của khí quản không được chắc chắn, tuy nhiên chủng tụ huyết trùng thuộc

serotype A bám dính vào phần nhám tế bào biểu bì có lông nhung

Tác giả Pizoan và Trigo (1989) cũng phát hiện các chủng của cả hai serotype A và D đều

bám dính thưa thớt nhưng thấy chủng serotype phần lớn lại bám dính vào tế bào không có

lông rung

4.Cấu trúc phân tử

Do tầm quan trọng của Pasteurella trong bệnh học thú y, người ta đã giải trình tự gen của

vi khuẩn và phân tích được 104 gen có liên quang đến khả năng lây bệnh gắn trên bộ gen

của pasteurella multocida- chiếm 7% trong tổng số trình tự mã hóa của bộ gen chúng ta

cũng đã khám phá ra một vùng dài 2,4kb chứa hai yếu tố gây độc tiềm năng của Pm gồm:

pfhB1(pasteurella filamentous identical B1) và pfhB2 dài lần lược là 7,845 và 11,757 bp và

hầu như có trình tự giống nhau trừ một vùng bị xóa trong trung tâm của trình tự pfhB1 cả

hai yếu tố pfhB1 và pfhB2 chứa một vùng trình tự tương đồng với filamentuos

hemaglutinin (FhaB) của B pertussis (19-21) FhaB chi phối việc bám dình của B pertussis

lên tế bao chủ và là thành phần chủ yếu của vaccine acellular sử dụng cho bảo vệ người

chống lai bệnh ho gà Có rất nhiều ý kiến cho rằng pfhB1 và pfhB2 là thành phần gây độc

chính của pasteurlla Vì nó có các đặc điểm chính sau:

-Thứ nhất đầu amino – terminal của pfhB1 và pfhB2 theo mô hình N(P/Q)NG(I/M) mô

hình này liên quan đến tiến trình sau phiên mã và tín hiệu ngoại bào

-Thứ hai: vùng trung tâm chứa đựng rất nhiều protif cũng là đặt tính của hộ này Sự hiện

diện của những vùng bảo vệ giống với FhaB của B pertussis , cả hai pfhB1 và pfhB2 là

thành phần bám của vi khuẩn lên tế bào chủ

-Thứ ba: đầu tận cùng cacboxy chứa những vùng với độ tương đồng cao(66% aminoacid

giống nhau)tương tự như protein kháng huyết thanh p76 của Haemophilus somnus Khả

năng này giúp cho vi khuẩn tăng khả năng sống xót trong cơ thể vật chủ và như vậy tăng

cường khả năng gây bệnh cho vật chủ

Figure 2

Circular representation of the genome of

Pm, Pm70 The Pm genome and its coding

regions with homologies, the tRNA and

rRNA operons, and the overall G-C content

are presented The outer circle represents the

scale in base pairs with the origin noted The

outer arrows represent the 57 tRNAs and the

inner arrows represent the 6 complete rRNA

operons (16S–23S–5S) The 2,014 potential

coding sequences are represented by colors

depicting homology to both Ec and Hi

(green), Ec alone (purple), Hi alone (light

blue), or to organisms other than Hi or Ec or

unique to Pm (red) The G-C % of each

coding sequence is represented in the

interior circle by different shades of pink in increments of 5%: the lightest pink represents a

G-C % of 25–30% whereas the darkest pink represents 45–50% The figure was generated

by using genescene software (DNAstarMadison, WI)

II.2 VACCINE PHÒNG BỆNH

Để phòng bệnh tụ huyết trùng, hiện nay có rất nhiều loại vaccine khác nhau bao gồm

vaccine truyền thống và vaccine mới sản xuất từ việc ứng dụng kỹ thuật công nghệ sinh

hoc Sau đây chúng ta sẽ tìm hiểu một số loại vaccine này

1 Vaccine truyền thống

a.Vaccine tụ huyết trùng vô hoạt nhũ hóa và keo phèn

Đây là loại vaccine mới có dạng nhũ tương là nước trong dầu(water in oil) nó được hiểu

như sau: sau khi nhũ hóa pha nước và pha dầu gần như hòa tan vào nhau, tao nên cấu trúc

gồm hạt dầu bao quanh hạt kháng nguyên>> chính đặc điểm này mà kháng nguyên tồn tại

lâu trong cơ thể vì có lớp dầu bảo vệ tránh bị enzyme phân hủy, tránh bị đào thải nhanh ra

ngoài cơ thể>> gây kích thích miễn dịch kéo dài

Gần đây một số đọc giả đã chứng minh chủng vaccine FgHC( lợn) và các chủng vaccine

IR, P2O5(trâu,bò) đều thuộc serotype B Từ nghiên cứu trên chủng P2O5 được chọn làm

chủng vaccine nhũ hóa cho cả trâu bò lợn

Hiện nay ứng dụng công nghệ sinh học kháng nguyên tụ huyết trùng trong vaccine nói trên

được chế trong nồi kên men sục khí độ đậm cuả vi khuẩn tăng 20 lần Do đó liều tiêm và

điều kiện giảm hang chục lần

Vật liệu kháng nguyên vỏ của vaccine trong loại này gồm vỏ polysaccharide và những vật

liệu phân lập từ tế bào bởi nhiều phương pháp khác nhau như giết chết vi khuẩn trong sản

xuất vaccine và hệ thống miễn dịch, phân tách bằng dung dịch saline.Tốt nhất là, tuy nhiên,

vật liệu kháng nguyên vỏ bao gồm protein và đặc biệt là lipopolysaccharide hơn nữa là

polysaccharide Nó thì chắc chắn rằng việc thêm protein và lipopolysaccharide thành phần

tế bào trong phân tách capsure làm tăng tính kháng nguyên và khả năng miễn dịch như so

sánh với phân tách capsure chứa đựng chủ yếu chỉ là polysaccharide

Phân tách thành phần vỏ của vi khuẩn theo nhiều cách thích hợp khác nhau như sử dụng

dung dịch thiocyanate, Cetavlon hoặc Cetrimide Protein và lipopolysaccharide sử dụng

trong vaccine thì được xử lý với salicylate eg aqueous sodium salicylate

Trong việc chủng bị vaccine thích hợp cho cơ thể được phát triển hoặc được duy trì,

nguyên liệu kháng nguyên tương ứng đạt được từ cơ thể và được đưa vào vaccine Kháng

nguyên vỏ được đưa vào cơ thể bằng nhiều kỹ thuật thích hợp

Chủng bị một số vaccine :1 nhiệt sinh vật chết toàn bộ (HKO) trong một gel nhôm

hydroxit(Alhydrogel)/nhũ hóa dầu(AO);2 vỏ được phân tách hoàn toàn trong chất bổ trợ

của Freund;3 trích trong cùng một gel nhôm hydroxit (Alhydrogel)- nhũ hóa dầu(AO)

Việc chuẩn bị của 3 vaccine như sau:

Chuẩn bị vaccine

- HKO trong AO

Các sinh vật của P haemolytica serotype A2, chủng FA2 được nuôi cấy, đánh dấu cho sự

tinh khiết và tiêm chủng vào Oxiod No2, cả hai chủng được nuôi ở 370C trong 18h với sự

đảo trộn Tốc độ tăng trưởng là kết quả cho chủng vào 1.5 l Oxiod No2, sau đó ấp trong 6h

trong điều kiện tương tự Tốc độ tăng trưởng được tìm thấy trong một phạm vi 109 sinh vật

trên mỗi ml, xác định bằng phương pháp EEL đo dộ đục Vi khuẩn được thu hoạch bằng ly

tâm ở 4oC trong 20 phút ở 12.000g vi khuẩn này sau đó bị giết bởi xử lý nhiệt ở 60oC trong

16 phút

Nồng đọ tối ưu cho nhiệt giết vi sinh vật cho hấp phụ vào gel nhôm Hydroxit(Alhydrogel,

Miles phòng thí nghiệm, Slough, Anh) được xác định bởi chủng độ theo hướng dẫn của

nhà sản xuất(Miles phòng thí nghiệm, Slough, Anh) Các kháng nguyên này sau đó được

hút bám vào hydroxit nhôm và kết quả thể vẫn được chuyển thành dạng trong một khối

lượng bằng nhau Bayol F(Esso Petroleum, NJ, USA) chứa 10% Aracel A (Sigma Chemical

Co., St Louis, Mo., USA)

- Viên nang chiếc xuất trong AO

Serotype A2, chủng FA2, các vi sinh vật được nuôi và thu hoạch như việc chủng bị cuả

HKO trong AO mô tả ở trên Tuy nhiên, sau khi thu hoạch, các vi khuản lắng xuống thì

được tạo thành dịch huyền phù trong 0,1 natri salicylate trong nước cất đến 1/10 khối lượng

ban đầu sau đó , nuôi có khoáy trộn ở 37oC trong 3h và ly tâm ở 2800g ở 4oC trong 40

phút Phần nổi trên mặt, trong ống thẩm tách, thì được thẩm tách sau đó, chống lại 3 thay

đổi của dung dịch buffered phosphat saline (pH 7,2) ở 4 ° C Qua một khoảng thời gian 48h

và tập trung vào bình ở 37oC Các hoạt động tập trung kháng nguyên có thể được xác định

bởi sự thử nghiệm haemagglutination gián tiếp chống lại một kháng huyết thanh thỏ tiêu

chuẩn cho trường hợp tương đòng serotype cua P haemolytica Các viên nang có thể được

lưu trử và cất giữ ở -20oC

Đối với vaccine HKO nồng đọ tối ưu của kháng nguyên vỏ được xác định bởi chuẩn độ,

các thành phần trích của vỏ hút bám trên Alhydrogel và cố định các kết quả thành dạng sữa

với một khối lượng bằng nhau Bayyol chứa Aracel cung cấp capsure A2 trong AO

vaccine

- Viên nang chiết xuất trong CFA

Viên nang chiếc xuất các loại A2, chủng FA2, các vi sinh vật của P haemolytica được

chuẩn bị như mô tả ở trên Trích lọc nồng độ của capsure A2, ở nồng độ tương tự như trong

viên nang chiếc xuất tại AO vaccine, sau đó kết hợp bởi homogenization trong nước cất

vào CFA(một phần là chất trích vỏ và một phần là chất bổ trợ)

b Vaccine nhược độc

Pasteurella là một vi khuẩn có nhiều biến đổi, không ổn định, chúng có thể chuyển từ dạng

không độc thành dạng độc và ngược lại do vậy việc dùng vaccine nhược độc có rất nhiều

rủi ro, có thể là đem gieo rắc mầm bệnh, làm cho việc phòng chống bệnh càng trở nên phức

tạp Rất khó tạo vùng an toàn sau khi sử dụng vaccine nhược độc Vaccine nhược độc chỉ

được sử dụng trong tình trạng cấp bách như tiêm vào ổ dịch đã xuất hiện

2 Những hướng mới trong sản xuất vaccine

Bệnh do loài Pasteurella là nguyên nhân gây thiệt hại kinh tế quan trọng trên toàn thế giới

Những vi khuẩn này hoạt động như thứ cấp và sơ cấp mầm bệnh và gây ra một phổ rộng

các dịch bệnh, gọi chung là pasteurellosis và từ nhiễm trùng huyết đến viêm phổi

Pasteurella multocida được công nhận là một mầm bệnh thú y quan trọng Tên Serotype

được dựa trên capsular kết hợp kháng nguyên-kháng nguyên somatic (capsular kháng

nguyên A đến F và kháng nguyên soma 1-16) Một số serotypes của P multocida gây

nhiễm trùng huyết xuất huyết (HS), một bệnh gia súc và trâu với tỷ lệ tử vong cao và ảnh

hưởng kinh tế có ý nghĩa tại Châu Á và Châu Phi Tại Nam Á,chiếm ưu thế serotype B: 2

(36) HS là một pasteurellosis chính đặc trưng bởi ga nhiễm trùng huyết và là khác biệt từ

pasteurelloses khác, trong đó P multocida có thể chỉ có một vai trò phụ Cái các yếu tố độc

tính của P multocida chịu trách nhiệm cho HS đã không được xác định, và các kháng

nguyên chịu trách nhiệm về miễn dịch tự nhiên là chưa biết Một số kiểm soát là đạt được

với vaccine phèn-tủa hoặc vaccine nhũ hóa giết chết tế bào tiêm dưới da(sc), nhưng các vắc

xin có bất lợi của cung cấp miễn dịch chỉ ngắn hạn-(7) và yêu cầu hàng năm quản lý cho

hiệu quả (10) Vắc xin nhũ hóa dầu có những bất lợi nhất của độ nhớt cao, mà làm cho họ

không được ưa chuộng trong những người dùng trường, mặc dù được cải thiện

Đáng kể là hiệu ứng mạnh mẽ của các lưu trữ trên những tiềm năng của phèn các-tủa

nhiễm trùng máu xuất huyết (APHS) Thuốc chủng ngừa được báo cáo.chủng ngừa APHS,

các nhà khoa học thong qua các nhiễm trùng thánh thức của thỏ tiêm(pót 60 ngày kể từ

ngày tiêm phòng),cho thấy hiệu lực 100% khi được lưu trử ở 4oC trong 30 ngày Và hiệu

lực giảm xuống 20% khi thời gian lưu trữ được mở roongjdeends 60 hoặc nhiều ngày Ở

30oC, hiệu lực giảm 40, 40 và 60 tương ứng sau 30,60,90 ngày lưu trữ Trong khi đó ở 37

oC , hiệu lực giảm 60, 60 à 100% sau 30,60 và 90 ngày kể từ ngày lưu trũ tương ứng theo

quan điểm này, vaccine nhũ hóa HS, vaccine được phát trienr bởi nuôi Pasteurella

multocida trong môi trường gồm men, sucrose, trypticase và bicarbonate natri, thong khí

liên tục ơ 37oC Điều nầy đã đưa ra một số vi khuẩn tốt hơn nhiều(số tối đa 15x108/ml) hơn

vaccine APHS thường tiêm ( ttoois đa 6x108/ml) Các vaccine OAHS nhũ tương dầu vẫn

ổn định ở nhiệt độ phòng trong một năm Nhật ký bảo vệ các giá trị của hai loại vaccine

OAHS, nghiên cứu ở chuột, đã được 5,2 và 5,3 so với 1.9 của vaccine APHS

Hiện nay, trong nước cũng như trên thế giới sử dụng vaccine vô hoạt nhũ hóa dầu để phòng

bệnh về pasteurella

Tuy nhiên với sự phát triển của kỹ thuật công nghệ sinh học, các nhà nghiên cứu đang khảo

nghiệm một số loại vaccine được sản xuất theo phương pháp mới Sau đây là một số đề

xuất

*** Nghiên cứu sử dụng gen Pasteurella lipoprotein E như một kháng nguyên trong

vaccine Họ tiến hành tái tổ hợp gen này vào E.coli Ecoli tổng hợp protein do gen này qui

định và được phân tách để làm vaccine

Trong một khía cạnh, phát minh hiện nay cung cấp một chủng ngừa tiểu đơn vị để bảo vệ

động vật từ bệnh do P multocida, được đặc trưng bởi bao gồm Pasteurella lipoprotein E

(PlpE) như kháng nguyên, và một tá dược thú y chấp nhận được.Trong một cách hiểu nào

đó pasteurella lipoprotein E là một protein có trình tự axid amin được liệt kê SEQ ID

EF219452-EF219457 (SEQ ID No 1-6) hay axit amin với một trình tự tường đồng của hơn

90% các axit amin trình tự như được liệt kê trong SEQ ID EF219452-EF219457 (SEQ ID

No 1-6)

Trong một khía cạnh khác, phát minh hiện nay cung cấp một sử dụng E lipoprotein

Pasteurella trong việc kiểm soát các bệnh lây nhiễm gây ra bởi P multocida, hoặc các rối

loạn liên quan đó

Tóm tắt nghiên cứu như sau:

Gen mã hóa lipoprotein E ở P multicoda(plpE) và lipoprotein B(plpB) được tạo dòng từ p

multicoda chủng X- 73 serotype A:1 và được biểu hiện vào E.coli Miễn dịch bảo vệ nhận

được bởi PlpE tái tổ hợp(rPlpE) và PlpB tái tổ hợp(rPlpB) có giá trị trên chuột và gà Kết

quả cho thấy, đáp ứng miễn dịch ở chuột với 10g rPlpE tinh khiết thì được bảo

vệ(80-100%)kháng lại yếu tố gây nhiễm với 10 hoặc 20 LD50 P multicoda chủng X73 ( serotype

A:1), P-1059(serotype A:3) và P-1662(serotype A:4) Trong nghiên cứu này không có đáp

ứng miễn dịch ở chuột với rPlpB không được bảo vệ ở gà, đáp ứng miễn dịch với 100g

rplpE tinh khiết bảo vệ 63-100% kháng lại yếu tố gây nhiễm với chủng X-73 và P-1662

ngược lại với rplpB thì không Phân tích trình tự cho thấy plpE khác nhau ở các chủng

P.multicoda biểu hiện 90,8-100% tương đồng

Ví dụ:

Chuẩn bị tái tổ hợp Lipoprotein E (r-PlpE) của P multocida trong E coli

(1) Giống vi khuẩn và sự phân lập DNA bộ gen của P multocida

P multocida chủng chuẩn X-73 (A:1), P-1059(ATCC 15742) (A:3), và P-1662 (A:4) được

nuôi ở 37oC trong não tâm huyền (BHI) canh(Difco phòng thí nghiệm, MI, Hoa Kỳ) trong

vòng 18-24h.DNA bộ gên thì được phân lập bằng sử dụng kit DNeasy tissue(Qiagen,

Hilden, Germany)

(2) tạo dòng gen và vector biểu hiện xây dựng lipoprotein E tái tổ hợp từ chủng P

multocida X-73 Các gen khuếch đại sau đó đã được sử dụng để thể hiện PlpE tái tổ

hợp(r-PlpE) trong E.coli trình tự mồi P1/P2 như sau: P1: 5'-CCA TGG GCA TGA AAT TAA

CAA AAC TTT T-3', and P2: 5' AAG CTT CCA ACC TTT AAC TAC ACC ACC-3' P1:

5'-CCA TGG GCA TGA AAT TAA CAA AAC TTT T-3 ', và P2: 5' AAG CTT CCA ACC