Phương pháp giải trình tự gen doc

Giải trình tự gen DNA sequencing là phương pháp xác định vị trí sắp xếp các nucleotid trong phân tử DNA.1.1.Khái Niệm:... Bước 2 : Thực hiện các phản ứng hóa học đặc hiệuCó thể sử dụng 4

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TP.HCM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & THỰC PHẨM



ĐỀ TÀI BÁO CÁO :

LỚP: DHSH07LT SVTH: Nhóm 15 GVHD: Th.s Trần Hồng Bảo Quyên

1 Nguyễn Thanh Diệu

NỘI DUNG

1 Khái niệm giải trình tự gen và ý nghĩa của GTTG

2 Phương pháp giải trình tự gen:

2.1 Phương pháp Maxam – Gilbert

2.2 Phương pháp Sanger

2.3 Phương pháp giải trình tự gen tự động

3 So sánh phương pháp Maxam–Gilbert và Sanger

4 Ứng dụng

Giải trình tự gen (DNA sequencing) là phương pháp xác định vị trí sắp xếp các nucleotid trong phân tử DNA.

1.1.Khái Niệm:

1.2 Ý nghĩa

Giúp xác định vị trí của gen trên NST, cho phép kết luận về bản chất của gen Có ý nghĩa trong việc tìm hiểu những chức năng cấu trúc của

gen cũng như các dòng gen.

5’OH

P 32 , ATP, enzyme

Điện di phân tách các mạch đơn

Nguyên lý: Thủy giải đặc trưng phân tử DNA cần

2.1 Phương pháp Maxam - Gibert

2.1 Phương pháp Maxam - Gibert

Bước 2 : Thực hiện các phản ứng hóa học đặc hiệu

Có thể sử dụng 4 ống nghiệm để thực hiện các phản ứng hóa học đặc hiệu khác nhau, tạo các đoạn DNA cắt dài ngắn khác nhau.

Bước 3: Lấy sản phẩm xử lý trong mỗi ống nghiệm đem chạy điện di, hiện hình phóng xạ và xác định kết quả

Ví dụ: Xử lý Dimethylsunfat ở ống

phản ứng 1, phản ứng cắt tại G

2.1 Phương pháp Maxam - Gibert

Sau khi xử lý bằng

DMSO4

2.1 Phương pháp Maxam - Gibert

Bước 4 : Tập hợp kết quả thu được ở tất cả các

ống nghiệm, thu được các đoạn polynucleotid dài ngắn hơn kém nhau 1 nucleotid, từ đó xác định được trình tự của DNA mạch khuôn

2.1 Phương pháp Maxam - Gibert

2.1 Phương pháp Maxam - Gibert

Nguyên lý: Dựa vào sự tổng hợp mạch bổ

sung cho trình tự cần xác định nhờ hoạt động của enzyme DNA Polymerase Với việc sử

dụng thêm các dideoxynucleotid (ddNTP) và các deoxynucleotid thông thường

2.2 Phương pháp Sanger

Việc tổng hợp mạch bổ sung sẽ bị dừng lại do ddNTP không có khả năng hình thành liên kết phosphodieste

2.2 Phương pháp Sanger

Bước 1: Biến tính DNA khuôn

Điện di trên gel polyacrylamid để thu các mạch đơn DNA, dùng DNA này để tiến hành các

bước xử lý tiếp theo

2.2 Phương pháp Sanger

Bước 2: Chuẩn bị cho phản ứng tổng hợp DNA

Lấy 4 ống Eppendorf, cho các thành phần cần thiết vào mỗi ống : mạch khuôn, mồi có đánh dấu phóng xạ P32, enzyme DNA

polymerase, dNTP, dung dịch đệm thích

hợp và thêm vào mỗi ống tương ứng một loại ddNTP nhất định

2.1 Phương pháp Sanger

Bước 3 : Thực hiện các phản ứng tổng hợp

DNA

Bước 4 : Điện di kết quả, so sánh kết quả

các chuỗi mạch đơn DNA được tổng hợp

để xác định trình tự của mạch khuôn

2.2 Phương pháp Sanger

2.2 Phương pháp Sanger

Nguyên lý: Hoàn toàn được thiết kế trên nguyên tắc

sử dụng ddNTP do Sanger và cộng sự phát minh.

Mồi và dNTP được đánh dấu huỳnh quang.

2.3 Phương pháp giải trình tự gen tự động

Mỗi loại dNTP được đánh dấu huỳnh quang khác nhau, biểu thị các màu sắc khác nhau.

Máy thực hiện tổng hợp các mạch đơn DNA mới trên cả 2 mạch khuôn DNA, sử dụng phần mềm trên máy tính để xử lý kết quả.

Bước 1: Chuẩn bị (DNA khuôn, các dNTP và ddNTP có gắn màu quỳnh quang, enzyme,

mồi…)

trình tự gen và chạy máy giải trình tự gen

liệu do máy tính cung cấp

2.3 Phương pháp giải trình tự gen tự động

Đầu đọc laser trong máy kích hoạt các chất phát quỳnh quang khiến chúng hấp thụ và phát ra các màu, mỗi màu ứng với một nucleotide và được hiển thị bằng một đỉnh.

2.3 Phương pháp giải trình tự gen tự động

Đọc kết quả

ABI Automated Sequencers (contd.)

2.3 Phương pháp giải trình tự gen tự động

3 So sánh phương pháp Maxam – Gibert và Sanger

Giống nhau

+ Hình thành một tập hợp nhiều oligonucleotide có chiều dài khác nhau + Các trình tự này được phân tách bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamid + Kết quả được đọc trên bản phóng xạ tự ghi

Khác nhau

+ Dùng các chất hóa học để làm cắt các base

+ Dùng enzyme và các ddNTP để làm dừng quá trình tổng hợp ADN

3 So sánh phương pháp Maxam – Gibert và Sanger

Maxam – Gibert Sanger

+ Độ chuẩn xác không cao

+ Phải thực hiện nhiều lần và

4 Ứng dụng

Xác định đột biến, sự sai khác về trình tự

nucleotit trong cùng một sản phẩm gen, có

ý nghĩa trong nghiên cứu tiến hóa và ứng