Chương 6: SỰ CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT pptx

ĐẶC ĐIỂM BỘ MÁY DI TRUYỀN CỦA Tế bào thực vật có tính toàn thế Tính toàn thế ở tế bào thực vật được ứng dụng nhằm mục đích tái sinh, nhân nhanh các giống cây chuyển gen... ĐẶC ĐIỂM BỘ MÁ

Chương 6:

SỰ CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT

GENOM Ở THỰC VẬT BẬC CAO

ĐẶC ĐIỂM BỘ MÁY DI TRUYỀN CỦA

Tế bào thực vật có tính toàn thế Tính toàn thế ở tế bào thực vật được ứng dụng nhằm mục đích tái sinh, nhân nhanh các giống cây chuyển gen.

ĐẶC ĐIỂM BỘ MÁY DI TRUYỀN CỦA

TẾ BÀO THỰC VẬT

Tế bào thực vật có bộ máy di truyền phức tạp

- ADN thực vật chứa cả những đoạn mã hóa và những đoạn không mã hóa

- Có sự lặp đi lặp lại nhiều lần của một đoạn

- Cơ chế biểu hiện gen đa dạng phức tạp, đóng vai trò rất quan trọng trong công nghệ gen thực vật

- Có sự hiện diện của các gen nhảy trong quá trình phát triển

SINH TRƯỞNG VÀ SINH SẢN CỦA

TẾ BÀO THỰC VẬT

Sinh trưởng

Nguyên phân Giảm phân

Sinh sản

Hữu tính: đa dạng sinh học

Vô tính: tạo dòng thuần

- Có sự tham gia của các phức

hệ enzyme: helicaza, Primosome,

các enzym ADN polimeraza I và

II, ATPaza, topoisomeraza

SỰ THỂ HIỆN CỦA GEN – PHIÊN MÃ

ARN - polimeraza II có vai trò phiên mã các mARN

ARN - polimeraza III có vai trò tổng hợp các tARN và rARN 5S

Các nhân tố điều chỉnh:

Protein và các acid

TÍNH BẢO THỦ CỦA GEN VỀ DI TRUYỀN

VÀ NHỮNG BIẾN DỊ

- Sự xâm nhập của các DNA ngoại lai

- Sự chuyển dịch các gen.

- Sự chuyển dịch của lục lạp và ty thể vào nhân bào

Các tính trạng thực vật là biểu

hiện của các gen di truyền

Cơ chế sinh tổng hợp DNA đảm bảo tính bảo thủ của gen, ổn định di truyền

qua các thế hệ

Nguyên nhân biến

dị ở thực vật

KỸ THUẬT GEN

Ở THỰC VẬT BẬC CAO

KỸ THUẬT XÁC ĐỊNH VÀ DÒNG HÓA GEN

Nhận diện tế bào chủ chứa đoạn DNA tái tổ hợp

Chiết xuất và tinh sạch DNA

Cắt DNA Nối các đoạn DNA

Chuyển DNA vào tế bào chủ

Phân tích các phân đoạn DNA

Phân tích các phân đoạn DNA

1 CHIẾT XUẤT VÀ TINH SẠCH DNA

Kiểm tra và lưu trữ DNA

Chuẩn bị mẫu

Phá vỡ tế bào

Hòa tan ADN

Loại bỏ các thành phần không phải là ADN

Tủa ADN

Rửa DNA

Làm khô

Ethidium bromide; Isopropanol; SDS 10%;

Extraction buffer: 0.1M Tris.HCl (pH 8); 0.5M NaCl;

0.05M EDTA (pH 8); 0.01% β-mercaptho ethanol;

CTAB buffer: 0.02M Tris.HCl (pH 7.5); 2M NaCl;

- Kéo cắt mẫu, chày và cối nghiền mẫu.

Ví dụ: Chiết xuất và tinh sạch DNA từ lá chanh

4 Phương pháp thực hiên:

- Chuẩn bị mẫu: Mẫu lá sau khi được lau cồn, cắt bỏ

gân lá, thịt lá (1g) được nghiền trong nitơ lỏng.

Thêm 40ml Chloroform, lắc đều, li tâm

13000rpm, 5 phút, hút 20ml dịch trong lớp trên, thêm 0.5ml ethanol 96 0 ủ ở nhiệt độ phòng, 15 phút

Sau thời gian ủ, dịch ủ được li tâm 13000rpm, 10 phút, thu tủa, li tâm 13000rpm, 5 phút với ethanol

70 0 2 lần, sau đó, loại bỏ ethanol và phơi khô DNA qua đêm ở nhiệt độ phòng

DNA sau khi phơi khô, được hòa tan trong 50ml nước và tiến hành kiểm tra độ tinh sạch DNA

Ví dụ: Chiết xuất và tinh sạch DNA từ lá chanh

KIỂM TRA CÁC PHÂN ĐOẠN DNA

vị trí khác nhau trên các bản gel khi ở trong điện trường

OD 260nm

= 1.8 – 2 : dung dịch DNA sạch

OD 280nm

- Chuẩn bị bản gel agarose và

dung dịch điện di.

- Lắp đặt bản gel

- Pha mẫu DNA cần điện di với

dung dịch màu tải mẫu (30%

glycerol, 0,25% bromophenol

blue và 0,25% xylencyanol)

- Tiêm dịch DNA.

- Thực hiện điện di

- Kiểm tra band DNA

- Kết thúc điện di khi band DNA

cách mép dưới bản gel 0,5 cm

- Thu hồi DNA.

Ví dụ: Điện di agarose

2 CẮT DNA

Enzyme giới hạn (restriction enzyme – RE) là enzyme cắt DNA,

có thể phân huỷ liên kết

phosphodieste của bộ khung DNA

mạch đôi mà không gây tổn hại đến

2 CẮT DNA

- Enzyme cắt giới hạn hoạt động tối ưu trong

những điều kiện khác nhau.

- Các phản ứng cắt chỉ thực hiện với một lượng

DNA tối thiểu trong một thể tích tối thiểu.

- Kết quả cắt phụ thuộc độ tinh sạch DNA

- Enzyme cắt giới hạn được lưu trữ ở -20 0 C.

Hòa 1mg DNA trong 17ml nước cất 2 lần và 2ml đệm phản ứng, vortex, bổ sung 1đơn vị RE, lắc đều, ủ

ở nhiệt độ và thời gian thích hợp

VD: EcoRi : 60 phút, 370C

BstXI : 120 phút, 500C

Bổ sung từ từ 10ml EDTA 0.5M (pH 7.5) để kết thúc phản ứng

Ví dụ: Cắt DNA bằng enzyme cắt giới hạn

PHÂN TÍCH CÁC PHÂN ĐOẠN DNA

Phương pháp hóa học

giải trình tự DNA

- Đánh dấu 32P

- Sử dụng hóa chất làm biến tính A-T-G-C

- Tách đoạn DNA và điện di

so sánh với bản nguyên thủy

Phương pháp enzyme

giải trình tự DNA

Chèn dNTP tương ứng G-C vào đoạn DNA

A-T-Phương pháp dùng

máy tự động giải trình

tự DNA

Sử dụng mắt cảm quang và tia laser phát hiện

3 NỐI CÁC PHÂN ĐOẠN DNA

DNA ligase

- Xúc tác quá trình hình thành liên kết photphodiester, nối 02 đoạn DNA.

- E.Coli DNA ligase - nối 02 trình tự DNA có đầu so le và đầu bằng.

- T 4 DNA ligase - nối 02 trình tự DNA

có đầu bằng

- Nuôi cấy tái sinh tế bào mang gen chuyển trên môi

trường chọn lọc

nhận biết cây chuyển gen (nhuộm, PCR, Southern blot,…)

- Theo dỏi sự biểu hiện và di truyền của gen chuyển

5 NHẬN DIỆN TẾ BÀO CHỦ CHỨA DNA TÁI TỔ HỢP