BÁO CÁO THỰC HÀNH MÔN CÔNG NGHỆ PROTEIN - ENZYME potx

- Sắc ký trao đổi ion được phân loại dựa trên cơ chế của quá trình tách: do ái lực khác nhau của các ion trong dung dịch pha động với các trung tâm trao đổi ion nhóm chứa ion trên chất r

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

-   -

BÁO CÁO THỰC HÀNH

MÔN CÔNG NGHỆ PROTEIN - ENZYME

Sinh viên thực hiện : Đinh Hoàng Yến Lớp : K55 - CNSHB

Mã sinh viên : 550513 Giáo viên hướng dẫn : TS Nguyễn Thành Trung

Hà Nội, 2012

Bài g à r o i ion

I – Mụ í h, yêu ầu

- Sinh viên giải thích được nguyên lý của phương pháp sắc ký lọc gel và sắc ký trao đổi ion

- Biết cách chuẩn bị gel, làm sắc ký

- Biết cách xây dựng đồ thị nồng độ thành phần protein trong mẫu

- Sắc ký trao đổi ion là một phương pháp sắc ký lỏng rắn mà pha tĩnh

là hợp chất có khả năng trao đổi ion (gọi là các ionit)

- Sắc ký trao đổi ion được phân loại dựa trên cơ chế của quá trình tách:

do ái lực khác nhau của các ion trong dung dịch (pha động) với các trung tâm trao đổi ion (nhóm chứa ion) trên chất rắn (pha tĩnh)

- Đây là phương pháp được sử dụng nhiều trong các phòng thí nghiệm Hóa sinh.Theo những thống kê mới nhất, IEC là kỹ thuật tách protein được

sử dụng nhiều nhất trong các quy trình tinh chế (có thể bao gồm nhiều bước

và nhiều kỹ thuật khác nhau): IEC: 75%; sắc ký ái lực (AC): 60%; sắc ký lọc gel (GF): 50% các trường hợp

- Trước tiên, chất cần phân tích sẽ gắn thuận nghịch với các chất trao đổi bằng tương tác ion giữa các nhóm mang điện tích trái dấu

- Sau đó, các ion đã trao đổi được chiết rút riêng biệt bằng phương pháp rửa giải hoặc rửa đẩy Có thể tách chiết bằng cách thay đổi pH (ít dùng hơn) khiến các nhóm tương tác trên chất phân tích bị mất điện tích

- Nguyên tắc tách trực tiếp (căn cứ trên khác biệt điện tích)

- Tại bất kỳ một điểm pH nào trừ điểm đẳng điện, các protein đều có mang một điện tích tương ứng với điểm pH đó Dựa vào điện tích thực của chúng tại một điểm pH nhất định, ta có thể phân tách hỗn hợp protein Trong phương pháp này, pha tĩnh là những hạt mang sẵn một điện tích nhất

định, những hạt này sẽ tương tác với các phân tử (protein) mang điện tích trái dấu với chúng Cụ thể, nếu hạt mang điện âm (như cột carboxymethyl-cellulose (CM-cellulose)), tiến trình được gọi là sắc ký trao đổi ion dương, thì sẽ tương tác với những phân tử mang điện tích dương Ngược lại, nếu hạt mang điện tích dương (như cột diethylaminoethyl-cellulose (DEAE-cellulose)), gọi là sắc ký trao đổi ion âm, thì tương tác với phân tử mang điện tích âm Vì thế, những protein cùng dấu với cột sẽ chạy ra khỏi cột trong khi những protein trái dấu bị giữ lại cột Để phóng thích những protein này, ta tăng nồng độ ion của pha động, những ion này sẽ thế phân tử protein tương tác với các hạt mang điện tích Ví dụ, trong sắc ký trao đổi ion dương, ta thêm muối natri clorua hay muối khác trong dung dịch tách giải bởi vì ion natri sẽ tranh bám vào cột với các protein có điện tích dương,

do đó, những protein mang điện tích dương được phóng thích ra ngoài cột lần lượt theo độ lớn về điện tích

3 i

Đây là một phương pháp rất hiệu quả và được ứng dụng rộng rãi trong việc tinh sạch protein Kỹ thuật này dựa trên ái lực cao của nhiều protein với những nhóm hóa học chuyên biệt Ví dụ, concanavalin A, một loại protein thực vật, có thể được tinh sạch khi cho qua cột mang những phân tử glucose bằng liên kết cộng hóa trị Concanavalin A gắn vào cột bởi vì nó có ái lực cao với glucose, trong khi đó những protein khác thì không Concanavalin A có thể được tách giải khỏi cột khi ta cho thêm dung dịch glucose đậm đặc vào Phân tử đường trong dung dịch sẽ gắn với Concanavalin A thay thế những phân tử glucose nối với cột

Sắc ký ái lực còn là một công cụ hữu hiệu trong việc tách các yếu tố phiên mã, những protein điều hòa sự biểu hiện gen thông qua việc gắn đặc hiệu với trình tự DNA Hỗn hợp protein thấm qua cột có chứa những trình tự DNA đặc hiệu được gắn vào thể mang; những protein có ái lực cao với trình

tự DNA sẽ bắt vào các trình tự và được giữ lại Trong thí dụ này, yếu tố phiên

mã sẽ được phóng thích khi rửa cột với dung dịch có hàm lượng muối cao Ngoài ra, hiện nay người ta dựa vào tính đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể để tinh sạch kháng nguyên hay kháng thể Nhìn chung, sắc ký ái lực có thể được dùng để tách một protein vốn có khả năng nhận biết một nhóm X bằng nối cộng hóa với nhóm này hay những chất dẫn xuất của nó được gắn trên một cái cột, sau đó nạp hỗn hợp protein vào cột, cột này sẽ được rửa lại để loại bỏ những protein không tạo được nối, cuối cùng là tách giải protein mục tiêu bằng dung dịch X với nồng độ cao hay thay đổi điều kiện để làm giảm lực liên kết Sắc ký ái lực là phương pháp tinh sạch hiệu quả nhất khi tương tác giữa protein và phân tử được dùng như mồi bắt protein

có độ chuyên biệt cao

4 ỏng o :

Kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp là một dạng mở rộng của kỹ thuật sắc ký cột

có khả năng phân tách protein được cải thiện đáng kể Bản thân vật liệu tạo cột vốn đã có sự phân chia rõ ràng và như thế sẽ có nhiều vị trí tương tác dẫn đến khả năng phân tách được tăng lên đáng kể Bởi vì cột được làm từ vật liệu mịn hơn nên phải có một áp lực tác động lên cột để có được một tốc độ chảy thích hợp Kết quả thực có sự phân giải cao và phân tách nhanh

Có nhiều phương pháp sắc kí như sắc kí lọc gel, sắc kí trao đổi ion, sắc kí ái lực…

g (Gel-Filtration Chromatography):

Là một trong những kỹ thuật sắc ký cột được dùng phổ biến trong tách chiết và tinh sạch protein Sắc kí lọc gel còn được gọi là phương pháp dùng chất rây phân tử, lọc gel Cơ sở của phương pháp lọc gel là dựa trên sự khác nhau về kích thước, hình dạng và phân tử lượng của protein enzyme có trong hỗn hợp để tách chúng ra Để đảm bảo cho việc tách protein enzyme được tốt,

chất rây phân tử phải là chất trơ, không phản ứng với protein enzyme, không hòa tan và tương đối bền với các yếu tố về cơ học cũng như sinh học Ngoài

ra chất được sử dụng cho mục đích lọc phân tử phải là chất không có tính đàn

hồi (không co) và phải là chất ưa nước Gel sephadex là chất thỏa mãn các yếu tố trên

Phương pháp lọc phân tử trên sephadex được tiến hành như sau: cho sephadex vào cột thủy tinh dài và cân bằng dung dịch đệm có pH nhất định Sau đó cho dung dịch protein enzyme lên cột Khi lọc và chiết bằng các dung môi thích hợp, các phân tử nhỏ (ở đây là các muối) sẽ khuếch tán chậm chạp qua các lỗ nhỏ của các hạt sephadex bị trương phồng, còn các chất có khối lượng phân tử lớn hơn (ở trường hợp này là các protein enzyme) không có khả năng đi vào mà lách nhanh qua các hạt shephadex và sẽ được chiết nhanh

ra khỏi cột Vì vậy, ta có thể tách được chất có khối lượng phân tử cao hơn thoát ra khỏi cột gel trước so với chất có khối lượng phân tử nhỏ

2 h ng h í r o i ion (Ion –Exchange Chromatography):

Dựa vào sự khác nhau về điện tích tổng số của các protein enzyme, hay phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng trao đổi ion giữa protein tan được trong nước hoặc dung dịch đệm loãng và các tác nhân trao đổi ion Tác nhân trao đổi ion có thể là chất nhựa có tích nhóm sinh anion hoặc chất cation Đây

là những chất giá trơ, không tan tròn nước, có bản chất là cellulose hoặc chất gel dextran có lưới phân nhánh (Sephadex, Molselect) hoặc là chất nhựa

polistirol Chất giá thể này thường kết hợp với các nhóm ion hóa

Trong hỗn hợp chất ionit với dung dịch đệm có độ pH tương ứng, các chất ionit đã nói ở trên trở nên tích điện Vì vậy trên bề mặt lớp chất giá sẽ hình thành một lớp điện tích có dấu phụ thuộc vào kiểu nhóm chức hóa học của nó Nếu thêm protein enzyme vào dung dịch đệm thì các phân tử protein enzyme mang điện tích sẽ bị các nhóm tích điện trái dấu của chất trao đổi ion kéo lại Khi dùng một dung dịch đệm để phản hấp phụ có pH khác hoặc khi thêm một loại ion khác có lực ion lớn hơn thì phân tử protein enzyme sẽ bị đẩy ra khỏi chất trao đổi ion Khi tiến hành phản hấp phụ, thường người ta thêm vào các ion Na+

và Cl- trong NaCl có nồng độ tăng dần theo bậc thang hay theo gradient Các phân tử protein enzyme nào có điện tích tổng số nhỏ thì sẽ bị đẩy ra trước do lực liên kết với chất trao đổi ion yếu Còn những protein enzyme nào có liên kết với ionit lớn hơn thì sẽ bị đẩy ra bằng một lực ion của muối lớn hơn Như vậy, bằng cách này, chúng ta có thể tách được từng phần các loại protein enzyme Việc tách từng phần có lựa chọn tốt nhất

là khi tăng dần nồng độ các ion thay thế Nhờ nồng độ ion của muối tăng dần (gradient) người ta có thể rút ra từ cột các loại protein enzyme khác nhau Có thể thu nhận dịch chiết enzyme protein sau khi qua cột bằng máy thu phân đoạn tự động Theo thứ tự từng phần dịch thu được, người ta tiến hành định

lượng protein theo các phương pháp Lowry hay phương pháp đo quang phổ

và xác định đoạt hoạt độ của enzyme

- Làm nở gel trong nhiệt độ thường ủ 1- 2 ngày hoặc 2h ở 100ºC hoặc hấp 121ºC trong 30 phút Bảo quản ở nhiệt độ từ 4- 25ºC

3 Nhồi ộ g

Rửa và tráng sạch cột rồi dựng cột thẳng đứng trên giá Tráng qua cột bằng đệm rồi đóng khóa phía dưới cột Khuấy nhẹ hòa đều gel đổ từ từ vào cột (cần chú ý tránh tạo bọt trong gel và gel phân lớp không đồng nhất), để gel lắng một lúc Mở khóa để đệm chảy ra và để gel lắng dưới tác dụng của

áp suất trong cột Tiếp tục đổ gel vào cột cho đến thể tích mong muốn

4 C n ng g (equilibration):

Sau khi nhồi xong cột gel phải được cân bằng lại, với gel sắc kí lọc gel cân bằng bằng đệm phosphate, với sắc kí trao đổi ion cân bằng bằng đệm phosphate có bổ sung NaCl Cho đệm chảy từ từ vào cột, tháo van để dung dịch đệm cân bằng ra ngoài

và không thay đổi nhiều thì không phải tách rửa nữa

Với sắc kí trao đổi ion: Cho đệm phosphate có bổ sung muối NaCl với các gradient nồng độ 0,1M, 0,25M, 0,5M, 1M và 2M mỗi nồng độ NaCl cho chạy ½ hoặc 1 thể tích cột (khoảng 20ml) chảy qua từ từ tốc độ khoảng 25ml/h đến khi OD280 của dịch rửa khoảng thấp và không thay đổi nhiều thì không phải tách rửa nữa Thu liên tục dịch chảy ra từng phân đoạn vào ống nghiệm nhỏ mỗi ống thu 1  2 ml Tiến hành đo OD280 từ các ống thu được

Từ kết quả thu được (OD280) của các phân đoạn, tiến hành vẽ đồ thị, xác định các phân đoạn có nồng độ protein cao có thể đem xác định một số hoạt tính sơ bộ hoặc hoạt độ

7 T i inh g (r g n r ion)

Với sắc kí lọc gel cho rửa bằng đệm phosphate

Với sắc kí trao đổi ion: Phụ thuộc vào bản chất của mẫu, tái sinh thường được rửa bằng đệm ion mạnh (ví dụ: NaCl 1M hoặc 2M) hoặc/ và giảm hoặc tăng pH, theo đệm sử dụng cân bằng trong gắn mẫu Trong một số trường hợp cần phải rửa sạch cột có thể bằng ethylene glycol hoặc ethanol

- Môi trường pH trong cột

- Sự phân bố điện tích bề mặt của protein

- Bản chất các ion trong dung dịch

- Các chất được thêm vào như: dung môi hữu cơ…

- Đặc tính của chất trao đổi

Đồ thị nồng độ protein trong sắc ký trao đổi ion

- Ta thấy có 5 đỉnh protein, nhưng chỉ 2 đỉnh đầu là độ phân tách tốt

- Chỉ có ống nghiệm 11 và 12 thì giá trị OD280 gần với giá trị 0 nhất, ở đó nồng độ protein gần như bằng 0

- Từ ống nghiệm thứ 13 trở đi thì giá trị đo OD lên xuống không còn theo quy luật nữa

3 Nguyên nh n

- Trong quá trình thí nghiệm, cột sắc ký chuẩn bị không được tốt

- Protein vẫn còn lẫn tạp

- Dòng chảy protein ra ngoài không đều

- Khi để protein chảy nhanh ra ngoài thì dễ lẫn các protein với nhau

- Máy đo OD cũng có khả năng sai sót thông số

- Nồng độ protein trong ống nghiệm phân bố không đều nên khi đo OD giá trị nhiều lúc thay đổi

- Xây dựng đồ thị đường chuẩn của các phương pháp khác nhau

- Biết cách xác định hàm lượng protein dựa vào đồ thị đường chuẩn

II – Định ợng nồng ộ ro in ng h ng h Biur :

Phương pháp Biuret là phương pháp đơn giản nhất để định lượng protein Phương pháp này nhạy cảm với thành phần amino acid của protein Độ nhạy của nó là hằng số tương đối cố định từ protein này đến protein khác Do tiến hành đơn giản và cho kết quả nhanh chóng, nó được sử dụng để định lượng protein chiết xuất thô với khoảng nồng độ lớn Ngoài ra, phương pháp này còn

có thể được sử dụng để xác định nồng độ protein trong quá trình tinh sạch Nguyên lý của nó dựa trên liên kết giữa ion đồng (Cu2+

) với peptide của protein trong môi trường kiềm để tạo thành màu tím hay xanh tím có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 540 nm Cường độ màu của phản ứng tỷ lệ thuận với số lượng liên kết peptide (- CO – NH -) trong chuỗi polypeptide

Hó hấ :

- Thuốc thử Biuret: 1.5 g cupric sulfate pentahydrate (CuSO4 5 H2O) và 6.0 g sodium potassium tartrate tetrahydrate (NaKC4H4O6 4 H2O) Hòa tan trong 500 ml nước cất Thêm 300 ml NaOH 10% Thêm 1g KI, lắc cho tan, thêm nước cất đến thể tích 1 lít Bảo quản trong lọ tối

- Cân 100 mg BSA (albumin huyết thanh bò) hoà tan trong 10ml nước,

ta được dung dịch gốc có nồng độ là 10 mg/ml Bảo quản ở 4ºC Chỉ dùng

ml

H2O (ml)

Thuốc thử Biuret (ml)

Nồng độ protein (mg/ml)

6 1.0 0.0 4 10

Lắc đều, để yên các ống nghiệm trong 20 phút ở nhiệt độ phòng Sau đó

đo mật độ quang ở bước sóng 540 nm Giá trị OD540 của các ống nghiệm từ 2 – 6 sau khi trừ đi giá trị OD540 của ống 1 sẽ xây dựng được đồ thị biểu diễn sự biến thiên của mật độ quang theo nồng độ protein chuẩn (BSA) (Đồ thị đường chuẩn)

3 X ịnh hàm ợng protein b ng h ng h Biur :

Enzyme ngoại bào được tách chiết từ nấm mốc nuôi trên môi trường xốp 10g mẫu (cả môi trường và nấm mốc) được cho vào ống falcon 45ml và 30ml nước cất vô trùng, vortex, ly tâm 4000 vòng/phút trong 30 phút lấy dịch trong Tiếp tục lọc dịch bằng giấy thấm Thu được 26 ml dịch chiết enzyme ngoại bào Bảo quản ở - 20°C

Cho vào ống nghiệm 1 ml dung dịch mẫu và 4 ml thuốc thử Biuret, lắc

đề, để yên trong 20 phút ở nhiệt độ phòng, dung dịch có màu xanh Do OD ở bước sóng 540 nm

Lấy giá trị OD540 của mẫu trừ đi OD540 của ống nghiệm thay mẫu bằng nước cất rồi chiếu vào đồ thị chuẩn để suy ra lượng protein có trong dung dịch mẫu

Ta có: Phương trình đường chuẩn BSA (phương pháp Biuret):

III – Định ợng nồng ộ protein b ng h ng h Lowry:

Phương pháp định lượng protein của Lowry là phương pháp được sử dụng rộng rãi để xác định chính xác nồng độ protein Phương pháp này là một sự kết hợp của phản ứng Biuret và phản ứng Folin-Ciocalteau Bước đầu phản ứng, protein liên kết với ion đồng trong môi trường kiềm Bước tiếp theo, phức chất đồng-protein (chủ yếu là protein chứa amino acid nhóm tryptophan và tyrosine) khử hỗn hợp phosphomolipden – phosphovonphramat (thuốc thử Folin – ciocalteu) tạo phức chất mầu xanh da trời có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 660nm

Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ protein trong một phạm vi nhất định Dựa vào mức độ hấp thụ quang học của protein chuẩn,

ta có thể xác định được hàm lượng protein trong mẫu nghiên cứu

Cân 0,01g (10mg – albumin huyết thanh bò) hoà tan trong 10ml nước, ta được dung dịch gốc có nồng độ là 1mg/ml Sau đó pha loãng dung dịch gốc bằng nước cất với các nồng độ 20, 40, 60, 80, 100, 120 µg/ml để tiến hành xây dựng đồ thị chuẩn

STT BSA (1 mg/ml) (µl)

H2O (ml)

Nồng độ protein (µg/ml)

- Mẫu đối chứng: lấy 0,5 ml nước cất cho vào ống nghiệm, thêm vào đó 2ml dung dịch C và các bước tiếp theo được tiến hành như mẫu thí nghiệm Qua 3 lần lặp lại thí nghiệm có thể xây dựng đường hồi quy Kết quả được xử lý theo phương pháp thống kê thông thường

3 X ịnh hàm ợng protein b ng h ng h Lowry:

Sử dụng enzyme ngoại bào nấm mốc như phương pháp Biuret Thay vì lấy 0.5 ml dung dịch BSA chuẩn, lấy 0.5 ml dung dịch protein cho vào ống nghiệm Các bước tiếp theo làm tương tự như cách xây dựng đồ thị chuẩn đã trình bày ở trên Ghi lại giá trị OD660

L u Để đảm bảo độ chính xác, nếu hàm lượng protein trong mẫu quá lớn

cần phải pha loãng với dung dịch đệm phù hợp hoặc nước cất trước khi định lượng

Dựa vào đồ thị chuẩn, xác định được hàm lượng protein trong mẫu