THIẾT bị máy móc TRONG KIỂM NGHIỆM

HPLC1.1 Định nghĩa • Tách hỗn hợp trên cột được nhồi hạt pha tĩnh có d ≤ 10 µm • Sử dụng bơm có áp suất cao gần 400 atm để đẩy pha động qua cột sắc ký • Tốc độ dòng khoảng vài ml/phút •

THIẾT BỊ MÁY MÓC

Học phần: Kiểm nghiệm dược phẩm

Drugs quality control

Chương trình Dược sĩ Đại học Buổi 14 – 3 tiết

GV: Lê Minh Trân

Năm học 2020 - 2021

NỘI DUNG BÀI HỌC

HPLC

UV-Vis

IRAAS, AES

1 HPLC

1.1 Định nghĩa

• Tách hỗn hợp trên cột được nhồi hạt pha tĩnh có d ≤ 10 µm

• Sử dụng bơm có áp suất cao gần 400 atm để đẩy pha động qua cột sắc ký

• Tốc độ dòng khoảng vài ml/phút

• Phân giải nhanh một lượng mẫu nhỏ cỡ 20 µg

• Thích hợp với các hợp chất không bay hơi và bền với nhiệt

• Độ nhạy cao, kết quả chính xác và lặp lại

1 HPLC1.1 Định nghĩa

1 HPLC1.1 Định nghĩa

1 HPLC1.2 Phân loại

Dựa vào cơ chế tách chiết phương pháp SKLHNC được chia làm 4 loại:

- Sắc ký phân bố (partition chromatography)

- Sắc ký hấp phụ hay sắc ký lỏng rắn (adsorption/liquid

chromatography)

- Sắc ký ion (ion chromatography)

- Sắc ký rây phân tử (size exclusion/gel permeation

1 HPLC1.2 Phân loại

SKPB: chia thành hai loại dựa trên độ phân cực tương đối giữa pha tĩnh và pha động:

- SK pha thường (Normal phase chromatography):

• Pha tĩnh: phân cực Pha động: DM hữu cơ ít phân cực

• Dùng để tách và phân tích các hợp chất có độ phân cực cao với phân tử lượng không lớn lắm

- Sắc ký pha đảo (Reversed phase chromatography):

• Pha tĩnh: là những chất lỏng ít phân cực (hydrocarbon…) Pha động: là DM phân cực (nước, methanol, acetonitrile…)

• Hầu hết các hợp chất hữu cơ có mạch carbon dài (ít phân cực) rất thích hợp cho phân tích bằng RP

• RP được ứng dụng nhiều và phổ biến hơn NP

1 HPLC1.3 Trang thiết bị

1 HPLC1.3 Trang thiết bị

1.3.1 Bình chứa dung môi

Thủy tinh màu, trung tính, 100 – 2000 ml, kín (tránh bay hơi dung môi)

- Xử lý dung môi: lọc qua màng lọc 0,45 um hoặc 0,22 um và đuổi khí hòa tan

- Vật liệu lọc:

+ Nước: cellulose nitrat, cellulose acetat+ Hỗn hợp dung môi hữu cơ và nước: màng lọc RC(regenerated cellulose), polyamid hay nylon

+ Dung môi hữu cơ: màng lọc teflon

1 HPLC

1.3 Trang thiết bị

1.3.2 Bộ phận khử khí dung môi

- Siêu âm: đuổi khí thừa khỏi dung môi

- Sục khí trơ (helium): đuổi khí hòa tan khỏi dung môi

- Khử khí ngay trên dòng (on-line membrane degassing)

1 HPLC

1.3 Trang thiết bị

1.3.3 Rửa giải isocratic và gradient

- Đẳng dòng: thành phần pha động không thay đổi trong quá trình sắc ký

- Gradient: thành phần pha động thay đổi trong quá trình sắc kýtheo chương trình dung môi

-1 HPLC1.3 Trang thiết bị

Rửa giải gradient

1 HPLC

1.3 Trang thiết bị

1.3.4 Hệ thống bơm

- Áp suất đầu vào: > 5000 psi Áp suất tối đa khoảng 6000 psi

- Đảm bảo lưu lượng lặp lại: 0,01 – 10,00 ml/phút

- Không bị ăn mòn bởi dung môi, không gây biến tính protein (sử dụng vật

liệu tương hợp sinh học như titan)

1 HPLC1.3 Trang thiết bị

1.3.5 Dung môi

1 HPLC1.3 Trang thiết bị

1.3.6 Bộ phận tiêm mẫu

• Dùng syringe trực tiếp

• Dùng van bơm với thể tích xác định (loop)

• Bộ phận bơm mẫu tự động auto - sampler

1 HPLC1.3 Trang thiết bị

• SK lỏng – lỏng: bảo hòa pha động với pha

tĩnh làm tối thiểu hóa sự mất dung môi

1 HPLC1.3 Trang thiết bị

1 HPLC1.3 Trang thiết bị

• Khoảng hoạt động tuyến tính rộng

• Ít thay đổi theo nhiệt độ và tốc độ dòng

1 HPLC1.3 Trang thiết bị

1.3.9 Đầu dò (Detector)

• Detector hấp thụ UV-Vis

• Detector huỳnh quang

• Detector chỉ số khúc xạ

• Detector tán xạ ánh sáng bay hơi

• Detector điện hóa

• Detector phổ khối…

1 HPLC1.3 Trang thiết bị

1.3.9 Đầu dò (Detector)

1 HPLC1.3 Trang thiết bị

1 HPLC1.3 Trang thiết bị

1.3.10 Các thông số đặc trưng

Thời gian lưu

• Thời gian lưu tR (phút): thời gian cần thiết để một chất di

chuyển từ nơi tiêm mẫu qua cột sắc ký, tới detector và cho pic trên sắc ký đồ (tính từ lúc tiêm đến lúc xuất hiện đỉnh của pic)

• tM (hoặc to ): thời gian lưu của một chất không bị lưu giữ,

còn gọi là thời gian chết

• tR càng lớn, chất tan bị lưu giữ càng mạnh và tốc độ di

chuyển của nó càng nhỏ

• Thời gian lưu hiệu chỉnh

t'R được tính theo công thức:

t'R = tR - tM

1 HPLC1.3 Trang thiết bị

1 HPLC1.3 Trang thiết bị

1.3.10 Các thông số đặc trưng

1 HPLC1.3 Trang thiết bị

1.3.10 Các thông số đặc trưng

Độ phân giải

• Rs = 0,75: hai pic không tách

tốt, còn xen phủ nhau nhiều

• Rs = 1,0 : hai pic tách khá tốt,

còn xen phủ nhau 4%

• Rs = 1,5 : hai pic tách hoàn

toàn (chỉ xen phủ 0,3%)

1 HPLC1.3 Trang thiết bị

1.3.11 Ứng dụng

• Định tính : so sánh thời gian lưu

• Định lượng: dựa trên sự so sánh chiều cao hoặc diện tích pic trong mẫu thử với một hay nhiều mẫu chuẩn

• ĐL có chuẩn: so sánh với 1 chuẩn và dùng phương pháp

đường chuẩn

• ĐL không có chuẩn: so sánh theo % diện tích pic

2 UV-Vis

2 UV-Vis2.1 Phạm vi phổ

• Vùng tử ngoại chân không (UV xa) = 50 - 200nm ít được sử dụng vì:

+ có năng lượng khá lớn, khi va chạm gây vỡ liên kết / phân tử

+ bị hấp thụ̣̣̣ mạnh bởi hầu hết dung môi và oxy / không khí+ bị hấp thụ̣̣̣ bởi thạch anh

• Vùng tử ngoại gần (UV gần) λ = 200 - 375 nm

• Vùng khả kiến (Vis) : λ = 375 - 800 nm

2 UV-Vis2.1 Phạm vi phổ

2 UV-Vis

2.2 Màu sắc

Màu của 1 chất liên quan với sự hấp thụ̣̣̣ và phản xạ của 1 chất.Mắt người nhìn thấy màu bổ trợ cho màu hấp thụ̣̣̣

2 UV-Vis2.3 Cấu tạo máy

Sơ đồ máy UV -Vis

1: đèn nguồn 2: cách tử hay lăng kính

3: cốc chứa dung dịch đo 4: Bộ phận phát hiện (tế́ bàoquang điện) ;

5+ 6: bộ̣ phận khuếch đại và máy ghi tín hiệu

2 UV-Vis2.3 Cấu tạo máy

Máy 2 chùm tia

2 UV-Vis2.3 Cấu tạo máy

Đèn nguồn

• Đèn Deuterium sử dụng cho vùng UV vì

vùng Vis bị nhiễu nhiều

Half – life 1.000 giờ

• Đèn Tungsten sử dụng cho vùng Vis vì có

cường độ cao / vùng này

Half – life 10.000 giờ

2 UV-Vis2.3 Cấu tạo máy

Cốc đo

• Cốc đo có thể làm bằng thạch anh, plastic hay thuỷ tinh

• Thạch anh: có thể sử dụng đo trong vùng 200-700nm

• Thuỷ tinh và plastic: thích hợp cho vùng khả kiến

2 UV-Vis2.3 Cấu tạo máy

Detector ống nhân quang

2 UV-Vis2.3 Cấu tạo máy

Detector dải diod quang

2 UV-Vis2.4 Ứng dụng

2 UV-Vis2.4 Ứng dụng

2 UV-Vis2.4 Ứng dụng

Phải thực hiện đúng theo các điều kiện đã ghi / tài liệu về

dung môi, nồng độ, loại máy

2 UV-Vis2.4 Ứng dụng

Cân chính xác 0,002g chế phẩm, cho vào một bình định mức

50ml, thêm nước tới vạch, lắc đều cho tan (nồng độ pha xấp xỉ 40 microgam/ml) Độ hấp thu A = 0,787 ở max = 361nm (cốc đo l

=1cm) Hãy xác định nồng độ của B12 Biết 𝐸1𝑐𝑚1% = 207 tại 361nm

2 UV-Vis2.4 Ứng dụng

Định lượng – 1 thành phần

B Phương pháp sử dụng hệ số hấp thụ mol ԑ của một chất

• Pha mẫu chuẩn có nồng độ chính xác Cc rồi đo độ hấp thụ

Ac trên máy tại bước sóng của đỉnh có độ hấp thụ cao nhất trong các đỉnh cực đại với cốc đo dày 1 cm

• Dựa theo định luật Lambert-Beer, tính є rồi suy ra nồng độ mẫu thử Ct (mol/lit)

2 UV-Vis2.4 Ứng dụng

Định lượng – 1 thành phần

C Phương pháp so sánh độ hấp thụ̣ (có chất chuẩn)

- Pha mẫu chuẩn có nồng độ̣ chính xác Cc trong dung môi

thích hợp

- Pha dung dịch mẫu thử có nồng độ̣ Ct, trong cùng dung môi

So sánh độ̣ hấp thụ̣̣̣̣̣ (At) của dung dịch thử nghiệm có nồng độ̣ (Ct) với độ̣ hấp thụ Ac của dung dịch chuẩn có nồng độ̣ biếttrước (Cc)

Cc A

A C

C

C A

A

c

t t

2 UV-Vis2.4 Ứng dụng

• Lần lượt xác định A1, A2, A3, A4 An ở max

• Vẽ đồ thị̣ với trục tung là (A), trục hoành là (C)

• Xác định y = ax + b với R2 = 0,99

• Đo Ax của dd cần khảo sát

rồi căn cứ vào đồ thị̣ tìm Cx

• (Cx phải nằm trong khoảng

C1 – Cn khảo sát)

2 UV-Vis2.4 Ứng dụng

Định lượng – hỗn hợp nhiều thành phần

Sự chồng phổ: ở một bước sóng xác định thì độ hấp thụ củanhiều hợp chất có mặt trong một hỗn hợp bằng tổng độ hấp thụcủa mỗi thành phần

2 UV-Vis2.4 Ứng dụng

Định lượng – hỗn hợp nhiều thành phần

Sự chồng phổ: ở một bước sóng xác định thì độ hấp thụ củanhiều hợp chất có mặt trong một hỗn hợp bằng tổng độ hấp thụcủa mỗi thành phần

Điều kiện sử dụng luật cộng tính mật độ quang: λmax của chúngcách nhau một khoảng ≥ 10nm

2 UV-Vis2.4 Ứng dụng

Định lượng – hỗn hợp nhiều thành phần

Tiến hành:

- Quét phổ UV-vis riêng rẽ của 2 chất chuẩn X và Y

- Chọn 2 cực đại λmax1 và λmax2 đặc trưng của 2 chất chuẩn X

và Y

- Đo riêng A từng chất chuẩn để xác định 𝜀𝑥1, 𝜀𝑦1, 𝜀𝑥2, 𝜀𝑦2

- Đo A của dd hỗn hợp ở λmax1 và λmax2 của các thành phần với cốc đo dày 1cm

3 IR

Phổ IR là tập hợp các vân phổ biểu diễn sự phụ thuộc độ truyềnqua T% vào số sóng

3 IR3.1 Máy quang phổ hồng ngoại tán sắc

3 IR3.1 Máy quang phổ hồng ngoại tán sắc

Đèn nguồn

• Đèn Nernst: là ống dài 2-5 cm, f = 1-3 mm, bằng oxid đất

hiếm như oxid zirconium (ZrO2) và oxid yttrium (Y2O3) đượcđốt nóng bằng điện trở đến 1.800 °K (~1.500 °C)

• Đèn Globar: là ống dài 4-6 cm, f = 4-6 mm làm bằng carbursilic được đốt nóng bằng điện trở đến 1300 °C

• Hiện nay còn dùng đèn Ni-Cr đốt nóng đến 800 °C

3 IR3.1 Máy quang phổ hồng ngoại tán sắc

Hệ thống quang học

• Gương phản xa, gương quay bán trong suốt (để ngắt tia sáng

từ nguồn qua mẫu đo và mẫu so sánh theo chu kỳ quay) và lăng kính hay cách tử phản xa

• Lăng kính chế tạo từ những tinh thể muối như LiF, CaF2, KBr, NaCl Các lăng kính này dễ hút ẩm nên buồng tối phải được bảo quản khô tuyệt đối

3 IR3.1 Máy quang phổ hồng ngoại tán sắc

Bộ phận phát hiện

• Bộ phận phát hiện cảm ứng nhiệt như: cặp nhiệt điện hoặccác pin nhiệt – điện, chuyển đổi tín hiệu quang năng (tia IRchưa bị hấp thu và đã bị hấp thu) thành tính hiệu điện năng,sau đó được khuếch đại và tác động lên bộ ghi tín hiệu đểnhận được phổ hồng ngoại

• Máy thường được kiểm tra số sóng và độ phân giải bằngmàng polystyren

3 IR3.2 Máy quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourrier

3 IR3.3 So sánh

IR TÁN SẮC

• Đo mỗi tần số ở mỗi thời

điểm khác nhau (thời gian đo

phổ kéo dài hàng phút)

• Hệ thống cơ học phức tạp

• Hạn chế về độ nhạy

• Yêu cầu có chuẩn ngoại

• Chịu ảnh hưởng của ánh

sáng lạc

FT-IR

• Tất cả các tần số được đo cùng một lúc (thời gian đo phổ nhanh)

• Tốc độ,độ phân giải cao,

độ nhạy tăng hơn so với máy quang phổ tán sắc

• Không bị ảnh hưởng bởi ánh sáng lạc

• Ngày càng được dùng rộng rãi trong các PTN

3 IR3.4 Phân vùng phổ IR

Vùng nhóm chức = 4000 – 1300 cm-1

Chứa các vân hấp thu của hầu hết các dao động co dãn của các nhóm chức như : -OH, >NH, -C=O-, >C=N-, >C=C

Vùng dấu vân tay (Vùng điểm chỉ) = 1300 - 910 cm-1

• Các vân hấp thu của dao động biến dạng của các liên kết C-H, C-C, …

• Các dao động co dãn của các liên kết đơn C-C, C-N, C-O

• Sự tương tác giữa các dao động này dẫn đến một dao động

«khung» đặc trưng cho dao động của toàn phân tử

3 IR3.4 Phân vùng phổ IR

Vùng “nhân thơm”: 910 - 650 cm-1

Chứa các vân hấp thu của dao động biến dạng ngoài mặt

phẳng của liên kết C-H trong nhân thơm

• Nhân thơm thế Ortho: 735 - 770 cm-1

• Nhân thơm thế Para: 800 – 860 cm-1

3 IR3.5 Biện giải phổ IR

3 IR3.5 Biện giải phổ IR

3 IR3.5 Biện giải phổ IR

4 QUANG PHỔ HẤP THỤ NGUYÊN TỬ

(A.A.S - Atomic absorption spectrophotometry)

4 AAS4.1 Nguyên tắc

Quang phổ hấp thu nguyên tử là máy đo cường độ tia cộng hưởng của đèn cathod lõm sau khi tia này đi qua mẫu trắng không chứa hơi nguyên tử tự do và đi qua mẫu thử chứa hơi nguyên tử tự do

4 AAS4.1 Nguyên tắc

Phổ hấp thu nguyên tử (Atomic absorption spectrometry –

A.A.S.) có 2 qúa trình xảy ra :

• Nguyên tử hóa mẫu: là qúa trình động liên tiếp xảy ra và

đồng thời

• Hấp thu: các nguyên tử tự do ở trạng thái năng lượng cơ

bản M0 hấp thu tia cộng hưởng phát ra từ nguồn cung cấp(đèn cathod lõm) để chuyển lên trạng thái năng lượng kíchthích

Cường độ tia cộng hưởng bị hấp thu bởi nguyên tử tỉ lệ với mật

độ hơi của nguyên tử tự do hay tỉ lệ với nồng độ nguyên tử có

mẫu

4 AAS4.2 Máy quang phổ HTNT

4 AAS4.2 Máy quang phổ HTNT

4 AAS4.2 Máy quang phổ HTNT

4.2.1 Nguồn bức xạ tia cộng hưởng

4.2.1 Đèn cathod lõm

 Vỏ bọc bằng thủy tinh hàn gắn với một cửa sổ bằng thạch anh (Quartz ), bên trong được nạp khí Ar ở áp suất thấp Cathod hình trụ lõm, được tráng bên trong bằng một lớp kim loại của chính nguyên tố cần định lượng

4 AAS4.2 Máy quang phổ HTNT

4.2.1 Nguồn bức xạ tia cộng hưởng

4.2.1 Đèn cathod lõm

• Khi đặt một điện thế đủ mạnh vào cathod và anod, khí Argon

bị ion hóa thành cation và được gia tốc để va đập vào cathod(nhờ hình dạng lõm) làm bật ra các nguyên tử kim loại dướidạng tự do

• Các nguyên tử kim loại tự do này lại tiếp tục va chạm với cáccation Ar+ nhận năng lượng và chuyển lên trạng thái nănglượng kích thích

• Khi trở về trạng thái năng lượng cơ bản chúng phát xạ ánhsáng chính là tia cộng hưởng của nó

4 AAS4.2 Máy quang phổ HTNT

4.2.1 Nguồn bức xạ tia cộng hưởng

4.2.2 Đèn phóng điện không điện cực

• Về cấu tạo, đèn EDL thực chất cũng là một ống phóng điệntrong môi trường khí kém (trong đèn EDL cũng phải hút hếtkhông khí và nạp thay vào đó là một khí trơ Al, He hay Nitơ

4 AAS4.2 Máy quang phổ HTNT

4.2.1 Nguồn bức xạ tia cộng hưởng

4.2.2 Đèn phóng điện không điện cực

• Khi đèn làm việc, dưới tác dụng của năng lượng cao tần cảmứng đèn được nung nóng đỏ, kim loại hay muối kim loạitrong đèn được hóa hơi và bị nguyên tử hóa Các nguyên tử

tự do được sinh ra sẽ bị kích thích và phát ra phổ phát xạcủa nó trong điều kiện khí kém dưới tác dụng nhiệt khi đènlàm việc Đó chính là phổ vạch của kim loại chứa trong đènEDL

• Ngoài ưu điểm về độ nhạy và giới hạn phát hiện, đèn EDLcủa các á kim hay bán á kim thường có độ bền cao hơn đènHCL Đồng thời vùng tuyến tính của phép đo một nguyên tốkhi dùng đèn EDL thường rộng hơn so với việc dùng đènHCL

4 AAS4.2 Máy quang phổ HTNT

4.2.2 Bộ hóa hơi nguyên tử

• Có bộ phận phun sương để tạo hạt aerosol của mẫu

• Hạt aerosol phải đồng đều về kích thước để khi tiếp xúc vớingọn lửa hay lò nung ta có được đám mây hơi nguyên tử cómật độ đồng đều

• Nguồn hoá hơi nguyên tử dùng ngọn lửa (hỗn hợp khí đốt +oxy)

• Hoạt động của bộ hoá hơi nguyên tử phải ổn định, dễ vệ sinh,

dễ hiệu chỉnh

4 AAS4.2 Máy quang phổ HTNT

4.2.2 Bộ hóa hơi nguyên tử

a) Dùng ngọn lửa

• Khí đốt : butan, propan,

acetylen, hay hỗn hợp khí oxy hóa : không khí, oxy + protozooxid (N2O)

• Ngọn lửa là một dãi dài 10 cm,

hay thành ngọn lửa vòng tròn, chiều cao 5cm

4 AAS4.2 Máy quang phổ HTNT

4.2.2 Bộ hóa hơi nguyên tử

b) Dùng lò graphit

• Lò nung làm bằng carbon graphit, được đốt nóng bằng điện đến 3.000 °C

• Lò được đặt trên đường

đi của tia công hưởng

Hai đầu có cửa sổ thạch anh cho phép ánh sáng

đi qua được Lượng mẫu bơm vào lổ ở giữa lò là 1- 100 µl (so với ngọn lửa phải cần tới 1- 2ml)

4 AAS4.3 Sự nhiễu

Trong AAS có ba hiện tượng nhiễu (hiệu ứng tiếng ồn –noise) thường xảy ra ảnh hưởng đến độ hấp thu củanguyên tử

+ Nhiễu hóa học: do mẫu phân ly không hoàn toàn

+ Nhiễu do mạng phân tử (môi trường chứa nguyên tố cầnđịnh lượng là huyết tương, máu, dung môi …)

+ Nhiễu do hấp thu không chuyên biệt (hiệu ứng nền) : tiacộng hưởng từ đèn nguồn đã sai lệch (đèn cathod hết tuổithọ)

4 AAS4.4 Ứng dụng

• Định lượng kim loại trong mẫu thử

• 200 mẫu / giờ

• Giới hạn phát hiện: 0,001 – 0,02 ppm

• Mẫu đo: dung dịch, hỗn dịch

• Dùng nhiều trong ngành thực phẩm, môi trường, dược phẩm…

• Ưu điểm:

Độ nhạy cao, có thể phân tích tới ppb

Có thể phân tích được nhiều nguyên tố kim loại

• Nhược điểm:

Máy móc đắt tiền

Cần kỹ thuật viên được đào tạo bài bản

Dễ sai sót trong quá trình thực hiện

4 AAS4.4 Ứng dụng

tia cộng hưởng của nguyên tử đó

4 AAS4.4 Ứng dụng

tia cộng hưởng của nguyên tử đó

5 QUANG PHỔ PHÁT XẠ NGUYÊN TỬ (AES)5.1 Quang kế ngọn lửa