TRƯỜNG ĐẠI HỌC QUY NHƠN Khoa Khoa học Tự nhiên Lớp Sinh học thực nghiệm 24B BÁO CÁO THỰC HÀNH MÔN KỸ THUẬT PHÂN TÍCH HÓA SINHBình Định, tháng 8 năm 2022 Giảng viên hướng dẫn Tiến sĩ Trương Thị Huệ Học.
Trang 1TRƯỜNG ĐẠI HỌC QUY NHƠN Khoa Khoa học Tự nhiên
Lớp : Sinh học thực nghiệm 24B
BÁO CÁO THỰC HÀNH
MÔN : KỸ THUẬT PHÂN TÍCH HÓA SINH
Bình Định, tháng 8 năm 2022
Giảng viên hướng dẫn : Tiến sĩ Trương Thị Huệ
Học viên : Phan Thị Lý
Trang 2I XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ENZIM CATALAZA BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHUẨN ĐỘ :
1 NGUYÊN LÝ :
- Dựa vào hàm lượng peroxit ( H2O2) bị thủy phân dưới tác dụng của enzim catalaza bằng cách chuẩn độ với dung dịch KMnO4 theo phương pháp Bakh – Oparin.
Phương trình phản ứng : 5H2O2 + 2KMnO4 + 3H2SO4= 2MnSO4 + K2SO4 + 5O2 + 8H2O
Khi KMnO4 dư thì phản ứng có màu hồng nhạt.
(KMnO4 vừa là chất chỉ thị màu vừa là chất oxy hóa H2O2 trong môi trường axit)
2 NGUYÊN LIỆU VÀ HÓA CHẤT :
a Nguyên liệu :
- Củ khoai tây tươi
b Hóa chất :
- H2O2 1%
- Nước cất
- KMnO40,1N; H2SO410%
3.THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ :
- Pipet, cối , chày sứ, giấy lọc, phễu lọc.
- Cốc đong, đĩa petri.
4 TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM :
- Cân 5 g nguyên liệu khoai tây tươi cắt nhỏ và nghiền lạnh trong cối để tạo dung dịch đồng nhất.
- Thêm 20ml nước cất để tạo dung dịch rồi cho vào bình định mức 50ml, sau đó dẫn nước đến vạch 50ml, lắc đều hỗn hợp, sau 30 phút đem lọc hoặc li tâm.
- Lấy 2 bình nón, cho vào 20ml dung dịch lọc, đun sôi bình kiểm tra trong 2 phút để làm mất hoạt tính của enzim, sau đó để nguội bình
- Thêm vào mỗi bình 20ml nước cất và 3ml dung dịch H2O2 1% để ở nhiệt độ 370C trong 30 phút
- Thêm vào mỗi bình 4ml H2SO4 10%
- Chuẩn độ bằng KMnO4 0,1N đến khi xuất hiện màu hồng nhạt bền trong 30 giây
- Số mg H2O2 bị phân giải bởi enzim catalaza trong 1 g khoai tây được tính theo công thức :
X = (a−b ) f V 1 1,7
V 2 w
Trong đ ó X : Hoạt độ của enzim catalaza tính theo mg H2O2 của nguyên liệu bị phân giải
a : số ml dung dịch KMnO4 0,1N dùng để chuẩn độ bình kiểm tra
b : số ml dung dịch KMnO4 0,1N dùng để chuẩn độ bình thí nghiệm
Trang 3f : hệ số chỉnh lý dung dịch KMnO4 0,1N
1,7 : số mg H2O2 tương ứng với 1ml dung dịch KMnO4 0,1N
W : khối lượng nguyên liệu mẫu (gam)
V1 : Thể tích dung dịch enzym ban đầu
V2 : Thể tích dung dịch enzym lấy để nghiên cứu
Số đơn vị catalaza trong 1 g khoai tây/µmol H202 bị phân giải trong 1 phút là :
30.0,034
Trong đó:
30 – Thời gian enzym tác dụng ( phút)
0,034 –Micromol H2O2 (mg)
5 TÍNH KẾT QUẢ :
Kết quả :
a = 5,6 ml
b = 5,5 ml
- Hoạt độ của enzim catalaza tính theo mg H2O2 của nguyên liệu bị phân giải:
X = (a−b ) x 1 x 50 x 1,7
(5,6−5,5 ) x 1 x 50 x 1,7
Số đơn vị catalase trong 1 gam nguyên liệu ( micromol H2O2 bị phân giải sau 1 phút) là :
X
30 x 0,034=
0,085
30 x 0,034=0,083 đơn vị
6.NHẬN XÉT KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM:
- Có sự chênh lệch rất ít về kết quả chuẩn độ giữa mẫu thí nghiệm và đối chứng, chứng tỏ có phản
ứng xúc tác xảy ra ở mẫu thí nghiệm nhưng không rõ ràng, nguyên nhân có thể do quy trình chuẩn
độ chưa chính xác hoặc dung dịch chuẩn độ không đảm bảo Cần thực hiện lại thí nghiệm đủ 3 lần
để có kết quả thuyết phục hơn
BÀI HỌC:
- Biết được cách tiến hành thí nghiệm xác định hoạt độ của enzim catalaza
- Phải để enzim tác động đến cơ chất trong thời gian 30 phút
- Thêm vào mỗi bình 4ml H2SO4 10% để giữ pH môi trường phản ứng
- Thí nghiệm chứng minh phản ứng xúc tác của enzim xảy ra ở điều kiện phòng
- Đây là phương pháp xác định hoạt độ enzim dựa vào nguồn sản phẩm tạo thành.
- Để kiểm tra hoạt độ của enzim cần thực hiện đồng thời thí nghiệm đối chứng : bất hoạt enzim dưới tác động của nhiệt độ.
Trang 4II XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ SUPER OXI DE DISMUTASE :
1 NGUYÊN LÝ :
- Super oxide dismutase (SOD ) là enzyme phân hủy gốc superoxide (O2- ) để tạo oxy phân tử và
H2O2 Tuy vậy, O2- là chất chứa oxy phản ứng và độc tính cao, kém bền, vì vậy để xác định hoạt
độ của SOD, cơ chất phải được tạo ra trực tiếp trong hỗn hợp phản ứng
- Nitroblue tetrazolium (NBT) bị khử khi tiếp xúc với ánh sáng bởi các gốc superoxide, NBT cạnh
tranh với SOD về anion superoxide Sự có mặt của SOD trong hỗn hợp phản ứng NBT sẽ tạo ra phức chất màu ít hơn đối chứng
- Một đơn vị hoạt độ SOD được xác định là lượng enzyme cần thiết để gây ra sự ức chế 50% NBT khử ở bước sóng 560 nm
NGUYÊN LIỆU VÀ HÓA CHẤT :
a Nguyên liệu :
- Củ khoai tây tươi
b Hóa chất :
- Na2CO3 1,5M
− Nước cất
- Ribôflavin 60µM
3.THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ :
- Pipet, cối, chày sứ, giấy lọc, phễu lọc.
- Cốc đong, đĩa petri.
- Máy ly tâm lạnh (Mikro 22R- Hattich, Đức), máy đo quang phổ (Pharmacia LKB – Ultraspec, Denmark)
4 TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM :
- Nghiền lạnh mẫu : 0,5 g mẫu + 1,5 ml đệm photphat ( Kaliphotphat hoặc NaH2SO4 ) 0,2M , pH = 7,0
Ly tâm 10.000 vòng trong 10 phút ở nhiệt độ 40 0 C.
- Hỗn hợp phản ứng bao gồm :
+ 0,05 ml dịch chiết chứa enzyme.
+ 0,2 ml methionine 200mM
+ 0,1ml EDTA (etylen diamine axit tetra axetic) 3mM
+ 0,1 ml NBT 2,25mM
+ 1,5ml dung dịch đệm photphat 0,1M, pH 7,5.
+ 1ml H20 cất
+ 0,1 ml Na2CO3 1,5M.
+ 0,1ml Ribôflavin 60µM.
- Cho hỗn hợp phản ứng vào đèn huỳnh quang ở bước sóng màu xanh, đo độ hấp thụ ở bước sóng 560nm.
- Ống đối chứng là hỗn hợp như trên nhưng không có enzym.
5 TÍNH KẾT QUẢ :
Trang 5Tính hoạt độ superoxidase dismutase, bằng đơn vị trên lít (U/l) của mẫu:
a= V 1 x ∆ A x f x 1000
ε x d xV 2 x 2.
Trong đó:
V1 là tổng thể tích dung dịch thử (ml);
V 2 là thể tích pha loãng mẫu(ml);
∆A là chênh lệch độ hấp thụ, (A 0 – A enzym);
ε là độ hấp thụ của NBT khử ở bước sóng 560 nm ( Hằng số)
d là chiều dài đường quang của cuvet, tính bằng centimet (cm) (d = 1,0 cm);
f là hệ số pha loãng
1000 là hệ số chuyển đổi đơn vị trên lít [U/l];
2 là hệ số tỷ lượng
Công thức thí
nghiệm
Hàm lượng gốc tự do O2 •-còn lại sau phản ứng :
Hoạt độ enzyme superoxide dismuatase ( đơn
vị hoạt độ /g trọng lượng tươi)
Hàm
lượng
enzim
SOD
0,05 ml 3,15 x 0,001 x 20 x 1000
31,5
ε
31.5
ε 0,5=
63
ε
0,1ml ( gấp đôi
lượng enzym) 3,15 x 0,027 x 10 x 1000
422,5
ε
425,5
ε 0,5=
850,5
ε
Blank : 0,133
TN1 : 0,132
TN2: 0,106 ( Gấp đôi lượng enzim)
6 NHẬN XÉT KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM :
Nguyên nhân :
- Do sai thao tác trong tiến hành thí nghiệm
- Mẫu prôtêin chuẩn bị không được chuẩn
- Hóa chất chuẩn bị cho thí nghiệm không được chuẩn
- Máy đo OD không chuẩn
1 NGUYÊN LÝ :
BÀI HỌC:
- Biết được vai trò và cách tiến hành thí nghiệm xác định hoạt độ của enzim Super oxide dismutase
- Phải nghiền lạnh mẫu
- Tiến hành thí nghiệm lặp lại 3 lần để có kết quả chính xác
Bài 2 ĐỊNH LƯỢNG PRÔTÊIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP BIURÊ
Trang 6Trong môi trường kiềm, Prôtêin kết hợp với Cu2+ có trong thuốc thử Biurê tạo thành phức chất màu xanh tím có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 540nm, cường độ màu của phản ứng tỉ lệ với liên kết peptit (- CO – NH -) có mặt trong chuỗi phản ứng
- Xác định hàm lượng prôtêin theo đường chuẩn albumin huyết thanh bò
2 NGUYÊN LI ỆU VÀ HÓA CHẤT :
a Nguyên liệu :
- Prôtêin cần xác định ( dung dịch prôtêin mẫu cần phân tích) : lòng trắng trứng
b Hóa chất :
- Chuẩn bị dung dịch Prôtêin chuẩn (Dung dịch albumine) 1%
− Nước cất
− Chuẩn bị thuốc thử Biurê
- NaCl
3.THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ :
- Micro pipet
- Cốc đong, đĩa petri.
- Máy quang phổ UV- VIS (ánh sáng nhìn thấy), máy ly tâm
4 TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM :
a Xây dựng đồ thị chuẩn :
- Lấy 6 ống nghiệm đánh số từ 1 đến 6, cho các chất tham gia phản ứng vào từng ống nghiệm theo bảng sau :
TT Prôtêin 1%
(ml)
NaCl (ml)
Thuốc thử Biurê (ml)
Hàm lượng
prôtêin(mg)
OD540nm (Kết quả sau khi đo)
Lắc đều, để yên các ống nghiệm trong 20 phút ở nhiệt độ phòng Sau đó đo mật độ quang ở bước sóng 540nm Gía trị OD540 của các ống nghiệm từ 2 đến 6 sau khi trừ đi OD540 của ống nghiệm 1 sẽ xây dựng được đồ thị biểu diễn sự biến thiên của mật độ quang theo nồng độ protein chuẩn BSA ( Đồ thị đường chuẩn Prôtêin 1%)
Hoặc chúng ta có thể chuẩn máy đo quang phổ với dung dịch chỉ chứa dung dịch đệm (ống 1) ở bước sóng 595nm Chỉnh về giá trị 0, sau đó tiến hành đo các ống còn lại
b Chuẩn bị prôtêin mẫu cần xác định :
- Lấy 3 g lòng trắng trứng cho vào bình định mức 50ml, dùng NaCl 9% để dẫn đến vạch bình
Trang 7- Cho vào ống nghiệm 1 ml mẫu nghiên cứu và 4 ml dung dịch thuốc thử Biurê rồi lắc đều, để yên
30 phút ở nhiệt độ phòng, dung dịch có màu xanh
- So màu ở bước sóng 540nm, xác định mật độ quang học của dung dịch nghiên cứu
- Lấy giá trị OD540 của mẫu trừ đi OD540 của ống nghiệm thay mẫu bằng nước cất rồi chiếu vào đồ thị chuẩn để suy ra lượng prôtêin có trong dung dịch mẫu
5 TÍNH KẾT QUẢ :
- Đường chuẩn prôtêin 1% có trị số R2 = 0.9929
Đường chuẩn prôtêin có phương trình là:
Y = 0,0506 X + 0,00107
- Trong đó:
X: Hàm lượng prôtêin (mg) Y: Chỉ số OD540nm
Ymẫu = 0,547
Thay vào phương trình ta được hàm lượng prôtêin có trong 3g lòng trắng trứng
Trang 8Ymẫu = 0.547 = ( 0.0506 Xmẫu + 0.00107 ) Xmẫu = 10,789 (mg)
Vậy hàm lượng prôtêin trong 1 g mẫu là : 3,596(mg)
6 NHẬN XÉT KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM :
- Giá trị đo OD540 của mẫu vượt quá giá trị OD540 của đường chuẩn không nhiều nên nồng độ prôtêin tính được có thể chấp nhận
1 NGUYÊN LÝ :
-Xác định hàm lượng prôtêin tổng số trên 1g dựa vào phương pháp Bradford bằng cách đo hấp thụ quang của dịch chiết protein ở λ=595 nm
BÀI HỌC:
- Biết cách xây dựng đồ thị prôtêin đường chuẩn
- Các thao tác thí nghiệm phải chính xác, từng giọt dung dịch phải chuẩn.
- Biết cách tính hàm lượng prôtêin cần xác định dựa trên đồ thị đường chuẩn
- Thời gian để phản ứng xảy ra : 30 phút
- Cần lặp lại thí nghiệm 3 lần để có độ tin cậy tốt nhất.
Bài 3 ĐỊNH LƯỢNG PRÔTÊIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP BRADFORD
Trang 9- Các phân tử prôtêin khi phản ứng với thuốc thử CBB( Coomasie Brilliant Blue) hay thuốc thử Bradford hoặc G -250 sẽ hình thành hợp chất có màu xanh nước biển có khả năng hấp thụ ánh sáng
cực đại ở bước sóng λ= 595 nm (trong môi trường mang tính acid trong dung dịch, khi chưa gắn
với prôtêin thì thuốc nhuộm ở dạng màu đỏ có bước sóng hấp thụ cực đại 465 nm) và cường độ màu
sẽ tỉ lệ với nồng độ prôtêin có trong dung dịch
- Phương pháp này có độ nhạy cao, cho phép xác định prôtêin chỉ vài microgam/lit, dễ thực hiện, tiết
kiệm thời gian.
- Xác định hàm lượng prôtêin 0,1% theo đường chuẩn albumin huyết thanh bò
2 NGUY ÊN LI ỆU VÀ HÓA CHẤT :
a Nguyên liệu :
- Prôtêin cần xác định ( dung dịch prôtêin mẫu cần phân tích)
+ Cân 0,5 g lòng trắng trứng cho vào bình định mức 50ml
+ Dùng dung dịch NaCl 0,9% hoặc nước cất để dẫn đến vạch 50ml của bình định mức
+ Khi tiến hành thí nghiệm, pha loãng prôtêin gốc 5 - 10 lần )
b Hóa chất :
- Chuẩn bị dung dịch Protein chuẩn BSA nồng độ 1mg/ml : (Dung dịch albumine 0.1%.)
− Nước cất
− Chuẩn bị thuốc thử Bardford : thành phần thuốc thử trong 100 ml như sau:
+ Coomassie Brilliant Blue : 0.001g
+ Ethanol tuyệt đối : 4.7 g.
+ Phosphoric acid: 85%
3.THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ :
- Micro pipet, giấy lọc
- Cốc đong, đĩa petri.
- Máy quang phổ kế UV- V I S (ánh sáng nhìn thấy), máy ly tâm
4 TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM :
- Cho vào ống nghiệm : 200 μL dung dịch prôtêin mẫu pha loãng + 2,3 ml dung dịch bradford rồi
lắc đều, sau 3 phút đo ở bước sóng 595 nm
TT Prôtêin
0,1% (μL)
Nước cất (ml)
Thuốc thử Bradford(ml )
Hàm lượng
prôtêin(μg)
OD595nm lần 1
Trang 106 50 150 2,3 50 2,140
-Mẫu blank thay mẫu bằng nước cất
5 TÍNH KẾT QUẢ :
- Đường chuẩn prôtêin có trị số R2 = 0.4861 ( lần 1) Vì đồ thị đường chuẩn chưa chính xác nên không thể làm căn cứ để xác định hàm lượng prôtêin mẫu.
Nguyên nhân :
+ Máy đo có vấn đề nên trị số thiếu chính xác
+ Mẫu prôtêin chuẩn không chuẩn do yếu tố ngoại cảnh trong quá trình bảo quản
+ Hóa chất chuẩn bị cho phòng thí nghiệm chưa chuẩn
Vì vậy nên chúng ta cần thực hiện thí nghiệm 3 lần để xây dựng đồ thì chuẩn chính xác nhất
Đường chuẩn tham khảo :
Đường chuẩn prôtêin có phương trình là:
Y = 0,0036 X - 0,0011
- Trong đó:
X: Hàm lượng prôtêin (μg)
Y: Chỉ số OD595nm
Trang 11Y1 = 1.898 ( mẫu pha loãng 5 lần)
Y2 = 1.966 (mẫu pha loãng 10 lần)
Lúc này, OD595 của mẫu lớn hơn OD595 đường chuẩn thì chúng ta tăng hàm lượng prôtêin lên 12 lần.
Vậy hàm lượng lòng trắng trứng đem phân tích : 6 g
Hàm lượng
prôtêin mẫu(μg)
X1 = (1,898+0,00110,0036 )x 5=¿ 2637(μg)
X2 = (1,996+0,00110,0036 )x 10=¿5548(μg) Vậy hàm lượng prôtêin trong 1 g mẫu lần lượt là : 0,4395(μg) ở mẫu pha loãng 5 lần và 0,9246 (μg)
ở mẫu pha loãng 10 lần
6 NHẬN XÉT KẾT QUẢ THÍ NGIỆM :
- Giá trị OD595 của mẫu vượt ra xa ngoài giá trị OD595 trên đường chuẩn cho nên nồng độ prôtêin có được nhờ tính toán khả năng chính xác không cao
- Với đồ thị đường chuẩn tham khảo thì hàm lượng protein phân tích rất thấp, chứng tỏ phương pháp này có độ nhạy cao
BÀI HỌC:
- Biết cách xây dựng đồ thị prôtêin đường chuẩn
- Biết cách tính hàm lượng prôtêincó trong mẫu khi không pha loãng và pha loãng.
- Chú ý thời gian bảo quản mẫu prôtêin chuẩn.
- Để tăng độ chính xác của đường chuẩn, tương ứng với mỗi nồng độ chuẩn BSA nên lặp lại 3 lần (sử dụng 3 lần nhắc lại hoặc 3 ống nghiệm cho 1 lần)
- Phương pháp có những ưu điểm và nhược điểm :
Ưu điểm :
+ Độ nhạy cao, có thể xác định ít nhất từ 1 µg đến 20 μg prôtêing prôtêin
+ Ít tốn thời gian Tổng thời gian cần thiết để thiết lập và hoàn thành xét nghiệm là dưới 30 phút
+ Toàn bộ thí nghiệm được thực hiện ở nhiệt độ phòng.
Nhược điểm:
+ Phương pháp Bradford là tuyến tính trong phạm vi ngắn, thường từ 0 µg/mL đến 2000 µg/mL nên thường phải pha loãng trước khi phân tích mẫu
+ Các lỗi trong quá trình pha loãng có thể dẫn đến mối quan hệ tuyến tính của các số liệu không được chính xác.
+ Thuốc thử có xu hướng nhuộm các ống nghiệm, các vết bẩn sẽ ảnh hưởng đến việc đọc độ hấp thụ + Nhạy cảm với thời gian nên cần đảm bảo mẫu được ủ trong cùng một lượng thời gian để so sánh chính xác.
Trang 12Phương pháp Bertrand
I NGUYÊN TẮC :
Tất cả các nhóm aldehyd hay nhóm ceton tự do trong những điều kiện xác định có khả nămg khử
Cu2+ thành kết tủa Cu2O
Vì vậy, phương pháp này dùng để định lượng các loại aldose, cetose, các disaccharide có tính khử
- Nguyên tắc:
+ Dựa vào phản ứng oxy hóa khử giữa đường khử ( glucozơ, fructozơ, mantozơ, ) với ion kim loại để xác định hàm lượng đường khử có trong mẫu
+ Khi đun sôi dịch kiềm của Cu2+ ( Fehling A và B ) với dung dịch đường sẽ tạo thành kết tủa Cu2O màu đỏ gạch (đường khử Cu 2+ Cu+ ), sau khi rửa bằng nước, hòa tan kết tủa
Cu2O bằng Fe2(SO4)3, Cu + sẽ chuyển thành Cu 2+ và Fe3+ sẽ chuyển thành Fe2+
+ Định lượng Cu 2+ bằng dung dịch KMnO4 0.1N
Chuẩn độ Fe2+ bằng dung dịch KMnO4 0.1N , biết lượng KMnO4 đã dùng để tính ra lượng đồng
Từ lượng đồng ấy, đối chiếu bảng cho sẵn sẽ tính được lượng đường trong mẫu
Các phản ứng xảy ra như sau :
Phản ứng Fehling(Phản ứng kết tủa Cu2O) :
Phản ứng kết tủa Cu2O màu đỏ sẽ bị sulfat sắt III hòa tan :
Cu2O + Fe2(SO4 )3 + H2SO4 2CuSO4 + 2FeSO4 + H2O
Phản ứng chuẩn độ bằng dung dịch KMnO4 0.1N :
10 FeSO4 + 2KMnO4 + 8H2SO4 5Fe2(SO4)3 + K2SO4 + 2MnSO4 + 8H2O
2 HÓA CHẤT, MẪU VẬT :
2.1 M ẫu : Quả nhãn chín
Bài 4 XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ĐƯỜNG TRONG MẪU TRÁI CÂY :
- XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ĐƯỜNG TỔNG SỐ
- XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ
Trang 132.2 Hóa chất :
- Thuốc thử Fehling = Fehling A+ Fehling B tỉ lệ 1:1.
+ Fehling A : 40g CuSO4.5H2O trong 1 lit nước cất
+ Fehling B : 20g natrikali tartrate( C4H4O6NaK.4H2O) và 150g NaOH trong 1 lít nước cất
- Dung dịch Fe 2 (SO 4 ) 3 trong H 2 SO 4 :
Fe 2 (SO 4 ) 3 : 50 g Fe 2 (SO 4 ) 3 + 20g H 2 SO 4 , thêm nước cất đến 1 lít.
- Dung dịch KMnO 4 0.1N
3 THIẾT BỊ, DỤNG CỤ :
- Bình tam giác, bình định mức, cốc, phễu lọc, chày và cối sứ
- Pipet
- Giấy lọc, cân (chính xác 0.001g)
- Bếp điện
4.TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM :
a Giai đoạn 1: Chiết rút đường ( Chuẩn bị mẫu)
+ Cân 2 gram thịt quả nhãn cho vào cối sứ, nghiền thật nhuyễn thành dung dịch đồng nhất.
+ Cho 20ml nước cất vào cối, tiếp tục nghiền rồi khuấy đều, sau đó chuyển sang cốc định mức + Dùng nước cất dẫn đến mức 100ml của cốc
+ Cho lên phễu lọc có giấy lọc chuyên dụng thu được dịch lọc có chứa đường khử
b Giai đoạn 2: Phản ứng với dung dịch Fehling:
Cho vào bình nón 5 ml dung dịch lọc và 20ml Fehling, đậy bình bằng phễu nhỏ và đặt trên bếp
có amiăng đun sôi Khi thấy bọt khí đầu tiên xuất hiện và có kết tủa đỏ gạch tính thời gian 3 phút, để nguội cho kết tủa lắng
c Giai đoạn 3: Rửa kết tủa Cu2O
+ Chiết từ từ dung dịch trong bình nón ( lắc đều trước khi chắt) có kết tủa qua phễu có giấy lọc, thu được Cu20 màu đỏ gạch và Fehling trên giấy lọc
+ Dùng nước cất ấm để rửa kết tủa Cu20 Quá trình rửa cần cho nước cất ấm vào dần dần,
để ngăn tủa tiếp xúc với không khí., thử pH của dung dịch rửa trong bình tam giác khi không còn tính kiềm là kết thúc quá trình rửa
d Giai đoạn 4: Hòa tan kết tủa Cu2O:
+ Dùng 10ml Fe2(SO4 )3 trong H 2 SO 4 nhỏ vào kết tủa Cu20 có trên giấy lọc để hòa tan hoàn toàn Cu20
+ Dùng nước cất ấm đã đun sôi rửa axit trên giấy lọc, đến khi không còn phản ứng acid là kết thúc giai đoạn này
e Giai đoạn 5: Chuẩn độ bằng dung dịch KMnO4 0.1N