NCKH DLCM 2021 2022

TRƯỜNG THPT VIỆT BẮC 2 BÁO CÁO KẾT QUẢ DỰ ÁN THAM DỰ CUỘC THI KHOA HỌC KĨ THUẬT CẤP TỈNH NĂM HỌC 2021 2022 Tên đề tài chiết xuất ethyl para methoxycinnamate từ củ địa liền Và Bước đầu đánh giá khả năn.

BÁO CÁO KẾT QUẢ DỰ ÁN THAM DỰ CUỘC THI KHOA HỌC KĨ THUẬT CẤP TỈNH NĂM HỌC

2021 - 2022

Tên đề tài CHIẾT XUẤT ETHYL- PARA- METHOXYCINNAMATE TỪ CỦ ĐỊA LIỀN

VÀ BƯỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG HẠ ĐƯỜNG HUYẾT, ỨC CHẾ

TẾ BÀO UNG THƯ CỦA ETHYL- PARA- METHOXYCINNAMATE.

Lĩnh vực: Y sinh và khoa học sức khỏe

Lạng Sơn, tháng 9 năm 2021

MỤC LỤC

PHẦN I: MỞ ĐẦU 3

1 Lí do chọn đề tài 3

2 Ý nghĩa và tầm quan trọng của đề tài 3

3 Mục tiêu nghiên cứu 4

4 Giới hạn phạm vi nghiên cứu 4

5 Đối tượng nghiên cứu 4

6 Phương pháp nghiên cứu 4

7 Những điểm mới của đề tài 5

PHẦN II NỘI DUNG 6

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 6

1 Tổng quan về cây địa liền 6

1.1 Đặc điểm sinh học và sinh thái của cây địa liền 6

1.2 Thành phần hóa học của cây địa liền 6

1.3 Các tác dụng dược lý và công dụng của của cây địa liền 6

2 Bệnh tiểu đường 6

2.1 Tìm hiểu về bệnh tiểu đường 6

2.2 Triệu chứng bệnh đái tháo đường 7

2.3 Biến chứng bệnh đái tháo đường 7

3 Ung thư 7

CHƯƠNG II: QUÁ TRÌNH NGHIÊN CỨU 8

2.1 Qui trình thực nghiệm 8

2.1.1 Nguyên liệu, hóa chất 8

2.1.2 Tách chiết cinnamate từ củ Địa liền 8

2.1.3 Phương pháp xác định cấu trúc phân tử 10

2.1.4 Phương pháp thử hoạt tính sinh học 10

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 11

3.1 Kết quả đạt được 11

3.2 Hướng nghiên cứu tiếp theo 16

PHẦN III: KẾT LUẬN 16

CHÚ THÍCH 18

TÀI LIỆU THAM KHẢO 19

Riêng tại Việt Nam, tỷ lệ bệnh nhân mắc bệnh tiểu đường đang gia tăngmột cách nhanh chóng, số bệnh nhân tăng gấp đôi trong vòng 10 năm Năm

2017, số bệnh nhân đái tháo đường là 3.54 triệu người (khoảng 5.5% dân số), sốbệnh nhân tiền tiểu đường (có rối loạn dung nạp glucose) là 4.79 triệu người(khoảng 7.4% dân số), nghĩa là cứ 7.5 người sẽ có 1 người mắc bệnh tiểu đườnghoặc tiền tiểu đường Dự đoán đến năm 2045, con số này sẽ tăng lên chiếm7.7% tổng dân số

Địa liền (Kaempferia galanga L.) là dược liệu đã được sử dụng từ lâu

trong điều trị ngực bụng lạnh đau, tiêu chảy, ăn uống khó tiêu, đau dạ dày, cảm,

ho, nôn mửa, hen suyễn và một số tác dụng khác [1] Theo nghiên cứu của cácnhà khoa học, củ địa liền khô có chứa 2,4- 3,9% tinh dầu với các thành phần

chính là acid p-methoxycinamic, ethyl cinamat và ethyl-p- methoxycinnamat

(EPMC) [2] Trong đó, EPMC tác dụng chống viêm, gây giãn khí phế quản và

có phổ kháng khuẩn, kháng nấm khá rộng, đặc biệt khả năng làm giảm lượngđường trong máu và ức chế một số tế bào ung thư Xuất phát từ các lí do trên

nên chúng em quyết định lựa chọn đề tài “ Bước đầu đánh giá khả năng hạ đường huyết và ức chế tế bào ung thư của ethyl- para- methoxycinnamate chiết xuất từ củ địa liền” cho ý tưởng nghiên cứu khoa học của mình.

2 Ý nghĩa và tầm quan trọng của đề tài

2.1 Ý nghĩa

Chứng minh củ cây địa liền có khả năng giảm glucozo trong máu, ức chế

tế bào ung thư gan và ung thư bạch cầu cấp tính ở người, làm cơ sở để bào chế,sản xuất thuốc chữa bệnh có nguồn gốc thảo dược hiệu quả, an toàn

2.2 Tầm quan trọng của đề tài

Đề tài được thực hiện nhằm đánh giá chính xác khả năng hạ đường huyết,

ức chế tế bào ung thư nhằm tạo tiền đề cho việc sử dụng cây địa liền trong côngnghệ bào chế thuốc chữa bệnh

3 Mục tiêu nghiên cứu

- Chiết tách thành công ethyl- para- methoxycinnamate từ cặn chiết củ Địaliền

- Làm được thí nghiệm đánh giá được khả năng giảm glucozo của para- methoxycinnamate trên mô hình in vitro

ethyl Thử nghiệm đánh giá được khả năng ức chế tế bào ung thư gan và ungthư bạch cầu cấp tính ở người

4 Giới hạn phạm vi nghiên cứu

- Đề tài được thực hiện trong phạm vi trường học, tính an toàn cao

- Nhóm gồm hai thành viên Thời gian nghiên cứu 3,5h/ngày

- Số lượng mẫu khảo sát 20 mẫu, thời gian nghiên cứu 4 tháng

5 Đối tượng nghiên cứu

Các thành phần của cây địa liền đặc biệt là củ và rễ

6 Phương pháp nghiên cứu

- Sử dụng nghiên cứu khoa học thực nghiệm

+ Lập kế hoạch nghiên cứu ->bố trí thí nghiệm -> tiến hành thí nghiệm->Thu kết quả -> Đánh giá và kết luận

- Phương pháp thu mẫu

- Phân lập tuyển chọn

- Phương pháp chiết xuất EPMC

Dựa trên tài liệu tham khảo [9 ,10] và các khảo sát sơ bộ, 2 phương phápchiết xuất EPMC từ địa liền được nghiên cứu gồm:

+ Phương pháp cất kéo hơi nước

+ Phương pháp tạo tinh thể bay hơi

- Phương pháp đánh giá khả năng giảm lượng đường huyết trên đĩa

invitro và ức chế tế bào ung thư

7 Những điểm mới của đề tài

- Thực nghiệm chiết tách thành công hợp chất cinnamate từ củ Địa liền

- Xác định chính xác được khả năng hạ glucozo trong máu của cinnamate chiết tách từ cây Địa liền

- Xác định và đánh giá được khả năng ức chế tế bào ung thư gan và ung thư máu cấp tính của cinnamate chiết tách từ cây Địa liền

PHẦN II NỘI DUNGCHƯƠNG I: TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

1 Tổng quan về cây địa liền

1.1 Đặc điểm sinh học và sinh thái của cây địa liền

Địa liền là loài thực vật phân bố nhiều ở nước châu Á như Ấn Độ,

Malaysia, Indonesia, Philipine, TháiLan, Lào, Campuchia và Trung Quốc.Tại Việt Nam, chi Kaempferia L cótổng cộng khoảng 9 – 10 loài Địaliền là cây mọc tự nhiên ở TâyNguyên, một số tỉnh miền núi như HàGiang, Yên Bái, Sơn La Khôngnhững vậy, cây còn được trồng nhiềunơi ở vùng đồng bằng sông Hồng như Hưng Yên, Hải Dương, Bắc Ninh, BắcGiang…, Nghệ An, Thanh Hóa Ở Lạng Sơn củ Địa Liền được người dân trồngrải rác ở các huyện như Cao Lộc, Văn Quan, Bình Gia…

Địa liền là loại cây ưa sáng, ưa ẩm và có khả năng chịu hạn Hàng năm,cây mọc lá non vào tháng 4 – 5, sinh trưởng nhanh vào mùa hè và ra hoa Hoa

nở mỗi ngày 1 cái vào lúc sáng sớm, rồi tàn tàn lúc 10 giờ sáng

Củ Địa Liền được người dân sử dụng làm thuốc trong các bài thuốc chữabệnh và một lượng nhỏ củ địa liền được sử dụng làm gia vị trong ẩm thực

1.2 Thành phần hóa học của cây địa liền

Thân rễ, củ địa liền khô chứa 2.4 – 3.9% tinh dầu, thành phần chủ yếu của tinh dầu có trong thân rễ địa liền là:

1.3 Các tác dụng dược lý và công dụng của của cây địa liền

Trong những năm gần đây, tác dụng dược lí của các cinnamate chiết tách

từ cây Địa liền rất được quan tâm Nhiều nhà khoa học Việt Nam đã chiết tách

được hợp chất này trong củ Địa liền trồng ở Việt Nam và sử dụng rất hiệu quảlàm thuốc chữa bệnh xương khớp Tuy nhiên, các hợp chất cinnamate lại chưađược đánh giá về tác dụng hạ glucozo huyết Do đó, trong đề tài này chúng emmong muốn đánh giá được tác dụng dược lí của cinnamate và so sánh hiệu quảcủa chúng với thuốc hạ glucozo đang sử dụng.

2 Bệnh tiểu đường

2.1 Tìm hiểu về bệnh tiểu đường

Bệnh tiểu đường hay còn gọi là Bệnh đái tháo đường (ĐTĐ) là bệnh rốiloạn chuyển hóa không đồng nhất, có đặc điểm tăng glucose huyết do khiếmkhuyết về tiết insulin, về tác động của insulin hoặc cả hai Tăng glucose mạntính trong thời gian dài gây nên những rối loạn chuyển hóa carbohydrate,protide, lipide, gây tổn thương ở nhiều cơ quan khác nhau, đặc biệt ở tim vàmạch máu, thận, mắt, thần kinh

Phân loại đái tháo đường gồm:

- Đái tháo đường type 1 (do phá hủy tế bào beta tụy, dẫn đến thiếu

insulin tuyệt đối)

- Đái tháo đường type 2 (do giảm chức năng của tế bào beta tụy tiến triển trên nền tảng đề kháng insulin)

2.2 Triệu chứng bệnh đái tháo đường

Các triệu chứng đái tháo đường sau đây là điển hình Tuy nhiên, một số người đái tháo đường type 2 có các triệu chứng nhẹ nên người bệnh không nhận biết được

- Đi tiểu thường xuyên

- Cảm thấy rất khát

- Cảm thấy rất đói – ngay cả khi đang ăn

- Mệt mỏi nhiều

- Nhìn mờ

- Chậm lành các vết thương hoặc vết loét:

- Giảm cân – ngay cả khi đang ăn nhiều hơn (đái tháo đường type 1)

- Ngứa ran, đau, hoặc tê ở tay hoặc chân (đái tháo đường type 2)

2.3 Biến chứng bệnh đái tháo đường

Những người bệnh đái tháo đường có nguy cơ cao phát triển một số vấn

đề sức khỏe nghiêm trọng Mức đường huyết trong máu cao lâu dài có thể dẫnđến các bệnh nghiêm trọng ảnh hưởng đến tim, mạch máu, mắt, thận, thần kinh

và răng Ngoài ra, những người đái tháo đường cũng có nguy cơ cao mắc cácbệnh nhiễm khuẩn Ở hầu hết các quốc gia có thu nhập cao, bệnh đái tháo đường

là nguyên nhân hàng đầu gây ra bệnh tim mạch, mù lòa, suy thận và cắt cụt chidưới Người lớn đái tháo đường có nguy cơ tăng gấp 2 đến 3 nhồi máu cơtim và đột quỵ Bệnh võng mạc tiểu đường là một nguyên nhân quan trọng gây

mù do sự tích tụ lâu dài của các mạch máu nhỏ trong võng mạc 2,6% bệnh mùtoàn cầu có thể là do đái tháo đường Đái tháo đường là một trong nhữngnguyên nhân hàng đầu gây ra suy thận

Các tế bào ung thư có thể xuất hiện ở một khu vực, sau đó lan rộng quacác hạch bạch huyết Một số loại ung thư gây ra sự phát triển tế bào nhanhchóng, trong khi những loại khác làm cho các tế bào phát triển và phân chia vớitốc độ chậm hơn

Có hơn 100 loại ung thư khác nhau Ung thư thường được gọi tên theo cơquan mà nó phát sinh, ví dụ: Ung thư phổi phát sinh từ các tế bào ở phổi, ungthư đại tràng phát sinh từ các tế bào ở đại tràng Ung thư cũng có thể được gọitheo loại tế bào hình thành chúng như ung thư biểu mô (carcinoma) hay ung thư

mô liên kết (sarcoma) Ngoài ra các ung thư có thể phát triển từ máu, như làcác bệnh máu ác tính.

CHƯƠNG II: QUÁ TRÌNH NGHIÊN CỨU2.1 Qui trình thực nghiệm

2.1.1 Nguyên liệu, hóa chất

- 5 kg Địa liền tươi

- Hóa chất mua của hãng Merck- Đức

- Mô hình thí nghiệm in vitro của Viện công nghệ sinh học – Viện hànlâm khoa học Việt Nam

- Một số hóa chất và dung môi khác là các sản phẩm thương mại của ViệtNam và Trung Quốc

2.1.2 Tách chiết cinnamate từ củ Địa liền

- Tiến hành nghiên cứu khoa học thực nghiệm

+ Thu mua mẫu vật: 5 kg củ Địa liền tươi được thu mua vào tháng 7năm 2021 5kg Địa liền tươi được thái mỏng, phơi khô trong bóng râm, sau đósấy khô ở nhiệt độ 500C

+ Phân lập tuyển chọn và phân tách dịch dùng để chiết

+ Phương pháp chiết xuất EPMC

Lựa chọn sử dụng phương pháp bay hơi: Địa liền sau khi phơi khô,

được nghiền nhỏ thành bột, bột địa liền khô nghiền nhỏ (3000 g) được cho vàobình thủy tinh, thêm 2000 ml dung môi (metanol hoặc etanol), khuấy điều ngâmtrong 9 ngày, cứ 3 ngày thu dung môi 1 lần và thêm dung môi mới Sau đó lọc

bỏ cặn bã, làm bay hơi dung môi thu được tinh thể kết tinh Lọc rửa tinh thểbằng dung môi n-hexan

Hình 1 Sơ đồ chiết tách ethyl- p- methoxycinnamate từ củ Địa liền.

Hình 2 : Bột mịn địa liền được ngâm trong dung dịch CH 3 OH.

Hình 3: Rửa tinh thể với dung dịch n- Hexan

Hình 4 : Tinh thể địa liền Cinnamate(DLCM)

2.1.3 Phương pháp xác định cấu trúc phân tử

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H NMR 500MHz được ghi trên thiết bịBrucker AV 500 spectrometer

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C NMR 125MHz với chương trình DEPTđược ghi trên thiết bị Brucker AV 500 spectrometer

- Phổ khối MS được khi trên thiết bị Hewlett Packard HP5989 B MSspectrometer, serie II

2.1.4 Phương pháp thử hoạt tính sinh học

- Thử in vitro

- Nguyên tắc : men -glucosidase khi gặp nối -D-glucose sẽ cắt đứt nối này

để giải phóng đường D-glucose Hoạt động này sản sinh ra nhiều glucose saukhi ăn và làm gia tăng hàm lượng glucose trong máu, do đó cần ức chế hoạtđộng của men -glucosidase để làm chậm sự chuyển hoá một số loại thức ănthành glucose Vì vậy, người ta sử dụng các chất nền có liên kết  với đườngD-glucose như p-Nitrophenyl--D -glucopyranoside, maltose… để xây dựngphương pháp thử hoạt tính ức chế men -glucosidase trong phòng thínghiệm

- Phương pháp :

 Hoạt tính ức chế enzyme α glucosidase của hoạt chất nghiên cứu đượcthực hiện theo phương pháp của Moradi-Afrapoli F và cộng sự

 Chất thử được hòa tan trong DMSO và pha loãng trong phosphate buffer

10 mM (pH 6.8) được đưa vào các giếng của khay 96 giếng để có nồng

 Dừng thí nghiệm bằng cách thêm vào 80 µl Na2CO3 0,2M và đo OD ởbước sóng 405nm bằng máy đo ELISA Plate Reader (Bio-Rad)

 Khả năng ức chế enzyme α- glucosidase của mẫu thử được xác định theocông thức sau:

% ức chế = (1 - Amẫu thử/ A đối chứng )*100

Trong đó: A đối chứng = OD đối chứng - OD blank

Amẫu thử = ODmẫu thử - OD blank mauthuGiá trị IC50 (nồng độ ức chế 50%) sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máytính TableCurve.

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN3.1 Kết quả đạt được

3.1.1 Xác định cấu trúc phân tử DLCM

Hình 2 Phổ 1 H NMR của TT2 (DLCM 1)

Kết quả H- NMR tín hiệu triplet tương ứng với ba proton ở 1,3 ppmthuộc nhóm CH3 của một nhánh – CH2CH3 Trong khi một tín hiệu quartet ở4.2 ppm được gán cho hai proton trên nhóm CH2 tiếp giáp với methyl và liênkết với nguyên tử oxi Một đỉnh mạnh khác tại 3,8 ppm tương ứng với baproton của nhóm –OCH3 gắn trực tiếp vào vòng thơm Các dublet cộnghưởng ở 6,3 ppm (1H, d, J = 15,6 Hz) thuộc về proton gắn với vị trí C-2trong khi proton gắn vào vị trí C-3 nằm ở 7.6 ppm (1H, d, J = 16.2 Hz) Mộtcặp đôi ở 6,9 ppm (2H, d, J6 = J8 = 8.4 Hz) tương ứng với hai proton liên kết

với C-6 và C-8 trong khi cặp đôi ở 7.5 ppm (2H, d, J5 = J9 = 9.0 Hz) đượcgán cho hai proton gắn liền với C-5 và C-9

kề nhau và được gán cho C-6,8 và C-5,9 tương ứng Cuối cùng, tín hiệu ở126,9 tương ứng với C-4 Từ các phân tích trên đã xác nhận chất ban đầu làethyl- p-methoxycinnmate

Bảng 1 Phân tích phổ 1H- NMR và 13 C- NMR của DLCM

1' 2' 1

2

3 4 5 6 7

8 9

Giá trị IC 50

(µg/ml)

1

TTC1(DLCM)

4 5Kết quả trên cho thấy DLCM có hoạt tính ức chế alpha glucosidase với giá trịIC50 256µg/ml Chất đối chứng acarbose hoạt động ổn định trong quá trình thínghiệm

3.1.3 Thử hoạt tính ức chế tế bào ung thư trên hệ DPPH

Nguyên lí của phép thử:

1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) là chất tạo ra gốc tự do được dùng

để thực hiện sàng lọc tác dụng chống oxy hóa của các chất nghiên cứu Hoạt tínhchống oxy hóa thể hiện qua việc làm giảm màu của DPPH, được xác định bằngphương pháp đo quang ở bước sóng  = 517 nm

Cách tiến hành:

Pha dung dịch DPPH có nồng độ 1mM trong Methanol (MeOH) Chất thửđược pha trong DMSO 100% sao cho nồng độ cuối cùng đạt được một dãy cácnồng độ Để thời gian phản ứng 30 phút ở 370C, đọc mật độ hấp phụ của DPPHchưa phản ứng bằng máy đọc Biotek ở bước sóng 517 nm

% bẫy gốc tự do DPPH của mẫu thử được tính theo công thức sau:

STT Tên mẫu thử (µg/ml) Nồng độ % bắt giữ gốc tự do Giá trị EC 50

(µg/ml)

1

TTC1(DLCM)

2 và mẫu 3 có hàm lượng chất thử nhiều hơn nhằm xác định rõ hơn về khả năng chống oxi hóa Theo tiến độ thử nghiệm thì kết quả sẽ được trả vào khoảng thời gian 20/12/2021

3.2 Hướng nghiên cứu tiếp theo

Nếu đề tài này được lựa chọn, chúng em sẽ tiếp tục nghiên cứu và xây dựng qui trình chuẩn hơn để chiết tách cinnamate với hiệu suất cao hơn, thao tác đơn giảnnhất

- Tiến hành thu mua mẫu vật và thử nghiệm có qui mô lớn hơn để đánh giáchính xác về hoạt tính của cinnamate

- Thử nghiệm khả năng kháng một số loại tế bào ung thư

- Thử nghiệm trên chuột bạch thí nghiệm

- Dự án thành công sẽ góp phần nâng cao giá trị y khoa của củ Địa liền, cũng như giá trị kinh tế cho củ địa liền, có thể nhân rộng mô hình trồng cây thuốc đông y trong đó có cây địa liền

chế tế bào ung thư của ethyl-p-methoxycinanamate, đã thu được một số kết quả sau :

- Bước đầu xây dựng được quy trình tách chiết tinh thể ethyl -para-

methoxycinnamate từ củ địa liền, quy trình rửa tinh thể và quy trình thử nghiệm hoạt tính sinh học của Ethyl-para-methoxycinnamate

- Đã chiết tách thành công ethyl- para- methoxycinnamate từ cặn chiết củĐịa liền Từ mẫu tinh thể thu được chúng tôi đem tiến hành chụp phổ để xácđịnh cấu trúc phân tử của ethyl-para-methoxycinnamate

- Chúng tôi tiến hành thử hoạt tính và đánh giá khả năng giảm lượngglucoside của ethy-para-methoxycinnamate trên đĩa thử invitro

Kết quả cho thấy Ethyl-para-methoxycinamate có hoạt tính ức chế, làm giảmalpha glucosidase với giá trị IC50 >256µg/ml Chất đối chứng acarbose hoạtđộng ổn định trong quá trình thí nghiệm

- Thử nghiệm đánh giá được khả năng ức chế tế bào ung thư gan và ungthư bạch cầu cấp tính ở người