NHẬP MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌCTEST KIT

Trước sự trỗi dậy của suy thoái kinh tế, một số phương pháp đã được đưa ra để mang lại nhiều lợi ích về kinh tế lẫn sức khỏe. Các phương pháp ấy đã góp phần tích cực đến việc rút ngắn giai đoạn kiểm tra đồng thời tăng độ chính xác, từ những lý do ấy nhóm chúng tôi đã chọn đề tài “Test Kit” làm đề tài báo cáo

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG

NHẬP MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Đề tài:

TEST KIT

GVHD: TS PHẠM MINH TUẤN

Tp HCM, 24/12/2012

MỤC LỤC

1 ĐẶT VẤN ĐỀ 3

2 MỤC TIÊU BÀI BÁO CÁO 4

3 LỊCH SỬ HÌNH THÀNH “TEST KIT” 5

4 KHÁI NIỆM VÀ PHÂN LOẠI “TEST KIT” 8

4.1 Khái niệm 8

4.2 Phân loại 8

4.2.1 Test kit y tế 8

4.2.2 Test kit sinh học 9

4.2.3 Test kit môi trường 9

5 PHƯƠNG PHÁP 10

5.1 Chẩn đoán phân tử (Molecular diagnostics) 10

5.1.1 Thu thập mẫu 10

5.1.2 Tách chiếc DNA 10

5.1.3 Nhân DNA đặc hiệu 10

5.1.4 Điện di 11

5.1.5 Phân tích kết quả 11

5.2 Chẩn đoán miễn dịch (Immunodiagnostics – immunoassays) 12

5.2.1 Miễn dịch phóng xạ (radio immunoassays) 13

5.2.2 Miễn dịch huỳnh quang (immunofluorescence assays) 13

5.2.3 Miễn dịch enzyme (immunoenzyme assays) 14

6 ỨNG DỤNG SẮC KÝ MIỄN DỊCH TRONG CHẾ TẠO KIT HIV 1/2 23

6.1 Mục đích sử dụng 23

6.2 Tổng quan bộ Kit HIV ½ 23

6.3 Nguyên lý hoạt động 24

6.4 Thành phần, vật tư đi kèm, đặc tính 25

6.5 Hướng dẫn sử dụng Kit HIV ½ 27

6.6 Hạn sử dụng và cách bảo quản kit HIV ½ 28

6.7 Hạn chế sử dụng ở kit HIV ½ 29

7 TỔNG KẾT 31

TÀI LIỆU THAM KHẢO ……… ………32

1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Theo báo cáo của hiệp hội EDMA đã thống kê thị trường IVD trong năm 2011 là0,8 tỷ Euro, trước bối cảnh kinh tế thị trường thì IVD đã cho thấy được tiềm năng tíchcực trước các thị trường cạnh tranh khác trên thế giới

Trước sự trỗi dậy của suy thoái kinh tế, một số phương pháp đã được đưa ra đểmang lại nhiều lợi ích về kinh tế lẫn sức khỏe Các phương pháp ấy đã góp phần tíchcực đến việc rút ngắn giai đoạn kiểm tra đồng thời tăng độ chính xác, từ những lý do

ấy nhóm chúng tôi đã chọn đề tài “Test Kit” làm đề tài báo cáo

2 MỤC TIÊU BÀI BÁO CÁO

Tìm hiểu lịch sử quá trình hình thành “Test Kit”, các loại Kit thử trên thị trườnghiện nay cũng như cơ chế, nguyên lý hoạt động Cuối cùng nhóm chúng tôi muốn giớithiệu bộ Kit thử HIV vừa được Mỹ chế tạo thành công và tung ra thị trường vào ngày3-7-2012 vừa qua

3 LỊCH SỬ HÌNH THÀNH “TEST KIT”

Chúng tôi xin giới thiệu về bộ thử thai, một trong những loại “Test Kit” ra đời sớmnhất phục vụ cho vấn đề sức khỏe:

Năm 1350:

Một trong những văn bản đầu tiên về một

cuộc thử nghiệm thai ở mẫu thử là nước tiểu

được tìm thấy trong một tài liệu Ai Cập cổ đại

Trong một cuộn giấy cói được tìm thấy đã mô

tả lại một cuộc thử nghiệm, trong đó cho thấy

có thể nhận biết một người phụ nữ có mang

thai hay không bằng cách cho người phụ nữ ấy

tiểu lên hạt giống lúa mì và lúa mạch trong vài

ngày: "Nếu hạt lúa mạch phát triển, có nghĩa

thai nhi là bé trai Nếu lúa mì phát triển, có

nghĩa thai nhi là bé gái”

Trong một văn bản năm 155:

Nước tiểu người mẹ mang thai đã được mô

tả như sau: "chanh nhạt màu sắc rõ ràng

nghiêng về phía trắng, có một đám mây trên bề

mặt của nó" Các xét nghiệm khác bao gồm

rượu pha trộn với nước tiểu và quan sát kết

quả Thật vậy, rượu phản ứng với một số

protein trong nước tiểu

Năm 1920:

Các nhà khoa học nhận ra rằng có một loại hormone cụ thể (bây giờ được gọi làhCG) chỉ được tìm thấy ở người phụ nữ mang thai

Năm 1927:

Aschheim và Zondek đã làm một cuộc

thử nghiệm (được gọi là thử nghiệm A-Z)

trong đó xác định sự hiện diện của hCG

trong nước tiểu Để kiểm tra thai kỳ, nước

tiểu của người phụ nữ đã được tiêm vào

một con chuột hoặc chuột chưa trưởng

thành Nếu đối tượng không mang thai, sẽ

không có phản ứng

Trong trường hợp có thai, chuột sẽ hiển

thị một phản ứng động dục (tăng nhiệt độ

cơ thể) Thử nghiệm này ngụ ý rằng trong

thời gian mang thai có một sự gia tăng sản xuất hormone Trong những nghiên cứuban đầu của các cuộc kiểm tra A-Z, các nhà khoa học phát hiện ra rằng khối u tinhhoàn cũng có thể sản xuất hCG

Năm 1930-1940:

Các nhà khoa học xác định hCG bằng cách tiêm mẫu để gây rụng trứng trong thỏ,

ếch, cóc, và chuột Các xét nghiệm nàykhá tốn kém, đòi hỏi sự hy sinh của một

số loài động vật, tốn thời gian lâu để cóđược kết quả Các xét nghiệm cũngkhông nhạy cảm khi đo hàm lượnghormone để chẩn đoán thai vì sự giốngnhau giữa hCG và một chất khác nhưluteinizing hormone (LH)

Herbert Evans phát hiện ra rằng khitiêm chất lỏng nhất định vào các tuyếnsinh dục một con chuột cái sẽ hình

thành một thể vàng lớn bất thường Những chất lỏng này là kích thích tố được gọi làgonadotropins, kiểm tra này là một xét nghiệm miễn dịch chứ không phải là một xétnghiệm sinh học Các thử nghiệm sử dụng hCG tinh khiết, hỗn hợp với một mẫu nướctiểu và các kháng thể trực tiếp chống lại hCG.

Trong một thử nghiệm dương tính, các tế bào màu đỏ kết tụ, hiển thị một mô hình

cụ thể Thử nghiệm này nhanh hơn và rẻ hơn so với các xét nghiệm sinh học cũ,nhưng vẫn còn tương đối không nhạy cảm, đặc biệt là đối với chẩn đoán trong thờigian đầu của thai kỳ Các thử nghiệm đều qua phản ứng với các loại thuốc khác nhau

Năm 1970-1977:

Bắt đầu từ những năm 1970, việc chăm sóc sức khỏe và xét nghiệm tiền sản đã trởthành thường xuyên trong hệ thống chăm sóc sức khỏe ở Mỹ Các xét nghiệm này cóthể được thực hiện sớm nhất là sau bốn ngày người phụ nữ bị mất kinh nguyệt

Các nhà khoa học tại NIH nghiên cứu được nhiều hơn về các tính chất của hCG

Họ đặc biệt quan tâm, trong đó các bộ

phận của nội tiết tố này cho thấy hoạt

tính sinh học Sử dụng các phương

pháp khác nhau, họ đã xác định hai

tiểu đơn vị của hCG và tập trung trên

các tiểu đơn vị beta, tận dụng phát

hiện này, họ đã phát triển một kháng

thể kháng huyết thanh trong cơ thể

người

Trong một cuốn sách giáo khoa

năm 1972t rên gonadotropins,

Vaitukaitis và Ross đã mô tả miễn dịch

phóng xạ tiểu đơn vị beta-hCG mà

cuối cùng có thể phân biết giữa hCG

và LH, do đó làm cho nó có khả năng

hữu ích như là một thử nghiệm đầu

tiên cho việc mang thai Đến cuối năm 1977, que thử thai đã được chế tạo thành công

và tung ra thị trường Hoa Kỳ

4 KHÁI NIỆM VÀ PHÂN LOẠI “TEST KIT”

4.1 Khái niệm

Là một bộ dụng cụ dùng để đo, chẩn đoán, kiểm tra, xét nghiệm, phát hiện bệnhhọc, vi sinh vật hoặc nồng độ các chất trong mẫu phẩm ở môi trường,…Thay vì phảithực hiện hàng loạt các phản ứng sinh hóa, lý hóa khá phức tạp và tốn kém thì hàngloạt bộ thử này được ra đời để khắc phục các nhược điểm trên với độ chính xác khôngthua kém gì những quy trình kiểm tra truyền thống phức tạp

Test Kit là minh chứng cho sự tiến bộ cho khoa học, góp phần không nhỏ vàocông cuộc đẩy mạnh tiến độ khoa học cũng như giảm thiểu được gánh nặng cho nhiềulĩnh vực nghiên cứu và ứng dụng trong cuộc sống

- Khả năng sinh sản, mang thai

4.2.2 Test kit sinh học

a/ Kiểm nghiệm thực phẩm:

Hình 1.1 Bộ kiểm tra đường huyết

4.2.3 Test kit môi trường

a/ Môi trường nước:

- Bộ thuốc thử độ kiềm

- Bộ thuốc thử clorua

- Bộ thuốc thử độ acid

- Bộ thuốc thử carbon dioxit

- Bộ thuốc thử amoniac trong

- Test kit phát hiện khí gas

- Test kit phát hiện CO2 trong nước

Hình 1.2 Bộ kiểm tra hàn the

Hình 1.3 Bộ đo PH trong nước

5.1.2 Tách chiết DNA

Nhiều quy trình tách chiết ADN của thế giới đã được thử nghiệm và thích ứngvới điều kiện nước ta Góp phần giảm giá thành, đảm bảo chất lượng và số lượngADN từ những lượng mẫu nhỏ

5.1.3 Nhân DNA đặc hiệu

Các hỗn hợp hoá chất khác nhau và các chu trình nhiệt đã được thử nghiệmcho từng cặp mồi, nhiều cặp mồi Do đó đã tối ưu hoá thành phần của từng hỗn hợp,từng chu trình nhiệt

5.1.4 Điện di

Gel polyacrylamid: Dùng để

tách biệt các đoạn ADN có độ dài ngắn

khác nhau (thường dùng để phân li các

đoạn nucleic acid nhỏ hơn 1 kb) Các

yếu tố liên quan đã được lựa chọn và

tối ưu hoá, hạ giá thành đáng kể và

tăng độ phân giải lên hàng trăm lần,

giúp phân biệt rõ các đoạn ADN chỉ

lệch nhau 3 - 4 nucleotid

Gel agarose: Cho phép phân li

nucleicacid lớn hơn 1 kb Hình 1.4 Điện di trên gel.

Máy điện di mao quản ABI 3130 cho phép tách biệt các đoạn ADN có độ dàichỉ khác nhau 1 nucleotid Máy này được sử dụng trong hầu hết các xét nghiệm phântích ADN

5.1.5 Phân tích kết quả

Kết quả cuối cùng là

những biểu đồ như hình bên

Các alen có độ dài khác nhau

của các lôcut gen hiện rõ, quan

sát được bằng mắt thường Các

biểu đồ như thế đã được phân

tích và lưu giữ tại phòng thí

nghiệm

Hình 1.5 Quy trình chẩn đoán phân tử

5.2 Chẩn đoán miễn dịch (Immunodiagnostics – immunoassays)

Đáp ứng miễn dịch của động vật được sử dụng trong hai cách chẩn đoán cơbản Thứ nhất, kháng thể đặc hiệu có thể được sử dụng để xác định hoặc nhận biếtmột kháng nguyên Kháng nguyên này có thể liên quan tới tác nhân lây nhiễm hoặcđơn giản chỉ là phân tử cần được định vị hoặc đo lường (ví dụ: kháng sinh, độc tố, ).Thứ hai, với việc phát hiện sự hiện diện của kháng nguyên đặc hiệu trong huyết thanh

có thể xác định một cá thể đã bị phơi nhiễm trước đó hay không với một sinh vật cụthể Điều này sẽ hỗ trợ việc thiết lập một chẩn đoán hoặc xác định mức độ biểu hiệncủa chúng với sinh vật này Việc đo lường tương tác giữa kháng nguyên và kháng thểtrong mục đích chẩn đoán được gọi là huyết thanh học

Các kỹ thuật chẩn đoán huyết thanh học có thể được chia thành ba mảng Cácthử nghiệm gắn kết sơ cấp: trục tiếp đo lường sự kết hợp của kháng nguyên và khángthể Các thử nghiệm gắn kết thứ cấp: đo lường kết quả của tương tác giữa kháng

nguyên và kháng thể trong in vitro.Những thử nghiệm này thường ít nhạy hơn các thử

nghiệm sơ cấp, nhưng lại là kỹ thuật đơn giản hơn Thử nghiệm phức tạp nhất là thử

nghiệm in vivo: Đo lường kết quả bảo hộ thực tế của kháng thể trên động vật.

Hình 1.6 Cơ chế hoạt động trên kit thử

5.2.1 Miễn dịch phóng xạ (radio immunoassays)

Phương pháp này để tìm nồng độ hocmon peptit trong hệ thống sinh học Cácđồng vị phóng xạ được dùng để đánh dấu hocmon mà sau đó được đưa cùng với cáckháng thể đặc hiệu vào các mô hoặc dung dịch cần phân tích Số hocmon đánh dấuliên kết với kháng thể đếm được chỉ ra mối tương quan trong mẫu (vì hocmon khôngđánh dấu cạnh tranh để ngăn chặn sự kết hợp của hocmon đánh dấu) Nồng độhocmon không đánh dấu có thể tìm thấy bằng cách so sánh mức độ ức chế do cạnhtranh tạo ra với độ chuẩn

5.2.2 Miễn dịch huỳnh quang (immunofluorescence assays)

Những thuốc nhuộm huỳnh quang như Fluorescein, Rhodamin có thể kếthợpvới kháng thể mà không phá hủy tính chất đặc hiệu của kháng thể Khángthể liên hợp ấy có khả năng kết hợp với kháng nguyên và phức hợp KN-KT

có thể quan sát ở kính hiển vi huỳnh quang

Hình 1.7 Miễn dịch huỳnh quang

a/ Phương pháp trực tiếp

Kháng thể được liên hợp với thuốc nhuộm huỳnh quang rồi cho tácdụngvới kháng nguyên Ví dụ trong chẩn đoán vi khuẩn tả sau 6 - 8 giờnuôi cấy ở nước pepton kiềm, làm một phiến phết rồi nhuộm với khánghuyết thanh liên h ợp v ớ i F l u or es c e i n Q u a n s át ở k í n h h iể n v i h uỳ nh

q u a n g , t a p h á t h iệ n th ấy khuẩn tả phát huỳnh quang xanh lục nếu màu phândương tính

b/ Phương pháp gián tiếp

Kháng thể được cho tác dụng trực tiếp với kháng nguyên rồi cho kếthợp với kháng globulin người liên hợp với Fluorescein Trước hết cho kháng nguyên

cố định lên tiêu bản rồi cho tác dụng với huyết thanh bệnh nhân, rửa để loại

bỏ kháng thể thừa sau đó nhỏ một giọt globulin người gắn Fluorescein rồi quan sát ởkính hiển vi huỳnh quang Phương pháp này được sử dụng để chẩn đoán bệnh giangmai (phản ứng FTA - Abs), bệnh tự miễn Phương pháp gián tiếp có nhiều ưu điểmnhư: Sự phát huỳnh quang mạnh hơn, tiết kiệm được thời gian nếu nhiều huyết thanhđược thử nghiệm cùng một lúc

5.2.3. Miễn dịch enzyme (immunoenzyme assays)

Kỹ thuật này sử dụng kháng thể hoặc kháng nguyên cố định vào một tấmpolystyren Sau đó nó được dùng để bắt kháng nguyên hoặc kháng thể đối ứng ởdung dịch thử nghiệm và phức hợp được phát hiện nhờ enzyme gắn vớikháng thể hoặc kháng nguyên tác động lên cơ chất đặc hiệu Cơ chất của enzyme thủyphân đo ở quang phổ kế, tỷ lệ với nồng độ của kháng thể hoặc kháng nguyên khôngbiết ở trong dung dịch thử nghiệm Kháng nguyên hoặc kháng thể liên hợp vớienzyme vẫn giữ hoạt tính miễn dịch

Enzyme được sử dụng có thể là photphatase kiềm hoặc peroxydase Thửnghiệm cho kết quả khách quan và rất nhạy Thử nghiệm miễn dịch liên kết enzyme

được áp dụng để chẩn đoán những vi khuẩn như giang mai, Brucella, Salmonella, vikhuẩn tả và các virus như virus viêm gan, virus sởi, virus rota

Phương pháp ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay- xét nghiệm hấpthụ miễn dịch liên kết với enzyme) có rất nhiều dạng mà đặc điểm chung là đều dựatrên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể đượcgắn với một enzyme Khi cho thêm cơ chất thích hợp (thường là nitrophenolphosphate) vào phản ứng, enzyme sẽ thủy phân cơ chất thành một chất có màu Sựxuất hiện màu chứng tỏ đã xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể với kháng nguyên

và thông qua cường độ màu mà biết được nồng độ kháng nguyên hay kháng thể cầnphát hiện

Phương pháp này được thiết kế cho việc phát hiện và định lượng vật chất nhưpeptides, protein, antibodies, hormone,… Đôi khi nó còn được gọi bởi một tên gọikhác là EIA (Enzyme ImmunoAssay) Kĩ thuật này khá nhạy và đơn giản, cho phép taxác định kháng nguyên hoặc kháng thể ở một nồng độ rất thấp (khoảng 0,1 ng/ml) Sovới kĩ thuật miễn dịch phóng xạ (RIA- Radio Immuno Assay) thì kĩ thuật này rẻ tiền

và an toàn hơn mà vẫn đảm bảo độ chính xác như nhau ELISA được dùng để xácđịnh nhiều tác nhân gây bệnh như virus, vi khuẩn, nấm, kí sinh

Kĩ thuật ELISA gồm ba thành phần tham gia phản ứng là: kháng nguyên,kháng thể và chất tạo màu; thực hiện qua hai bước:

- Phản ứng miễn dịch học: Là sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể

- Phản ứng hóa học: Thông qua hoạt tính xúc tác của enzyme làm giải phóngoxy nguyên tử [O] từ H2O2 để oxy hóa cơ chất chỉ thị màu, do đó làm thay đổi màucủa hỗn hợp trong dung dịch thí nghiệm

Hình 1.8 Quy trình thực hiện kỹ thuật ELISA

a/ Phân loại ELISA

ELISA trực tiếp (Direct ELISA)

Direct ELISA: Đây là dạng đơn giản nhất của phương pháp ELISA Trong đó,kháng nguyên cần phát hiện sẽ được gắn trực tiếp lên bề mặt giá thể và sẽ được pháthiện bằng một kháng thể duy nhất (kháng thể này đã được gắn enzyme)

Ưu điểm: L à k ỹ thu ật đơn giản nhất

Nhược điểm:

+ Độ đặc hiệu bị giới hạn vì thường thì kháng nguyên có ít nhất là 2 epitope(trình diện kháng nguyên) mà phương pháp này chỉ sử dụng 1 kháng thể gắn vào mộtepitope

+ Phải đánh dấu cho từng kháng thể chuyên biệt với từng đối tượng

Hình 1.9 Tiến trình thực hiện phản ứng ELISA trực tiếp

ELISA gián tiếp(In Direct ELISA)

Phương pháp này khác Direct ELISA ở

Ưu điểm: Kháng thể gắn enzyme có thể

sử dụng để đánh dấu cho nhiều loại kháng

nguyên nên tiện lợi và kinh tế hơn, dễ dàng

thương mại hóa

Hình 2.1 Tiến trình thực hiện phản ứng ELISA gián tiếp