GIÁ TRỊ của PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH tự GEN THẾ hệ mới PHÁT HIỆN LỆCH bội NHIỄM sắc THỂ THAI BẰNG DNA THAI tự DO TRONG máu mẹ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘIHOÀNG HẢI YẾN GIÁ TRỊ CỦA PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ GEN THẾ HỆ MỚI PHÁT HIỆN LỆCH BỘI NHIỄM SẮC THỂ THAI BẰNG DNA THAI TỰ DO TRONG MÁU MẸ LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC H

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

HOÀNG HẢI YẾN

GIÁ TRỊ CỦA PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ GEN THẾ HỆ MỚI PHÁT HIỆN LỆCH BỘI NHIỄM SẮC THỂ THAI BẰNG DNA THAI TỰ DO

TRONG MÁU MẸ

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

HÀ NỘI - 2019

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

HOÀNG HẢI YẾN

GIÁ TRỊ CỦA PHƯƠNG PHÁP

GIẢI TRÌNH TỰ GEN THẾ HỆ MỚI PHÁT HIỆN LỆCH BỘI NHIỄM SẮC THỂ THAI BẰNG DNA THAI TỰ DO

HÀ NỘI - 2019

Tôi là Hoàng Hải Yến, nghiên cứu sinh khóa 34, Trường Đại học Y Hà

Nội, chuyên ngành Hóa sinh Y học, xin cam đoan:

1 Đây là luận án do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫncủa GS.TS Tạ Thành Văn và PGS.TS Nguyễn Duy Ánh

2 Công trình này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đãđược công bố tại Việt Nam

3 Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác, trungthực và khách quan, đã được xác nhận và chấp thuận của cơ sở nơinghiên cứu Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật vềnhững cam kết này

Hà Nội, ngày 31 tháng 07 năm 2019

Người viết cam đoan

Hoàng Hải Yến

cffDNA Cell free fetal DNA

CMA Chromosomal microarray-based analysis

CSS Chromosome-selective sequencing

DNA Deoxyribonucleic acid

DTBS Dị tật bẩm sinh

FISH Fluorescent in situ hybridization

NGS Next generation sequencing

NIPS Noninvasive prenatal testing

SNPs Single nucleotide polymorphisms

PAPP-A Pregnancy - associated plasma protein A

PGD Preimplantation Genetic Diagnosis

PN BoBs Prenatal-BoBs

uE3 Unconjugated Estriol - Estriol không liên hợp

βhCG Beta human chronic gonadotropin

MPS Massively parallel sequencing

MPSS Massively parallel shotgun sequencing

NCVs Normalized chromosome values

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Bất thường nhiễm sắc thể thai nhi 3

1.1.1 Tần suất xuất hiện 3

1.1.2 Hậu quả bất thường nhiễm sắc thể 4

1.1.3 Các dạng lệch bội nhiễm thể thường gặp trong sàng lọc và chẩn đoán trước sinh 5

1.2.1 Các phương chẩn đoán trước sinh 11

1.2.2 Các phương pháp sàng lọc truyền thống 15

1.3 Tổng quan về DNA thai tự do trong máu mẹ 20

1.3.1 Lịch sử phát hiện DNA tự do trong máu mẹ 20

1.3.2 Nguồn gốc DNA huyết tương 21

1.3.3 Nguồn gốc và đặc điểm DNA thai tự do (cffDNA) trong huyết tương mẹ 22

1.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến nồng độ cffDNA 23

1.3.5 Các phương pháp tiếp cận tin sinh học ước tính nồng độ cffDNA 23 1.3.6 Ứng dụng lâm sàng của cffDNA trong huyết tương mẹ 25

1.4 Giải trình tự gen thế hệ mới (Next-Generation Sequencing- NGS) trong xét nghiệm NIPS 28

1.4.1 Nguyên lý 28

1.4.2 Một số hệ thống máy giải trình tự thế hệ mới phổ biến trên thế giới 29

1.4.3 Ứng dụng phương pháp giải trình tự thế hệ mới trong sàng lọc trước sinh không xâm lấn 30

1.4.4 Nghiên cứu NIPS bằng phương pháp NGS phân tích cffDNA tại Việt Nam 44

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 45

2.1 Đối tượng nghiên cứu 45

2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn 45

2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ 45

2.2 Phương pháp nghiên cứu 46

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 46

2.2.2 Cỡ mẫu nghiên cứu 46

2.2.3 Quy trình nghiên cứu 47

2.3 Phương tiện nghiên cứu 50

2.3.1 Máy móc và dụng cụ 50

2.3.2 Hóa chất 50

2.4 Các biến số nghiên cứu 51

combined test, triple test 52

2.4.3 Kêt quả giải trình tự 52

2.4.4 Kết quả xét nghiệm chẩn đoán: karyotype 52

2.4.5 Theo dõi lâm sàng thai hoặc theo dõi sau sinh: sau sinh 1 tháng 52

2.5 Các tiêu chuẩn đánh giá trong nghiên cứu 53

2.5.1 Đánh giá chất lượng giải trình tự 53

2.5.2 Kết quả phân tích NST từ tế bào ối 55

2.5.3 Theo dõi sau sinh 55

2.6 Sơ đồ nghiên cứu (Sơ đồ 2.1): 56

2.7 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 57

2.8 Phương pháp tính toán và xử lý số liệu 57

2.9 Đạo đức trong nghiên cứu của đề tài 58

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 59

3.1 Một số đặc điểm của đối tượng nghiên cứu 59

3.1.1 Phân bố tuổi ở thai phụ trong nghiên cứu 59

3.1.2 Phân bố nghề nghiệp và địa dư 60

3.1.3 Phân bố theo địa dư 60

3.1.4 Đặc điểm cân nặng, chỉ số khối lượng cơ thể thai phụ 61

3.1.5 Tuổi thai của thai phụ tại thời điểm làm xét nghiệm NIPS 61

3.1.6 Đặc điểm sàng lọc trước sinh truyền thống của thai phụ 62

3.2 Ứng dụng phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới phát hiện lệch bội NST 21, 18, 13, X, Y bằng DNA thai tự do (cffDNA) trong huyết tương mẹ 65

3.2.1 Kết quả tách chiết DNA tự do (cfDNA) và chuẩn bị thư viện 65

3.2.2 Kết quả chất lượng giải trình tự 67

3.2.3 Kết quả giải trình tự 69

3.3 Xác định tỷ lệ lệch bội NST 21, 18, 13, X, Y bằng phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới phân tích DNA thai tự do trong máu mẹ 74

3.4 Đánh giá giá trị của phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới phát hiện

lệch bội NST thai bằng DNA thai tự do trong huyết tương mẹ 77

3.4.1 Kết quả phân tích NST từ tế bào nuôi cấy ối trên mẫu có NIPS dương tính 77

3.4.2 Kết quả chẩn đoán lệch bội NST 80

3.4.3 Các trường hợp kết quả NIPS không phù hợp với kết quả chẩn đoán xác định bằng nuôi cấy dịch ối 82

3.4.4 Giá trị của cffDNA trong xét nghiệm NIPS 83

3.4.5 Giá trị của NIPS sàng lọc lệch bội 89

Chương 4: BÀN LUẬN 91

4.1 Đặc điểm chung của các đối tượng nghiên cứu 91

4.2 Ứng dụng phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới phát hiện lệch bội NST 21, 18, 13 và NST giới tính bằng DNA thai tự do trong huyết tương mẹ 95

4.2.1 Kết quả tách huyết tương, tách chiết cffDNA và chuẩn bị thư viện 95

4.2.2 Kết quả chất lượng giải trình tự 99

4.2.3 Kết quả giải trình tự chung 103

4.3 Xác định tỷ lệ lệch bội NST 21, 18, 13, X, Y bằng phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới sử dụng DNA thai tự do trong máu mẹ 111

4.3.1 Tỷ lệ lệch bội NST thai 111

4.3.2 Kết quả NIPS dương tính lệch bội NST 21, 18, 13, và giới tính liên quan đến yếu tố nguy cơ 112

4.4 Đánh giá giá trị của phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới phát hiện lệch bội NST thai bằng DNA thai tự do trong huyết tương mẹ 116

4.4.1 Chẩn đoán thai lệch bội NST bằng phương pháp di truyền tế bào - phân tích NST trên mẫu có kết quả NIPS dương tính 117

4.4.2.Kết quả chẩn đoán trong trường hợp NIPS dương tính và trường hợp đặc biệt 120

4.4.3 Giá trị của cffDNA trong xét nghiệm NIPS 125

KIẾN NGHỊ 137

TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Tỷ lệ phát hiện và tỷ lệ dương tính giả trisomy 21 15

Bảng 1.2 Các thử nghiệm lâm sàng của NIPS 37

Bảng 1.3 Kết quả phát hiện trisomy 21 theo tuổi mẹ và nguy cơ* 39

Bảng 1.4 Kết quả xét nghiệm phát hiện trisomy 18, 13* 39

Bảng 1.5 Kết quả sàng lọc trisomy 21, 18, 13 trên quần thể dân số chung và nguy cơ cao 42

Bảng 2.1 Giá trị z-score và lệch bội NST 13, 18, 21 54

Bảng 2.2 Giá trị z-score và lệch bội NST giới tính nam 54

Bảng 2.3 Giá trị z-score và lệch bội NST giới tính nữ 54

Bảng 2.4 Đánh giá kết quả xét nghiệm NIPS 57

Bảng 3.1 Đặc điểm tuổi thai phụ trong nghiên cứu 59

Bảng 3.2 Đặc điểm cân nặng, chỉ số khối lượng cơ thể thai phụ 61

Bảng 3.3 Tuổi thai tại thời điểm làm xét nghiệm NIPS 61

Bảng 3.4 Đặc điểm sàng lọc trước sinh truyền thống của thai phụ 62

Bảng 3.5 Kết quả siêu âm bất thường của thai phụ 62

Bảng 3.6 Đặc điểm độ dày da gáy của thai nhi 63

Bảng 3.7 Kết quả sàng lọc huyết thanh truyền thống 64

Bảng 3.9 Kết quả sàng lọc huyết thanh nguy cơ cao trisomy 18 65

Bảng 3.10 Nồng độ DNA tự do và thư viện 65

Bảng 3.11 Kết quả chất lượng thư viện ISP 67

Bảng 3.12 Chất lượng sắp gióng cột của đoạn đọc với trình tự hg19 68

Bảng 3.13 Tỷ lệ cffDNA<3.5% trên tổng số mẫu 69

Bảng 3.14 Kết quả giải trình tự chung 70

Bảng 3.15 Kết quả hệ số z-score 70

Bảng 3.16 Tỷ lệ thai phụ dương tính với lệch bội NST 74

Bảng 3.17 Tỷ lệ giới tính thai trong nghiên cứu 74

Bảng 3.18: Phân loại bất thường NST theo kết quả NIPS 74

Bảng 3.19 NIPS dương tính với từng loại lệch bội NST liên quan đến yếu tố nguy cơ 75

Bảng 3.20 NIPS dương tính theo tuổi mẹ 77

Bảng 3.21 Kết quả phân tích NST từ tế bào ối nuôi cấy 77

Bảng 3.22 Kết quả chẩn đoán lệch bội NST 80

Bảng 3.23 Kết quả chẩn đoán lệch bội NST giới tính 81

Bảng 3.24 Các trường hợp kết quả NIPS không phù hợp 82

Bảng 3.25 Tỷ lệ cffDNA trung bình ở nhóm thai phụ bình thường 83

Bảng 3.26 Độ nhạy và độ đặc hiệu của xét nghiệm NIPS 89

Bảng 4.1 Tỷ lệ cffDNA trong huyết tương thai phụ qua các nghiên cứu 127 DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1 Phân bố nghề nghiệp của thai phụ 60

Biểu đồ 3.2 Phân bố theo địa dư 60

Biểu đồ 3.3 Phân bố z-score NST 21 72

Biểu đồ 3.4 Phân bố z-score NST 18 72

Biểu đồ 3.6 Phân bố z-score NST X 73

Biểu đồ 3.7 cffDNA và tuần thai 84

Biểu đồ 3.8 cffDNA và tuổi mẹ 85

Biểu đồ 3.9 cffDNA và cân nặng (: r = -0.1604; p = 0,000) 85

Biểu đồ 3.10 cffDNA và BMI (r = - 0.1512; p = 0,000) 86

Biểu đồ 3.11 cffDNA và trisomy 18, 21 86

Biểu đồ 3.12 Tương quan giữa cffDNA và z-score NST 21 87

Biểu đồ 3.13 Tương quan giữa cffDNA và z-score NST 18 87

Biểu đồ 3.14 Tương quan giữa cffDNA và z-score NST 13 88

Biểu đồ 3.15 Tương quan giữa cffDNA và z-score lệch bội NST giới tính 88

DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Tỉ lệ bất thường các NST được chẩn đoán khi trẻ <1 tuổi 4

Hình 1.2 Trẻ mắc hội chứng Down (Trisomy 21) 6

Hình 1.3 Trẻ mắc hội chứng Edwards 6

Hình 1.4 Trẻ mắc hội chứng Patau 7

Hình 1.5 Trẻ mắc hội chứng Turner và karyotype 45,X 9

Hình 1.6 Chọc hút dịch ối dưới hướng dẫn của siêu âm 12

Hình 1.7 Lấy mẫu gai rau dưới hướng dẫn của siêu âm 12

Hình1.8 DNA tự do thai trong máu mẹ 21

Hình 1.9 Các cách tiếp cận để xác định hàm lượng cffDNA 24

Hình 1.10 Giải trình tự trên hệ thống Illumina 30

Hình 1.11 Giải trình tự trên hệ thống Ion Torrent 30

Hình 1.12 Biểu đồ phân bố chuẩn của hệ số z-score 32

Hình 1.13 Giải trình tự MPS phát hiện lệch bội 33

Hình 2.1 Các bước chính trong quá trình tạo thư viện 49

Hình 2.3 Giải trình tự trên máy Proton 49

Hình 3.1 Kết quả kiểm tra chất lượng thư viện 66

Hình 3.2 Hiệu quả nạp mẫu vào chip giải trình tự 67

Hình 3.3 Kết quả phân tích NST từ tế bào ối nuôi cấy của thai phụ N.T.K.L 79

Hình 3.4 Kết quả phân tích NST từ tế bào ối nuôi cấy của thai phụ N.T.N.L chuyển đoạn không cân bằng giữa NST 18 và 21 tạo ra trisomy nhánh dài NST 18 80

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bất thường nhiễm sắc thể (NST) thai xảy ra khoảng 1/150 trẻ sinh sống,

là một trong số những nguyên nhân hàng đầu gây nên tử vong và bệnh tật chotrẻ sơ sinh trên toàn thế giới [1],[2] Chiếm khoảng 83% của những bấtthường này là do lệch bội NST 21, 18, 13 và NST giới tính gây ra hội chứngDown, Edwards, Patau, Turner , [3]

Các phương pháp sàng lọc trước sinh truyền thống phát hiện lệch bội NSTbao gồm siêu âm hình thái và phân tích huyết thanh mẹ trong thai kỳ 1 và thai

kỳ 2 Tuy nhiên, tỷ lệ phát hiện lệch bội NST 21 với ngưỡng nguy cơ là 1/250dao động từ 30-95% với tỷ lệ dương tính giả trên 5% tùy thuộc vào phươngpháp sàng lọc được sử dụng [4] Để chẩn đoán xác định thì các thai phụ cónguy cơ cao sẽ được thực hiện các thủ thuật xâm lấn như sinh thiết gai rau hoặcchọc hút dịch ối để khảo sát số lượng NST bằng các kỹ thuật Karyotype, QF-PCR, FISH, Prenatal BoBs, MLPA Các thủ thuật xâm lấn này có thể gây mấtthai với tỷ lệ là 0.5 - 1% tùy theo phương pháp [5] Do đó, rất cần có nhữngphương pháp sàng lọc với tỷ lệ dương tính giả thấp đồng thời tỷ lệ phát hiệncao hơn, thai phụ không cần chịu thủ thuật xâm lấn, tránh được nguy cơ ảnhhưởng đến mẹ và thai [6]

Việc phát hiện DNA thai tự do (cffDNA) có nguồn gốc từ rau thai lưu hànhtrong máu mẹ vào năm 1997 [7] đã mở ra khả năng thực hiện xét nghiệm sànglọc trước sinh không xâm lấn (Noninvasive prenatal screening - NIPS) bằngphương pháp giải trình tự thế hệ mới (Next Generation Sequencing - NGS) [6]giúp các nhà nghiên cứu có thể sàng lọc sớm thai trên nhiều phương diện khácnhau, điển hình như: xác định sớm giới tính thai giúp tiên lượng khả năng mắccác bệnh do NST liên kết với giới tính; nguy cơ mắc các bệnh di truyền của thaitrong những gia đình có nguy cơ cao, khảo sát yếu tố RhesusD, xác định nguy cơ

tiền sản giật, trong đó nổi bật là ứng dụng phân tích cffDNA trong sàng lọc sớmlệch bội NST [6] Đây được xem là một phát hiện mang tính bước ngoặt, do việclấy mẫu và phân tích cffDNA không đòi hỏi tính can thiệp sâu, giảm thiểu nguy

cơ cũng như các biến chứng trên thai phụ và thai nhi Hơn nữa, sàng lọc trướcsinh không xâm lấn có tỷ lệ phát hiện trisomy 21 gây hội chứng Down trên 99%với tỷ lệ dương tính giả thấp dưới 1% [8]

Hiện tại, việc ứng dụng giải trình tự thế hệ mới phát hiện lệch bội NSTthai trong sàng lọc trước sinh đang là hướng đi mới và được áp dụng rộng rãitrên toàn thế giới Với mong muốn tìm hiểu rõ hơn về giá trị của xét nghiệmsàng lọc trước sinh không xâm lấn bằng phương pháp giải trình tự thế hệ mớitrong lĩnh vực sản khoa, giúp thầy thuốc lâm sàng có thêm một phương phápsàng lọc sớm bất thường NST thai, nhằm giảm thiểu tối đa nguy cơ cũng nhưcác biến chứng trên mẹ và thai do việc thực hiện các thủ thuật xâm lấn, chúng

tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu giá trị của phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới phát hiện lệch bội nhiễm sắc thể thai bằng DNA thai tự do trong máu mẹ” với 3 mục tiêu:

1 Ứng dụng phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới phát hiện lệch bội NST 21, 18, 13, X, Y bằng DNA thai tự do trong máu mẹ.

2 Xác định tỷ lệ lệch bội NST 21, 18, 13, X, Y bằng phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới sử dụng DNA thai tự do trong máu mẹ.

3 Đánh giá giá trị của phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới phát

hiện lệch bội NST thai bằng DNA thai tự do trong máu mẹ.

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Bất thường nhiễm sắc thể thai nhi

1.1.1 Tần suất xuất hiện

Bất thường nhiễm sắc thể chiếm khoảng 15% các dị tật bẩm sinh đượcchẩn đoán trước 1 tuổi tại châu Âu và liên quan đến 25% trường hợp tử vongchu sinh do dị tật bẩm sinh [9] Kết quả trong một nghiên cứu 34.910 trẻ sinhsống cho đến 13 tuổi tại Đan Mạch cho thấy tần suất bất thường NST thường

và NST giới tính là 1/118 hay 8.45/1000 trẻ sống Tần suất bất thường NSTthường là 1/164 và NST giới tính là 1/426 trẻ sinh sống, trong đó hội chứngDown chiếm tỷ lệ 1/592, chuyển đoạn tương hỗ là 1/712 trẻ sinh sống, hộichứng Klinerfelter chiếm tỷ lệ 1/576 trẻ trai, 47,XYY là 1/851 trẻ trai, trisomy

X là 1/947 trẻ gái và hội chứng Turner là 1/1893 trẻ gái [10] Nghiên cứu tạicộng đồng các nước ở Châu Âu năm 2004 cho thấy khoảng 1/4 trường hợp tửvong sớm ở trẻ sơ sinh là do dị tật bẩm sinh trong đó 18% là bất thường NST.Bất thường NST phổ biến nhất là trisomy 21, 18 và 13, và bất thường NST giớitính [11] Trong nghiên cứu từ 10.323 trường hợp được chẩn đoán trước sinhhoặc trước 1 tuổi từ 16 trung tâm từ 11 quốc gia tại châu Âu năm 2000 đếnnăm 2006 Các trường hợp bất thường NST bao gồm các trường hợp sinh consống, thai chết khi tuổi thai trên 20 tuần hoặc chấm dứt thai kỳ vì dị tật thai nhi.Kết quả cho thấy tỷ lệ sinh là 43,8/10.000 ca sinh, trong đó có 7.335 trườnghợp mắc trisomy 21, 18 hoặc 13 với tần suất là 23; 5.9 và 2.3/10.000, lần lượt

là 53% trisomy 21, 13% trisomy 18 và 5% trisomy 13 Trisomy X/Y được báocáo có 473 trường hợp chiếm tỷ lệ 5% và 778 trường hợp (8%) monosomy Xvới tần suất là 2 và 3.3/10.000 Chỉ có 1737 trường hợp bất thường NST hiếmgặp (17%) tần suất là 7.4/10.000 bao gồm tam bội, trisomy các NST khác,chuyển đoạn không cân bằng, mất đoạn và nhân đoạn (Hình 1.1) [3]

Hình 1.1 Tỉ lệ bất thường các NST được chẩn đoán khi trẻ <1 tuổi

Tại Trung Quốc, mỗi năm có khoảng 16 triệu trẻ mới sinh, trong đó dị tậtbẩm sinh chiếm khoảng 4-6% Bất thường nhiễm sắc thể chiếm tỷ lệ 1/160 trẻsinh sống tại Mỹ và 1/60 tại Trung Quốc [11],[12] Thống kê của tổng cục dân

số cho thấy, mỗi năm Việt Nam có khoảng gần 1.5 triệu trẻ em mới được sinh

ra, trong đó tỷ lệ dị tật bẩm sinh chiếm khoảng 1,5-2% trẻ sinh sống Đánglưu ý, mỗi năm có khoảng 1.400-1.800 trẻ bị mắc bệnh Down, khoảng 200-

250 trẻ mắc hội chứng Edwards Theo nghiên cứu của Phùng Như Toàn(2003) nuôi cấy tế bào ối cho 213 trường hợp phát hiện 24 trường hợp bấtthường NST (11,2%) [13] Hoàng Thị Ngọc Lan, Nguyễn Việt Hùng, TrịnhVăn Bảo, Trần Thị Thanh Hương (2004) phát hiện 7 mẫu có bất thường sốlượng NST trong tổng số 40 trường hợp chọc ối chiếm tỷ lệ 17.5% [14], TrầnDanh Cường (2005) báo cáo kết quả nuôi cấy tế bào ối trên 95 trường hợpphát hiện 11 trường hợp bất thường NST (11,6%), trong đó lệch bội NST 21chiếm 50,79% [15]

1.1.2 Hậu quả bất thường nhiễm sắc thể

Mặc dù có rất nhiều loại bất thường nhiễm sắc thể thường gặp ở thainhi nhưng hầu hết đều có những hậu quả như gây sẩy thai ngẫu nhiên, gây racác dị tật bẩm sinh như tình trạng phát triển chậm về tâm thần và vận động, có

những biểu hiện bất thường đặc thù trên khuôn mặt, lùn có thể kèm theo nhẹcân, gia tăng tần số của các dị tật bẩm sinh, đặc biệt là các dị tật bẩm sinh gâygánh nặng cho gia đình và xã hội [16].

1.1.3 Các dạng lệch bội nhiễm thể thường gặp trong sàng lọc và chẩn đoán trước sinh

1.1.3.1 Hội chứng Down hay ba nhiễm sắc thể 21 (trisomy 21)

Hội chứng Down được đặt theo tên của John Landon Down, một bác sỹngười Anh đã mô tả hội chứng này vào năm 1866 Trước đó, hội chứng này

đã được mô tả bởi J.E.D.Esquirol năm 1838 và Edouart Seguin năm 1844.Phải đến năm 1959, hội chứng Down mới được xác định là do bất thường về

số lượng NST 21 bởi bác sỹ J Lejeune

Hội chứng Down (47,XX,+21; 47,XY,+21) là bất thường bẩm sinh haygặp trong các bệnh rối loạn NST Tỷ lệ khoảng 1/700 trẻ đẻ sống, 1/400 thainhi ở tuổi thai 12 tuần, tỷ lệ bệnh theo giới là 3 nam/2 nữ [15] Nguyên nhângây hội chứng Down có thể do rối loạn số lượng, cấu trúc NST 21 dạng thuầnhay dạng khảm Theo Zoltán Papp thì 95% hội chứng Down là đột biến sốlượng NST 21 dạng thuần; 4% do chuyển đoạn; 1% là thể khảm [16]

Hội chứng Down có tỷ lệ tử vong cao, khoảng 20% trẻ mắc hội chứngDown sinh ra chết trước 5 tuổi, 44% số trẻ còn lại có thể sống tới tuổi 60 [15].Trẻ mắc hội chứng Down với bộ mặt điển hình: trán thấp, gáy rộng và dẹt, sốngmũi tẹt , thường kèm theo dị tật ở tim (46%), bất thường ống tiêu hoá (7%),10% bị động kinh ở tuổi 50, luôn kèm theo chậm phát triển trí tuệ một cáchtrầm trọng , nên ảnh hưởng lớn đến khả năng hoà nhập cộng đồng Các giađình có con mắc hội chứng down có một gánh nặng lớn về tâm lý cũng nhưgánh nặng tài chính, gánh nặng cho sự phục vụ và chăm sóc y tế của xã hội

Hình 1.2 Trẻ mắc hội chứng Down (Trisomy 21) 1.1.3.2 Hội chứng Edwards hay ba nhiễm sắc thể 18

Hội chứng Edwards là bất thường số lượng NST 18 (47,XX,+18;47,XY,+18) Lần đầu tiên được một nhóm các nhà di truyền học người Anhđứng đầu là Edwards mô tả đầy đủ năm 1960 Bệnh xuất hiện với tần suất1:5000 trẻ sinh ra [17] Đây là hội chứng bất thường số lượng NST đứng thứ 2sau hội chứng Down

Hình 1.3 Trẻ mắc hội chứng Edwards

Trẻ mắc hội chứng Edwards được sinh ra thường thiếu cân (trọng lượngtrung bình khoảng 2kg), trong khi thai lại thường bị già tháng Các biểu hiệnlâm sàng ở hội chứng này cũng đa dạng như các tổn thương cấu tạo của mặt

và hệ thống cơ xương là ổn định, ở các trường hợp kinh điển, sọ não có dạngkéo dài nghiêng dần từ xương trán tới vùng thóp, hàm dưới và lỗ miệng bé,các khe mắt hẹp và ngắn, vành tai bị biến dạng và trong phần lớn các trườnghợp có tai mọc thấp, các tật ở chi trên là sự xếp lộn xộn của xương bàn, bất

thường khớp giữa ngón Ι, bất thường ở bàn chân cũng có tới 80% các trườnghợp Khe hở môi được gặp ở 50% các trường hợp, nhưng khác với hội chứngPatau là chỉ khe hở môi ở một phía [18].

Do có nhiều dị tật ở nhiều hệ thống cơ quan, nên thời gian sống của cáctrẻ mắc hội chứng Edwards không được lâu Có tới 60% các trường hợp bịchết trước 3 tháng (trong đó 30% là trước 1 tháng) Chỉ 1/10 trẻ bị bệnh làsống được đến 1 tuổi [18]

1.1.3.3 Hội chứng Patau hay ba nhiễm sắc thể 13

Hội chứng Patau là bất thường số lượng NST 13 (47,XX,+13; 47,XY,+13) Lần đầu tiên được Patau cùng các cộng sự mô tả đầy đủ vào năm 1960.Bệnh gặp với tần số 1:5000 đến 1:10000 trẻ sống Tỷ lệ bệnh gặp ở nữ nhiều hơnnam Các trẻ mắc hội chứng Patau có trọng lượng khi sinh thấp hơn mức trungbình khoảng 900g và thường sinh thiếu tháng Các dấu hiệu lâm sàng bên ngoàicủa hội chứng này rất điển hình đến mức có thể dựa vào đó để nhận dạng vàchẩn đoán bệnh Các bất thường đặc trưng biểu hiện ở sọ và mặt: chu vi hộp sọthường bị giảm, đầu bé cùng với trán thấp và nghiêng, khe mắt hẹp, gốc mũirộng, tai mọc thấp với vành tai biến dạng, khoảng cách giữa hai mắt giảm, dađầu thường bị loét, có u mạch máu ở vùng đầu và chẩm [17],[19]

Hình 1.4 Trẻ mắc hội chứng Patau

Một trong những dấu hiệu điển hình nhất của hội chứng Patau là khe hởmôi trên và vòm miệng, các khe hở thường là ở cả hai phía Trong số các bấtthường của hệ thống cơ xương, hay gặp nhất là tật nhiều ngón ở cả hai tay vàhai chân Ngoài ra, các dị tật bẩm sinh ở tim chiếm 80% các trường hợp, ở hệthống bài tiết trên 60%, ở hệ thống cơ quan sinh sản 75%.

Do có quá nhiều dị tật nặng nề, nên những trẻ trisomy 13 không sốngđược lâu, 90% bệnh nhân chết trong vòng 1 tuổi, trong đó 40% là chết chusinh [17],[19]

1.1.3.4 Các bất thường số lượng nhiễm sắc thể giới tính (X, Y)

Bất thường NST giới tính X, Y gây nên hội chứng Kilinefelter, Tuner vàtrisomy X

* Hội chứng Turner hay monosomy X

Hội chứng Turner (TS) là bệnh lý rối loạn NST giới tính phổ biến nhất,gây ra một loạt các bất thường kiểu hình ở người nữ Các bất thường này làhậu quả thiếu hụt gen của cặp NST giới tính do thiếu hoàn toàn hoặc mộtphần NST giới tính X hoặc Y [20],[21] Tần suất mắc TS vào khoảng 1/2000 -1/3000 trẻ sơ sinh gái Ở giai đoạn phôi thai, tỷ lệ này cao hơn rất nhiều, chỉriêng dạng mất hoàn toàn một NST giới X chiếm 3% thai nữ được hình thành[20] Tuỳ thuộc vào số lượng gen thiếu hụt mà biểu hiện của TS rất đa dạng.Bất thường hình thái điển hình là lùn, tóc mọc thấp, cổ ngắn, nếp da thừa ở

cổ, biến dạng xương chi… Các bất thường này làm bệnh nhân có những mặccảm tự ti khi hoà nhập cộng đồng nhưng nguyên nhân chính gây ảnh hưởngnặng nề đến sức khoẻ và đời sống của người bệnh TS là các dị tật nội quan vàrối loạn chức năng Bệnh nhân TS thường thiểu năng sinh dục, giới tính thứ cấpkhông phát triển, vô sinh; các rối loạn nội tiết gây chậm phát triển về thể chất,đôi khi chậm phát triển về trí tuệ [22] Các dị tật nội quan như dị tật tim, thận lànguyên nhân gây tử vong sớm của các bệnh nhân TS Để hạn chế các biểu hiệnbất thường của TS cần theo một chế độ điều trị đặc biệt, lâu dài từ giai đoạn sớm

và cũng chỉ hạn chế được một phần các biểu hiện của bệnh [23]

Hình 1.5 Trẻ mắc hội chứng Turner và karyotype 45,X

* Hội chứng Klinefelter với kiểu nhiễm sắc thể 47, XXY

Là dạng bệnh NST giới tính hay gặp nhất ở nam giới với tần số khoảng1:500 đến 1:1000 lần trẻ sơ sinh nam, 80% người Klinefelter với kiểu nhiễmsắc thể 47,XXY; Một số thể khảm 47,XXY/46,XY; 45,X/46,XY/47,XXY Tuổi mẹ cao làm tăng bất thường ở giảm phân I Theo Simpson, hội chứngKlinefelter thường là vô sinh do vô tinh và thiểu tinh nhưng biểu hiện lâmsàng có sự khác nhau [24] Số lượng và mức độ của các triệu chứng phụ thuộcvào số lượng và vị trí của các mô tế bào có thêm NST X Tuy nhiên Krausz vàForti (2000) thấy ở một số ít bệnh nhân Klinefelter thể khảm tinh hoàn vẫn cóthể sinh tinh nên vẫn có khả năng sinh sản nhưng thường là thiểu tinh nặng(severe oligozoospermia) [25] Biểu hiện lâm sàng của hội chứng Klinefelterthường không đặc hiệu trong thời kỳ trẻ nhỏ Ở giai đoạn sơ sinh và trẻ nhỏrất khó nhận biết vì không có dị dạng quan trọng hoặc có những dị dạngnhưng không đặc hiệu như tinh hoàn lạc chỗ, lỗ đái lệch thấp, dương vật kémphát triển Ở giai đoạn dậy thì có thể thấy người cao, chân tay dài nhưngnhiều trường hợp có hình thái nam bình thường Thường thấy tinh hoàn khôngphát triển, mào tinh hoàn đôi khi lớn hơn tinh hoàn, tinh hoàn teo nhỏ, dángngười giống nữ, chứng vú to, FSH tăng cao và thường vô sinh do vô tinh Bởivậy, chẩn đoán hội chứng này thường ở giai đoạn dậy thì và trưởng thành.Trường hợp hội chứng Klinefelter khảm có thể có con nhưng đều cần đến hỗtrợ sinh sản Một số trường hợp có thể lấy tinh trùng từ tinh hoàn để làm kỹthuật tiêm tinh trùng vào bào tương trứng

* Kiểu nhiễm sắc thể 47, XYY

Trong số nam giới có karyotyp 47,XYY, một số có khả năng sinh sản,

tỷ lệ bệnh này nhiều hơn trong quần thể vô sinh nam Có trường hợp dươngvật nhỏ, tinh hoàn lạc chỗ và lỗ đái lệch thấp Trên lâm sàng người bệnh códáng vóc cao, xét nghiệm tinh dịch vô tinh hoặc thiểu tinh nặng Trên mẫusinh thiết, mô học tinh hoàn thấy tế bào dòng tinh thiểu sản và hầu như khôngtrưởng thành, ngoài ra còn xơ hóa ống sinh tinh Cơ chế bệnh sinh hầu hết do

sự không phân ly của NST Y xảy ra trong phân bào giảm nhiễm lần thứ hai ở

bố Tần số người 47,XYY trong quần thể là 1/1000 nam giới Khả năng sinhsản của những người 47,XYY khác nhau đáng kể, từ số lượng tinh trùng bìnhthường đến vô tinh Nhiều nam giới 47,XYY vẫn sinh con bình thường, tuynhiên chưa có nghiên cứu hệ thống về con của những người này [26]

* Trisomy X hay kiểu nhiễm sắc thể 47,XXX

Trisomy X là bất thường số lượng NST X (47,XXX) được mô tả lầnđầu vào năm 1959 với tần số khoảng 1:1000 trẻ gái, tuy nhiên ước tính chỉ có10% được chẩn đoán [27] Những biểu hiện bên ngoài rất khó phân biệt ngườibệnh với những người bình thường do không có những biến đổi rõ ràng vềhình thái cũng như trí tuệ và thể lực Tuy nhiên, một số người bệnh cũng cómột số bất thường như tầm vóc cao hơn bình thường, huyết áp thấp, bấtthường ở thận, bộ phận sinh dục và suy buồng trứng sớm (premature ovarianfailure: POF) Trẻ em bị trisomy X có tỷ lệ chậm nói và vận động chậm hơn,tăng nguy cơ thiếu hụt nhận thức và khuyết tật học tập trong những năm đếntuổi đi học đặc điểm tâm lý bao gồm thiếu hụt chú ý, rối loạn tâm trạng (lolắng và trầm cảm), bệnh tâm thần phân liệt và các rối loạn tâm lý khác cũngphổ biến hơn so với dân số nói chung Nguy cơ trisomy X tăng theo tuổi mẹ.Những phụ nữ trisomy X vẫn có khả năng sinh đẻ bình thường song nguy cơcác bất thường các NST ở con cái cao hơn những người khác [27]

1.2 Tổng quan về một số phương pháp sàng lọc, chẩn đoán trước sinh phát hiện bất thường NST

Bất thường số lượng NST là nguyên nhân chính gây tử vong chu sinh

và tàn tật ở trẻ em Phát hiện các bất thường NST thường dựa vào các phươngpháp sàng lọc và chẩn đoán trước sinh

1.2.1 Các phương chẩn đoán trước sinh

Muốn chẩn đoán xác định thai lệch bội NST phải dựa vào các xétnghiệm di truyền Các xét nghiệm này có thể phân tích ở mức độ tế bào (phântích NST), ở mức độ phân tử (phân tích DNA, RNA) hoặc cả ở mức độ tế bào

và phân tử (kỹ thuật FISH) Tất cả xét nghiệm này cần phải lấy được tế bàohoặc DNA có nguồn gốc từ thai Hai phương pháp lấy mẫu xét nghiệm đểchẩn đoán trước sinh là phương pháp xâm phạm thai và phương pháp khôngxâm phạm thai

Phương pháp chẩn đoán trước sinh lấy mẫu xâm phạm thai

Phương pháp lấy mẫu này ảnh hưởng trực tiếp đến thai nhi và có thể gây taibiến cho thai cũng như cho thai phụ (sẩy thai, rỉ ối, ) Để giảm bớt rủi ro trên,việc sàng lọc trước sinh không xâm lấn những thai phụ có nguy cơ cao sinh conlệch bội NST sẽ giảm đáng kể số thai phụ phải thực hiện xét nghiệm này

* Chọc hút dịch ối: được thực hiện khi thai được 16 đến 18 tuần Dịch ối

có các loại tế bào ối, da, phổi và tế bào biểu bì đường tiết niệu của thai nhi.Những tế bào này sẽ được nuôi cấy với các môi trường thích hợp để thu đượclượng tế bào thai nhi nhiều hơn; mặt khác, nuôi cấy tế bào dịch ối còn giúp loại

bỏ tế bào máu của người mẹ Tỉ lệ mất thai do chọc út dịch ối khoảng 0,5-1,0%[5] Mặc dù chọc hút dịch ối ở ba tháng giữa có nhiều thuận lợi nhưng cũng cóhạn chế do làm thủ thuật và kết quả tế bào thường có sau tuần thai thứ 18, vì vậynếu thai phụ lựa chọn đình chỉ thai do bất thường NST thì có thể bất lợi hơn sovới ba tháng đầu

Hình 1.6 Chọc hút dịch ối dưới hướng dẫn của siêu âm

Hình 1.7 Lấy mẫu gai rau dưới hướng dẫn của siêu âm

(Nguồn:http://babywash.vn)

Phương pháp lấy mẫu không xâm phạm thai

Hiện nay, các nhà khoa học đang quan tâm đến phương pháp lấy mẫuthai nhi bằng phương pháp không xâm phạm thai Phương pháp lấy mẫukhông xâm phạm thai giúp tránh được nguy cơ mất thai có thể xảy ra đối vớithai nhi và thai phụ

1.2.1.1 Kỹ thuật nhuộm băng nhiễm sắc thể lập karyotype

Để phân tích đặc điểm bộ NST của một cá thể về cả số lượng lẫn cấutrúc, người ta dựa trên bộ NST của tế bào ở kỳ giữa (metaphase) hoặc tiền kỳgiữa (pro-metaphase) của nguyên phân để lập karyotype Kỹ thuật được sửdụng phổ biến để lập karyotype là kỹ thuật nhuộm băng G hiện được sử dụngtrong hầu hết các phòng xét nghiệm di truyền tế bào học và được coi là mộttrong những phương pháp phân tích di truyền tế bào học truyền thống [28]

1.2.1.2 Kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (FISH-Fluorescent in situ hybridization)

Kỹ thuật FISH sử dụng để xác định một cách hiệu quả số lượng và vị trícủa các đoạn DNA đặc hiệu trên NST ở kỳ giữa hoặc trong nhân tế bào ở gian kỳ

và cũng được coi như là một phương pháp phân tích di truyền tế bào học truyềnthống Việc thực hiện kỹ thuật FISH trên tế bào ở gian kỳ đã làm cho việc chuẩn

bị mẫu xét nghiệm trở nên đơn giản và thời gian thực hiện xét nghiệm nhanhchóng hơn rất nhiều so với việc lập karyotype, điều này đặc biệt có ý nghĩa đối vớicác xét nghiệm cần có kết quả nhanh như trong trường hợp phát hiện các bấtthường số lượng của NST 13, 18, 21 và X, Y trong chẩn đoán trước sinh [29]

1.2.1.3 Kỹ thuật định lượng huỳnh quang PCR (QF-PCR: Quantitative fluorescence-polymerase chain reaction)

Kỹ thuật QF-PCR sử dụng các cặp mồi được thiết kế để khuếch đại cáctrình tự lặp nối tiếp ngắn (STR: short tandem repeat sequences) của các NSTđặc hiệu và của các vùng có tính đa hình cao Bằng cách kết hợp màu huỳnhquang trong quá trình khuếch đại nên kỹ thuật này cho phép định lượng các

sản phẩm cho mỗi STR đặc hiệu của từng NST Dựa trên nguyên tắc này PCR có thể phát hiện các dạng lệch bội phổ biến và các bất thường số lượngNST giới tính một cách nhanh chóng thông qua chỉ một phản ứng [30]

QF-1.2.1.4 Kỹ thuật ARRAY CGH (CGH: Comparative Genomic Hybridization)

Trong thập niên 1990 kỹ thuật CGH bắt đầu được phát triển Về bảnchất kỹ thuật này cũng tương tự kỹ thuật FISH nhưng cho phép đánh giá trêntoàn bộ genome tình trạng mất cân bằng của bộ NST CGH cũng vấp phải giớihạn về độ phân giải, kỹ thuật CGH cho phép phát hiện các bất thường có kíchthước trong giới hạn 5 - 10Mb [31] Với array CGH những bất thường trênNST xảy ra ở dưới mức phát hiện của kính hiển vi (submicroscopic) dướidạng vi mất đoạn (microdeletion) hoặc vi nhân đoạn (microduplication) có thểđược phát hiện một cách dễ dàng

1.2.1.5 Kỹ thuật Prenatal-BoBs

Prenatal-BoBs (PN BoBs) là kỹ thuật di truyền phân tử sử dụng rộngrãi trong xét nghiệm chẩn đoán trước sinh So với kỹ thuật FISH, QF-PCR lànhững kỹ thuật được ứng dụng để phát hiện thêm hoặc mất DNA trong cácvùng NST liên quan tới các hội chứng lệch bội NST 13, 18, 21 và NST giới tính,

PN BoBs còn phát hiện thêm 9 loại đột biến vi mất đoạn thường gặp nhưDiGeorge, Williams-Beuren, Prader-Willi, Angelman, Smith-Magenis, Wolf-Hirschhorn, Cri du Chat, Langer-Giedion, Miller-Dieker Kỹ thuật BoBs(BACs-on-Beads) dựa trên công nghệ sử dụng mẫu dò là các dòng nhiễm sắcthể nhân tạo có chứa các đoạn ngắn DNA của người có gắn các hạt bead,thông qua sự khác biệt giữa DNA mẫu với DNA chứng để phát hiện cáctrường hợp mất đoạn hoặc nhân đoạn trên DNA dựa trên khả năng bắt cặpgiữa các DNA dò với một mạch đơn của DNA mẫu theo nguyên tắc bổ sunggiữa các base khi phản ứng lai xảy ra [32]

1.2.2 Các phương pháp sàng lọc truyền thống

Bất thường NST là nguyên nhân chính gây nên tỷ lệ tử vong và bệnh tậtcho trẻ sơ sinh trên toàn thế giới Do đó, phát hiện bất thường NST là chỉ địnhthường gặp nhất trong chẩn đoán trước sinh xâm lấn Tuy nhiên, xét nghiệmxâm lấn như chọc hút dịch ối, sinh thiết gai rau liên quan tới tỷ lệ mất thai với

tỷ lệ 1% [5] và do vậy các xét nghiệm này chỉ được thực hiện trên những thaiphụ có nguy cơ cao bất thường NST Các phương pháp sàng lọc nhóm nguy

cơ cao bao gồm tuổi mẹ, siêu âm thai và xét nghiệm hóa sinh ở người mẹ thai

TM + NT (tuần thai thứ 11 - 14) 75 (hoặc 70) 5 (hoặc 2)

TM + NT + xương mũi của thai nhi (tuần

TM + NT + hCG và PAPP-A (tuần thai

TM + NT + xương mũi của thai nhi +

hCG và PAPP-A (tuần thai thứ 11 - 14) 97 (hoặc 95) 5 (hoặc 2)

TM + Các chỉ số huyết thanh ở tuần thai

Siêu âm để phát hiện các dị tật và các dấu

ấn chỉ điểm ở thai nhi vào tuần thai thứ

16 - 23

Ghi chú: TM: Tuổi mẹ; NT: Độ mờ da gáy; DR: Tỷ lệ phát hiện; FPR: Tỷ lệ dương tính giả

1.2.2.1 Tính toán nguy cơ cho thai phụ

Mỗi thai phụ đều có nguy cơ thai nhi bị bất thường NST Sử dụng cácphương pháp sàng lọc có độ chính xác cao đánh giá các yếu tố ảnh hưởng đếnnguy cơ mắc bệnh của thai giúp cho gia đình thai phụ đưa ra quyết định đúngđắn trước khi quyết định thực hiện các xét nghiệm xâm lấn [33] Để tính toánnguy cơ cho thai phụ, cần phải tính nguy cơ mắc bệnh (phụ thuộc vào tuổi mẹ

và tuổi thai) kết hợp với siêu âm và xét nghiệm huyết thanh mẹ trong quátrình mang thai từ đó tính toán được nguy cơ thực sự của thai phụ, nguy cơnày sẽ trở thành nguy cơ mắc bệnh cho lần xét nghiệm sàng lọc kế tiếp Quátrình này được gọi là sàng lọc nối tiếp (sequential screening) [34] Trong tínhtoán nguy cơ cho thai phụ thường sử dụng phần mềm FMF (UK) trong sànglọc thai kỳ 1 và phần mềm Prisca (Immulite), T21 (Gamma) và Life cycle(Perkin Elmer) trong thai kỳ 2

1.2.2.2 Tuổi mẹ và tuổi thai

Nguy cơ bất thường NST tăng theo tuổi mẹ Ngoài ra, nếu thai nhi cóbất thường nhiễm sắc thể có nhiều khả năng tử vong trong tử cung hơn so vớithai nhi bình thường, do vậy nguy cơ giảm theo tuổi thai Tỷ lệ thai mắctrisomy 21 giữa 12 tuần là 30% và giữa 16 tuần là 20% [35]

Trong những năm 1970, có khoảng 5% thai phụ từ 35 tuổi và nhóm nàychiếm khoảng 30% thai phụ mang thai trisomy 21 Do vậy, sàng lọc trên cơ sởtuổi mẹ với ngưỡng nguy cơ là 35 tuổi được xếp vào nhóm có nguy cơ cao, với

tỷ lệ dương tính giả là 5% và tỷ lệ phát hiện là 30% Những năm sau đó, tại cácnước phát triển, phụ nữ có xu hướng mang thai muộn hơn, do đó hiện naykhoảng 15% phụ nữ mang thai từ 35 tuổi và tỷ lệ phát hiện trisomy 21 chiếm50% [4] Nguyên nhân do những bà mẹ tuổi cao ≥ 35 tuổi thì nguy cơ không

phân ly NST xảy ra ở trứng ngày càng tăng cao Tuổi trứng cũng như tuổi mẹcàng cao càng chịu nhiều tác động bên trong cũng như bên ngoài môi trường

1.2.2.3 Ảnh hưởng của lần có thai trước đó

Nguy cơ mang thai trisomy trên những phụ nữ mang thai mắc trisomy

của lần mang thai trước đó có tỷ lệ cao hơn nguy cơ theo tuổi mẹ Một nghiêncứu trên 2054 thai phụ có tiền sử mang thai trisomy 21, nguy cơ tái mắc cholần mang thai sau là 0.75%, cao hơn nguy cơ theo tuổi mẹ ở cùng thời điểmmang thai Do vậy, một phụ nữ 35 tuổi có tiền sử mang thai trisomy 21 cónguy cơ tăng từ 1:249 (0.40%) đến 1:87 (1.15%) tại 12 tuần thai, và trên phụ

nữ 25 tuổi nguy cơ tăng từ 1:946 (0.106%) đến 1:117 (0.856%) Nghiên cứutrên 750 thai phụ có tiền sử mang thai trisomy 18, nguy cơ tái mắc cho lầnmang thai sau là 0.75%, cao hơn nguy cơ theo tuổi mẹ và tuổi thai liên quantới nguy cơ trisomy 18; nguy cơ trisomy 21 những phụ nữ này không tăngthêm Do vậy, nguy cơ tái mắc là đặc hiệu cho bất thường NST [4]

1.2.2.4 Siêu âm thai

Siêu âm được sử dụng lần đầu tiên trong chẩn đoán trước sinh vàonhững năm 1972 Sau đó siêu âm ngày càng được sử dụng rộng rãi và trởthành một phương tiện quan trọng và không thể thiếu trong sàng lọc và chẩnđoán trước sinh Đây là phương pháp không xâm phạm thai, tương đối an toànnên được xem là một trong những công cụ chủ yếu để sàng lọc và phát hiệncác dị tật của thai Mặc dù siêu âm không chẩn đoán xác định được các bấtthường NST nhưng thông qua các hình ảnh bất thường về hình thái của thaitrên siêu âm có thể hướng đến một số hội chứng bất thường NST, trong đó độ

mờ da gáy ở quý 1 là một chỉ tiêu quan trọng [36] Đầu những năm 1990, liênquan giữa tăng độ mờ da gáy và thai bất thường NST đã được ghi nhận, tỷ lệbất thường NST từ 19-88% tương ứng với độ mờ da gáy từ 2-10mm Siêu âm

đo độ mờ da gáy trong quý 1 có giá trị tiên đoán nguy cơ bất thường NST với

độ nhậy trên 80%, tỷ lệ dương tính giả là 4,5% [37], độ mờ da gáy > 3,0mmgặp trong 90% thai nhi mắc trisomy 13 hoặc trisomy 18, 80% thai nhi mắctrisomy 21 và 5% thai nhi bình thường Nguy cơ bất thường NST tăng gấp 3lần khi độ mờ da gáy đo được là 3,0mm Nguy cơ này tăng 18 lần khi độ mờ

da gáy là 4,0mm và gấp 28 lần khi độ mờ da gáy là 5,0mm

Việc phân tích sự có mặt của xương mũi thai nhi bằng siêu âm cũng được

sử dụng trong thai kỳ 1 nhằm tăng tỷ lệ phát hiện hội chứng Down, từ 11-14tuần thai, 60-70% thai trisomy 21 không thể siêu âm được xương mũi và dưới1% trường hợp có số lượng NST bình thường không siêu âm được xương mũi[38] Nghiên cứu cho thấy sàng lọc trisomy 21 vào tuần 11-14 bằng cách phốihợp siêu âm xương mũi, đo độ mờ da gáy và phân tích free β-hCG/PAPP-Atrong huyết thanh mẹ tăng tỷ lệ phát hiện 95% đối với tỷ lệ dương tính giả là2% [39]

1.2.2.5 Sàng lọc trước sinh bằng xét nghiệm sinh hóa

Sàng lọc trước sinh bằng huyết thanh mẹ được chỉ định cho tất cả cácthai phụ nhằm phân tích các dấu ấn (marker) trong huyết thanh mẹ để xácđịnh nguy cơ bất thường NST Các dấu ấn trong huyết thanh mẹ để sàng lọcbất thường NST thai là PAPP-A (Prenancy Associated Plasma Protein-A), Fβ-hCG (free β-human chorionic gonadotropin), AFP (α-fetoprotein), uE3(unconjugated estriol) và inhibin A

Sàng lọc thai kỳ 1 (11-13 tuần 6 ngày)

Sàng lọc kết hợp thai kỳ 1 (CFTS: Combined first trimester screening)thực hiện từ 11-13 tuần 6 ngày dựa trên tuổi mẹ, siêu âm đo độ mờ da gáy(NT) và phân tích nồng độ Fβ-hCG và PAPP-A trong huyết thanh mẹ, từ đódựa vào phần mềm tính toán yếu tố nguy cơ trisomy 21, 18, 13 Đây làphương pháp sàng lọc chuẩn đang được sử dụng ở phần lớn các nước đang

phát triển Phương pháp này có độ nhậy cao và có thể phát hiện sớm trisomy

21, 18 và 13 từ 11 tuần [40]

Bảng 1.1 cho thấy nếu chỉ dựa vào tuổi mẹ và dấu ấn hóa sinh tronghuyết thanh mẹ thì tỷ lệ phát hiện hội chứng Down là 60% với tỷ lệ FPR là 5%.Nếu kết hợp thêm độ mờ da gáy thì tăng tỷ lệ phát hiện lên 90% với tỷ lệdương tính giả 5% [40] Kết hợp thêm siêu âm xương mũi tỷ lệ phát hiện lêntới 95% [39] Trong trường hợp siêu âm không thấy xương mũi, có tới 60-70%thai mắc trisomy 21 và chỉ dưới 1% trường hợp thai có số lượng NST bìnhthường

Sàng lọc thai kỳ 2 (15-22 tuần)

Sàng lọc thai kỳ 2 (triple test, quad test) thực hiện từ 15-22 tuần dựa trêntuổi mẹ, chiều cao, cân nặng mẹ, và tuổi thai kết hợp định lượng hCG, AFP, vàuE3 trong huyết thanh mẹ, sau đó sử dụng phần mềm chuyên dụng để đánh giánguy cơ thai hội chứng Down, Edwards hoặc dị tật ống thần kinh ở thai kỳ 2

- Triple test: Tuổi mẹ + AFP + βhCG + uE3

- Quadruple test: Tuổi mẹ + AFP + βhCG + uE3+ Inhibin A

Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng khi phối hợp các dấu ấn trong huyết thanh

mẹ có nguồn gốc từ thai thì hiệu quả sàng lọc tăng lên đáng kể Sàng lọc thai

kỳ 2 nếu chỉ dựa vào tuổi mẹ thì tỷ lệ phát hiện đạt 30%-50% với tỷ lệ dươngtính giả từ 5-15% nhưng khi sử dụng triple test, tỷ lệ phát hiện là 60-70% với

tỷ lệ dương tính giả là 5% [41] Tuy nhiên, một yếu tố quan trọng trong sànglọc bằng chỉ số hóa sinh thai kỳ 2 là kết quả siêu âm phải chính xác ngày dựkiến sinh, nếu không tỷ lệ phát hiện sẽ giảm 10% [4] Để tăng độ nhạy củatriple test, người ta sử dụng quadruple test bằng cách đo và tính toán thêmInhibin A vào các thông số βhCG, AFP và uE3 thì tỷ lệ phát hiện tăng 81%với tỷ lệ dương tính giả là 5% [42]

Kết hợp sàng lọc thai kỳ 1 và 2

Intergrated test: là xét nghiệm kết hợp kết quả của hai lần sàng lọc đểtính nguy cơ chung của thai: độ mờ da gáy + PAPP-A + Quadruple test

Đặc biệt trong xét nghiệm kết hợp kết quả của hai lần sàng lọc(Intergrated test) để tính nguy cơ chung thì tỷ lệ phát hiện lên đến 96% với tỷ

lệ dương tính giả là 5% [4],[38]

Như vậy trong các phương pháp sàng lọc trước sinh bằng huyết thanh

mẹ kết hợp với siêu âm và một số yếu tố nguy cơ khác có thể tăng tỷ lệ pháthiện lên đến 96% nhưng tỷ lệ dương tính giả vẫn khá cao là 5-7% [38] Tỉ lệdương tính giả 5 - 7% của xét nghiệm sàng lọc có nghĩa là sẽ có 5 đến 7% thaiphụ phải làm xét nghiệm chẩn đoán xâm lấn không cần thiết, dẫn đến tăng sốthai phụ bị mất thai do thủ thuật xâm lấn Ngoài ra, các hạn chế về tỉ lệ dươngtính giả cao và tỉ lệ phát hiện thấp gây khó khăn cho bác sĩ khi tư vấn và làmcho thai phụ và gia đình lo lắng, hoang mang không cần thiết Do đó, pháttriển các phương pháp sàng lọc không xâm lấn có tỉ lệ phát hiện cao hơn với tỉ

lệ dương tính giả thấp hơn là hết sức cần thiết và là ưu tiên của lĩnh vực sảnkhoa [6]

1.3 Tổng quan về DNA thai tự do trong máu mẹ

1.3.1 Lịch sử phát hiện DNA tự do trong máu mẹ

Năm 1948, lần đầu tiên, Mandel và Métais báo cáo phát hiện acidnucleic ngoài tế bào trong huyết tương của người Một số tác giả khác cũng

có những quan sát tương tự như vậy, nhưng phải đến năm 1969, khiWalknowska và cộng sự phát hiện được những tế bào lympho mang NST Ytrong máu của một thai phụ mang thai nam, người ta mới chắc chắn được rằng

tế bào thai thực sự có lưu hành trong máu mẹ [43] Nhưng phải đến năm

1997, Lo và cộng sự mới phát hiện có sự lưu hành của DNA thai trong huyếttương của thai phụ mang thai nam khi phát hiện ra trình tự của NST Y [7].Đặc biệt hơn cả là trong phân tích định lượng bằng realtime PCR đã chỉ ra có

nồng độ DNA thai cao bất thường trong huyết tương của thai phụ tiền sảngiật, sinh non, cũng như thai phụ mang thai lệch bội NST [44] Từ đó có thểthấy định lượng DNA thai trong huyết tương có thể là nguồn mẫu lý tưởngtrong sàng lọc, chẩn đoán trước sinh

Hình1.8 DNA tự do thai trong máu mẹ 1.3.2 Nguồn gốc DNA huyết tương

Rất nhiều nghiên cứu đã cố gắng tìm hiểu nguồn gốc của DNA tronghuyết tương Đầu tiên là quá trình chết theo chương trình của tế bào(appotosis) được coi là đóng vai trò quan trọng trong việc giải phóng DNAvào vòng tuần hoàn Appotosis diễn ra trong suốt quá trình sống [45] Trongquá trình apoptosis của tế bào, men caspase được kích hoạt,dẫn đến sự phân tách của chất nhiễm sắc thành oligo vàmononucleosome Nucleosome trong huyết tương người đãđược phát hiện bằng xét nghiệm miễn dịch [46] Phân mảnhDNA của bộ gen do quá trình phân tách nucleosome là mộtsản phẩm chính của quá trình appotosis và có thể phát hiệnbằng điện di gel agarose [47] Tiếp theo là một số tế bào cónhân giải phóng DNA vào vòng tuần hoàn Những báo cáo đầutiên của Rogers và cộng sự đã mô tả sự giải phóng DNA từviệc kích hoạt tế bào lympho [48] Tế bào lympho nuôi cấy với

phytohemagglutinin (PHA) hoặc kháng nguyên sẽ giải phóngDNA vào môi trường nuôi cấy Nguồn gốc DNA là hậu quả của

sự biệt hóa hồng cầu, keratinocytes và tế bào tinh thể và giảiphóng chromatin và nhân tế bào [49] Một số báo cáo đã cungcấp bằng chứng DNA huyết tương có nguồn gốc từ hệ thống

hệ thống tạo máu ở những người khỏe mạnh, vì khi tách chiếtDNA từ nguyên hồng cầu cũng có các đặc điểm tương tự.Ngoài ra, DNA huyết tương còn có nguồn gốc từ người hiếntrên bệnh nhân được cấy ghép tủy xương [50] Quá trình hoại

tử cũng đóng vai trò trong việc tạo ra DNA huyết tương [51]

1.3.3 Nguồn gốc và đặc điểm DNA thai tự do (cffDNA) trong huyết tương mẹ

Mặc dù tế bào thai đã được tìm thấy trong vòng tuần hoàn của mẹ từ vàithập kỷ, với số lượng rất ít (1 trong 106) Do vậy với sự khám phá cffDNAtrong máu mẹ đã mở ra kỷ nguyên mới cho sàng lọc và chẩn đoán trước sinh

vì DNA thai tự do có số lượng lớn hơn rất nhiều so với tế bào thai

Nhiều bằng chứng đã chỉ ra rằng rau thai có thể là một nguồn chính củaDNA thai được giải phóng vào tuần hoàn mẹ [52] Nồng độ cffDNA tăng theotuổi thai trong huyết tương thai phụ hoặc ở thai phụ tiền sản giật [53],[54].Ngoài ra, quá trình chết theo chương trình của tế bào rau thai tăng đáng kểtheo tuần thai và thai phụ tiền sản giật [54], gợi ý rằng sự xuất hiện củacffDNA là kết quả của quá trình chết theo chương trình của tế bào rau thai.cffDNA đã được tìm thấy trong huyết thanh của mẹ ngay cả trước khi tuầnhoàn của thai nhi được thiết lập Chính vì vậy, có thể khẳng định cffDNA bắtnguồn từ tế bào lá nuôi phôi [55] Phân tích kích thước cffDNA cho thấy phầnlớn là các phân mảnh ngắn, 80% dưới 200 bp, giống như các đoạn DNA ngắnsau quá trình chết theo chương trình tế bào [56] Chan và cộng sự và nhiều tácgiả khác ủng hộ giả thuyết rằng cffDNA có nguồn gốc từ rau thai, trong khi

đó tỷ lệ lớn cfDNA mẹ có nguồn gốc từ các tế bào tạo máu [50],[52]

Lo và cộng sự đã chứng minh thời gian bán hủy trung bình cffDNA ướctính là 16,3 phút (khoảng 4-30 phút) [57] cffDNA không thể phát hiện được 2giờ sau sinh Các nghiên cứu trên động vật thí nghiệm đã chỉ ra rằng cffDNA

bị đào thải qua gan [58] Ngoài ra, hệ thống miễn dịch của mẹ, như lách và tếbào lympho trong tuần hoàn mẹ cũng liên quan đến việc đào thải cffDNA[59]

1.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến nồng độ cffDNA

Một số yếu tố được biết là ảnh hưởng đến nồng độ cffDNA Lo và cộng

sự đã chứng minh rằng tỷ lệ cffDNA tăng theo tuổi thai và tăng đột ngột vào 3tháng cuối [60] cffDNA tương quan nghịch với cân nặng và BMI mẹ [61] cffDNA cao ở thai phụ mang thai đôi so với thai đơn, các yếu tố khác của mẹ như tăng huyết áp cũng có thể làm giảm cffDNA [62] Có rất nhiều nghiên cứu chứng minh cffDNA có liên quan đến lệch bội NST, cffDNA giảm trong trường hợp trisomy 18, 13, monosomy X và thể tam bội, cffDNA tăng trong trường hợp trisomy 21 [63],[64] Tuy nhiên, không phải tất cả các nghiên cứu đều xác nhận điều này [61] Vì lý do này, ACMG đã khuyến cáo nên tư vấn xét nghiệm chẩn đoán cho những thai phụ không trả được kết quả NIPS do cffDNA thấp [8]

1.3.5 Các phương pháp tiếp cận tin sinh học ước tính nồng độ cffDNA

Việc khám phá cffDNA trong huyết tương của mẹ đã tạo ra một sự thayđổi lớn trong xét nghiệm sàng lọc trước sinh không xâm lấn (NIPS) cffDNAngày càng được công nhận là một công cụ quan trọng để phát hiện các bấtthường của thai như lệch bội NST và chẩn đoán các bệnh di truyền đơngen Một loạt các phương pháp tiếp cận NIPS sử dụng giải trình tự thế hệ mới(NGS) đã được phát triển nhanh chóng trong y học lâm sàng hiện nay Trongnhững phương pháp tiếp cận như vậy, cffDNA là một thông số quan trọng đểđảm bảo độ chính xác cho kết quả xét nghiệm Ngưỡng cffDNA 3,5% tới 4%

là giới hạn thấp để có thể phát hiện lệch bội NST hay còn gọi là ngưỡng kiểmsoát chất lượng (QC), bởi vì số lượng phân tử cffDNA ở ranh giới khi được

phát hiện và phân tích có thể dẫn đến kết quả âm tính giả [65] Do đó, điềuquan trọng là ước tính cffDNA một cách chính xác, đảm bảo rằng cffDNA lớnhơn ngưỡng QC để đảm bảo số lượng DNA tự do thai đủ trong kết quả giảitrình tự Thêm vào đó, cffDNA đã được đưa vào các thuật toán tin sinh họctrong nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới [35] Có rất nhiều phương phápxác định tỷ lệ cffDNA khác nhau như PCR định lượng DNA thai trong huyếttương của thai phụ mang thai nam Mặc dù những phương pháp này rất đơngiản và chính xác nhưng chỉ áp dụng cho những thai phụ mang thai nam [53].Phương pháp dựa vào sự khác biệt đa hình đơn nucleotide (single nucleotidepolymorphism -SNP) giữa DNA tự do của mẹ và thai, vì vậy giá thành của xétnghiệm tăng lên rất cao [66] Phương pháp dựa trên kích thước cfDNA,cfDNA thai ngắn hơn cfDNA mẹ, tuy nhiên phương pháp này đòi hỏi giảitrình tự 2 chiều (paired-end sequencing) và có độ chính xác không cao [56].Phương pháp dựa trên sự khác biệt về đặc điểm methyl hóa giữa DNA thai vàDNA mẹ, đòi hỏi xử lý các gốc CpG và giải trình tự toàn bộ bộ gen đã bisulfitegây tốn kém và không thể áp dụng cho xét nghiệm thường quy [67] Phươngpháp giải trình tự ngẫu nhiên một chiều (single-end random sequencing) dựa vàođếm số lượng đoạn đọc trong mỗi vùng NST (SeqFF), quan trọng hơn, phươngpháp SeqFF áp dụng cho cả thai phụ mang thai nữ [68].

Hình 1.9 Các cách tiếp cận để xác định hàm lượng cffDNA

(Xianlu Laura Peng, Peiyong Jiang, 2017)

1.3.6 Ứng dụng lâm sàng của cffDNA trong huyết tương mẹ

Phương pháp định lượng cffDNA trong huyết tương mẹ đã được ứngdụng trong lâm sàng để sàng lọc trước sinh không xâm lấn phát hiện lệch bộiNST thai đặc biệt là hội chứng Down Ngoài ra, cffDNA còn được ứng dụngtrong xác định giới tính thai, sàng lọc tiền sản giật, xác định kiểu gen Rh củathai và một số bệnh di truyền đơn gen

1.3.6.1 Xác định giới tính thai và bệnh di truyền đơn gen

Việc xác định giới tính thai bằng cffDNA có thể thực hiện từ 7 tuầnthai, nhằm quản lý thai phụ có nguy cơ mang thai mắc các bệnh di truyền liênkết NST giới tính X như bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh (CAH-congenital adrenal hyperplasia), nhược cơ Duchenne (DMD) [69] Bên cạnh

đó, xác định giới tính có thể là một trợ giúp cực kỳ hữu ích cho các chẩn đoánsiêu âm của một số hội chứng di truyền có nhiều bất thường, đặc biệt là sự mơ

hồ về bộ phận sinh dục [70] Mặc dù việc phát hiện các đột biến từ cffDNA là

vô cùng khó khăn do sự chiếm ưu thế của trình tự DNA mẹ, tuy nhiên cho đến

nay một số bệnh di truyền đơn gen đã được chẩn đoán trong như bệnh tăngsản thượng thận bẩm sinh, hemophilia, loạn dưỡng cơ Duchene, thalassemia,bệnh Huntington….[71].

1.3.6.2 Xác định nhóm máu RhD của thai

Phân tích cfDNA trong huyết tương mẹ được ứng dụng để xác địnhnhóm máu RhD thai ở những bà mẹ mang thai có RhD (-) Khi người mẹ RhD(-) mang thai RhD (+) có nguy cơ tạo ra kháng thể chống lại hồng cầu có RhD(+) của thai có thể qua rau thai và sẽ hủy hoại các hồng cầu và gây ra bệnh tanmáu (HD - hemolytic disease) trầm trọng, vàng da nặng cho thai và trẻ sơ sinh

có thể dẫn đến tử vong Việc phát hiện RhD bằng cffDNA đã được sử dụngrộng rãi trong nhiều năm trên toàn thế giới ở những phụ nữ mang thai có nguy

cơ cao về bệnh tan máu giúp cho việc quản lý thai nghén [72]

1.3.6.3 Phát hiện các trường hợp mang thai có nguy cơ tiền sản giật

Rất nhiều nghiên cứu đã xác định hàm lượng cffDNA do tiền sản giật và

đã đưa ra kết luận về sự liên quan của cffDNA đến sự phát triển của bệnh.Trong một nghiên cứu trên 20 thai phụ bị tiền sản giật, đã chứng minh hàmlượng cffDNA trên thai phụ tiền sản giật tăng cao gấp 5 lần so với thai phụbình thường [73] Các nghiên cứu cho thấy hàm lượng cffDNA tăng lên trướckhi xuất hiện các triệu chứng của bệnh và có thể được sử dụng như là một dấuhiệu dự báo tiền sản giật, ít nhất là đối với tiền sản giật nặng và giai đoạn cấptiền sản giật Có rất nhiều có chế phức tạp gây ra bệnh lý tiền sản giật trong đó

có sự kết hợp của apoptosis, thiếu oxy và các con đường của quá trình viêm

1.3.6.4 cffDNA và hội chứng thai chậm phát triển trong buồng tử cung

Hội chứng thai chậm phát triển trong buồng tử cung (intrauterine growthrestriction - IUGR) là một rối loạn phức tạp của thai kỳ do nhiều nguyên nhânkhác nhau IUGR đặc trưng bởi việc chậm phát triển của thai bao gồm trọnglượng thai tại thời điểm thăm khám và sự phát triển của thai và có liên quan

đến bệnh suất và tử vong chu sinh, cũng như bệnh tim mạch khi trưởng thành[74] Mặc dù có rất nhiều nguyên nhân khác nhau gây ra IUGR, tuy nhiên rốiloạn chức năng rau thai là một trong những nguyên nhân chủ yếu Nhiềunghiên cứu đã chỉ ra thai phụ IUGR có hàm lượng cffDNA thấp hơn thai phụmắc tiền sản giật, cffDNA cao hơn ở thai phụ IUGR so với thai phụ bìnhthường, có thể liên quan đến sự thiếu dinh dưỡng rau thai [75].

1.3.6.5 cffDNA và sinh non

Sinh non là sinh trước tuần thứ 37 của thai kỳ, là nguyên nhân chính gây

tử vong sơ sinh và những biến chứng lâu dài ở trẻ sơ sinh Một số yếu tố sinh

lý đã được cho là liên quan tới sự phát triển của bệnh, chẳng hạn như sự suyyếu do xâm lấn mạch - lá nuôi phôi và kích thích vật lý [76]

Việc phát hiện cffDNA sử dụng như là một chỉ điểm tiên đoán về rốiloạn chức năng giảm oxy máu rau thai gây sinh non đã được chú ý nhiều nămqua Farina và cộng sự đã chứng minh rằng cffDNA tăng lên trong huyếtthanh mẹ ở những bệnh nhân có nguy cơ sinh non tự phát cao hơn do sinh nonhoặc do vỡ ối sớm [76] Các nhà nghiên cứu cho rằng giải phóng cffDNA làkết quả của sự khởi đầu của việc phá vỡ hàng rào rau thai dự đoán về chuyển

dạ [76] Tuy nhiên, trong hầu hết các trường hợp, cffDNA tăng dường như làkết quả của quá trình khởi phát chuyển dạ và sinh sau đó, chứ không phải làdấu hiệu tiên đoán bệnh lý

1.3.6.6 cffDNA và các bệnh lý liên quan đến quá trình mang thai

Vora và cộng sự cho thấy có sự tương quan nghịch giữa chỉ số khối cơ thể(BMI) và cffDNA có thể liên quan tới tăng sự hủy hoại mô mỡ và apoptosismạch máu [77] cffDNA tăng ở thai phụ có chứng nghén nặng (HG -hyperemesis gravidarum), do cffDNA bắt nguồn từ tế bào lá nuôi phôi, tế bào lánuôi phôi có thể bị tổn thương nhiều hơn trong suốt quá trình hình thành rau thai

1.3.6.8 cffDNA và lệch bội NST

Năm 1997, Lo và cộng sự đã phát hiện cffDNA trong huyết tương mẹ[7] cffDNA thai lưu hành trong máu mẹ có nguồn gốc từ tế bào lá nuôi phôi[55], có thể phát hiện từ thai kỳ 1 và biến mất nhanh chóng trong vòng tuầnhoàn máu mẹ ngay sau khi sinh [57] Tuy nhiên, cffDNA thai chỉ có khoảng3-13% tổng lượng cfDNA mẹ Việc phát hiện ra cffDNA là một bước đột phátrong lĩnh vực chẩn đoán trước sinh mở ra một hướng mới đầy triển vọngtrong chẩn đoán trước sinh bằng biện pháp không xâm lấn NIPS Xét nghiệmNIPS sử dụng phân tích cffDNA sàng lọc bất thường NST 21, 18, 13 và NSTgiới tính Xét nghiệm có thể thực hiện được từ tuần thai thứ 10 cho đến khisinh DNA tự do thai không thể phát hiện được sau 24 giờ sau sinh [78],cffDNA tăng cao trong máu của thai phụ trisomy 21 [62] Cho đến nay, phầnlớn các dữ liệu đã được chứng minh trên các ứng dụng sàng lọc lệch bội NST

từ cffDNA được thực hiện bằng kỹ thuật giải trình tự MPS

1.4 Giải trình tự gen thế hệ mới (Next-Generation Sequencing- NGS) trong xét nghiệm NIPS

Giải trình tự thế hệ mới (NGS) là công nghệ giải trình tự đồng thời,thông lượng cao được phát triển đã vài thập kỷ sau kỹ thuật giải trình tự củaSanger [79],[80] Công nghệ NGS khác với Sanger ở chỗ phân tích các đoạnDNA đồng thời, số lượng lớn và thông lượng cao nhiều mẫu với chi phí giảmrất nhiều [81] Do vậy, NGS được ứng dụng rất rộng rãi nhằm phân tíchcffDNA từ huyết tương mẹ xác định lệch bội thai Tuy nhiên số lượngcffDNA dao động rất lớn từ 1% đến 40% Do đó, để đạt được độ nhạy và độđặc hiệu tối đa, xét nghiệm phân tích cfDNA dựa trên NGS phải xác địnhđược cả hàm lượng cffDNA và khả năng lệch bội thai Hiện tại có ba phươngpháp khác nhau để phân tích cfDNA đang được sử dụng để sàng lọc trướcsinh trong lâm sàng: giải trình tự song song khối lượng lớn toàn bộ bộ gen(Whole genome sequencing - WGS/Massive parallel sequencing - MPS), giảitrình tự chọn lọc hay mục tiêu của các vùng gen quan tâm bằng MPS

(Chromosome-selective sequencing - CSS) hoặc sử dụng microarray và giảitrình tự bằng phân tích kiểu gen dựa vào đa hình đơn nucleotide (singlenucleotide polymorphism - SNP) Trong mỗi phương pháp phân tích này, cácthuật toán tin sinh học và phương pháp thống kê khác nhau được sử dụng đểtính toán điểm z-score nhằm phân loại kết quả là “sàng lọc dương tính” hoặc

“nguy cơ cao”

1.4.1 Nguyên lý

Nguyên tắc cơ bản mà NGS hoạt động tương tự như các phương phápgiải trình tự Sanger truyền thống liên quan đến điện di mao quản Hầu hết, cácphương pháp NGS khác nhau sẽ áp dụng quy trình giải trình tự khác nhau.Chuẩn bị mẫu là bước đầu tiên trong quá trình giải trình tự trong đó DNA sợiđôi được coi là nguyên liệu ban đầu, tuy nhiên, nguồn gốc DNA có thể khácnhau Tiếp theo liên quan đến việc tạo thư viện, DNA được cắt thành các đoạnngắn và được tinh sạch, sau đó nối với adapter và barcode Bước tiếp theo liênquan đến khuếch đại thư viện, để tạo ra tín hiệu quan trọng cho việc bổ sungnucleotide Bước này liên quan đến việc gắn đoạn DNA vào microbead hoặcvào tấm kính thủy tinh, thực hiện phản ứng PCR Sau đó đến bước giải trình

tự và tạo hình ảnh Bước cuối cùng của NGS là phân tích dữ liệu được tạo rathông qua quá trình giải trình tự này Phân tích dữ liệu NGS là nhiệm vụ phứctạp và quan trọng Nó liên quan đến việc đánh giá một số gen quan trọng hoặccác yếu tố điều hòa trong bộ gen Sử dụng một số phần mềm chuyên dụng đểphân tích dữ liệu NGS

1.4.2 Một số hệ thống máy giải trình tự thế hệ mới phổ biến trên thế giới

Ngày nay, có rất nhiều hệ thống máy NGS trên thị trường, mỗi hệ thốngmáy đều có chi phí, lợi ích và hạn chế riêng, đặc biệt là khi được sử dụng choxét nghiệm NIPS Trong số các hệ thống NGS hiện đang được sử dụng rộngrãi trên thị trường, có 4 hệ thống đã được sử dụng cho xét nghiệm NIPS, là