báo cáo thực hành nông lâm

Giải thích - Khi cho enzyme vào dung dịch chứa tinh bột, tinh bột sẽ bị thủy phân tạo ra 1 lượng nhỏ đường khử và sau đó bị enzyme phân cắt thành 1 lượng dextrin, khi nhỏ Fehling vào và

3

4

M ỤC LỤC

Bài 1 KH ẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA YẾU TỐ NGOẠI CẢNH ĐẾN HOẠT

TÍNH CỦA ENZYME 5

Tính đặc hiệu của enzyme 5

Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của Enzyme 7

Kh ảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của enzyme 9

Ảnh hưởng của chất hoạt hóa và chất ức chế đến hoạt tính của enzyme 12

Bài 2: ENZYME BROMELINE 15

Bài 3: ENZYME PECTINASE 17

Xác định hoạt tính pectinase bằng phương pháp so màu 17

Ứng dụng pestinase trong nước ép trái cây 19

5

BÀI 1 KH ẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA YẾU TỐ NGOẠI CẢNH

ĐẾN HOẠT TÍNH CỦA ENZYME

I Tính đặc hiệu của enzyme

1 Nguyên tắc

- Tính đặc hiệu của mỗi enzyme thể hiện ở điểm: Mõi enzyme chỉ tác dụng lên một cơ chất nhất định Chẳng hạn amylase chỉ thủy phân polysaccharide

mà không tác dụng lên disaccharide

- Saccharide không cho phản ứng vưới Fehling vò trong phân tử không có nhóm cetose hoặc aldehyde tự do Phản ứng này chỉ dương tính khi saccharose đã được thủy phân thành fructose và glucose

Sau đó đem cho vào mỗi ống 1 ml dung dịch Fehling ( đã được pha) lắc đều, rồi đem ngâm vào nước nóng đến khi 1 trong hai ống chuyển màu thì ngừng

3 Nhận xét

- Ống nghiêm chứa dung dịch tinh bột chuyển sang màu đỏ gạch trước Trong khi ống nghiệm chứa dung dịch saccharose chỉ xuất hiện 1 màu đỏ rất nhạt

- Sau khi để 2 ống nghiệm ra nhiệt độ phòng 1 thời gian, màu đỏ gạch dần đậm lên ở cả 2 ống nghiệm

6

4 Giải thích

- Khi cho enzyme vào dung dịch chứa tinh bột, tinh bột sẽ bị thủy phân tạo ra

1 lượng nhỏ đường khử và sau đó bị enzyme phân cắt thành 1 lượng dextrin, khi nhỏ Fehling vào và ngâm trong nước nóng quá trình phân cắt ngày càng mạnh tạo ra nhiều dextrin hơn do đó mà màu đỏ gạch xuất hiện

và ngày 1 đậm hơn Do Dextrin là hỗn hợp của các polyme của các đơn vị D- glucose liên kết bởi các liên kết glycosidic α- (1 → 4) hoặc α- (1 → 6) nên sẽ phản ứng với thước thử Fehling cho ra kết tủa đỏ gạch

- Ống nghiệm chứa dung dịch Saccharose khi cho enyme vào ở nhiệt độ phòng sẽ không thể phân cắt được vì không có tính khử ( không chứa liên kết 1- 4 glucoside) vì thế enzyme không thể phân cắt ở nhiệt độ thường và không hiện tượng với thuốc thử Fehling Tuy nhiên khi để ông nghiệm trong nhiệt độ sôi, enzyme đã phân cắt 1 lượng nhr saccharose thành đường

khử Vì thế thời gian chuyển sang màu đỏ gạch nhỏ lâu và nhạt hơn ống chứa tinh bột

- Ở nhiệt độ từ 30 - 50C: enzyme hoạt động mạnh nhất

- Ở nhiệt độ từ 60 - 80C: enzyme mất khả năng hoạt động

- Ở nhiệt độ 100C: enzyme bắt đầu mất tác dụng

Pipep 1ml Pipep 5ml Giá để ống nghiệm

- Để hai ống nghiệm ngoài nhiệt độ phòng khoảng 5 phút

- Trộn hai ống nghiệm lại với nhau, lắc đều

- Đem 2 ống nghiệm đun cách thủy ở nhiệt độ 60C trong khoảng 5 phút

- Trộn hai ống nghiệm lại với nhau, lắc đều

- Cứ sau 1 phút: nhỏ 1 giọt lugol lên mặt kiếng, sau đó nhỏ vào đó 1 giọt hỗn hợp trên Khi nào thấy màu xanh không xuất hiện nữa thì dừng lại

- Đem 2 ống nghiệm đun cách thủy ở nhiệt độ 90C trong khoảng 5 phút

- Trộn hai ống nghiệm lại với nhau, lắc đều

- Cứ sau 1 phút: nhỏ 1 giọt lugol lên mặt kiếng, sau đó nhỏ vào đó 1 giọt hỗn hợp trên Khi nào thấy màu xanh không xuất hiện nữa thì dừng lại

9

- Ở nhiệt độ 60C thì thời gian thủy giải của amylase là lâu nhất vì khi ở nhiệt độ cao enzyme đã bị biến tính dẫn đến mất khả năng hoạt động nên thời gian thủy phân kéo dài đến 32 phút

- Ở nhiệt độ 90C thì thời gian thủy giải của amylase là nhanh nhất Theo

lý thuyết thì thời gian thủy giải của amylase sẽ lâu nhất vì ở 90C enzyme bắt đầu mất tác dụng, nhưng kết quả của nhóm có được với thời gian nhanh nhất có thể là do thao tác trong quá trình làm thí nghiệm như: nhiệt độ không đảm bảo trong quá trình đun, thao tác thí nghiệm của nhóm chậm nên nhiệt độ của dung dịch giảm dần ( trong quá trình trộn 2 dung dịch lại với nhau) sau khi lấy ra khỏi bếp đun

- Ở nhiệt độ 30C thì thời gian thủy giải của amylase tương đối nhanh vì đây là khoảng nhiệt độ thích hợp để enzyme hoạt động mạnh nhất

III Khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của enzyme

1) Nguyên t ắc

Hoạt tính của enzyme thể hiện trong vùng pH tương đối hẹp là pH tối ưu pH tối ưu của một số enzyme như pepsin là 1,2-2,5; catalase 7,0; trypsin 8,0-9,0…

Lấy 3 ống nghiệm cho vào:

• Ống nghiệm 1: 1 ml dung dịch hồ tinh bột 1% và 1 ml dung dịch đệm pH 4

• Ống nghiệm 2: 1 ml dung dịch hồ tinh bột 1% và 1 ml dung dịch đệm pH 6

• Ống nghiệm 3: 1ml dung dịch hồ tinh bột 1% và 1 ml dung dịch đệm pH 8

Sau đó cho vào mỗi ống nghiệm 1 ml dung dịch enzyme amylase đã pha loãng Tiến hành khảo sát hoạt tính của enzyme dưới ảnh hưởng của pH bằng cách xác định thời gian thủy giải của amylase (tương tự thí nghiệm 2)

Vẽ đường biểu diễn sự biến thiên của thời gian thủy giải (phút) đối với pH

12

6 Nhận xét và giải thích

• Tại pH=6, thời gian thủy giải của amylase là ngắn nhất, đồng nghĩa với việc

amylase hoạt động mạnh ở pH=6; tại pH =4 và pH=8, thời gian thủy giải cao suy

ra amylase hoạt động kém ở các pH này

• Mỗi enzyme sẽ có một pH tối ưu riêng, tại các giá trị pH tối ưu này thì enzyme sẽ phản ứng mạnh nhất Enzyme amylase có pH tối ưu là 5.6-6.9 Vì vậy nó có hoạt tính mạnh nhất ở pH=6

IV Ảnh hưởng của chất hoạt hóa và chất ức chế đến hoạt tính của enzyme

Chất hoạt hóa là chất có khả năng làm tăng cường tác dụng của enzyme Chúng có bản chất hóa học khác nhau Thí nghiệm ion Cl- đối với α-amylase, glutathion đối với nhiều protease thực vật, cystein đối với nhiều loại enzyme, làm giảm ái lực của enzyme đối với

cơ chất hoặc làm enzyme mất khả năng kết hợp với cơ chất Thí dụ các ion Ag2+, Hg2+,

Pb2+,… là chất ức chế của hầu hết các enzyme

1) Nguyên tắc:

Amylase của nước bọt (α-amylase) sẽ tăng hoạt động trong môi trường có NaCl, ngược

lại CuSO4 sẽ ức chế tác dụng của enzyme này

Trong 3 ống nghiệm có chứa α-amylase và tinh bột Nếu ta cho NaCl vào ống thứ nhất, CuSO4 vào ống thứ hai, và nước vào ống thứ 3 thì sau cùng một thời gian tác dụng ta sẽ thấy:

Ống 1: tinh bột được thủy giải hoàn toàn

Ổng 2: không có sự thủy phân tinh bột

Ống 3: tinh bột chỉ được thủy giải đến dextrin

13

Để pha 1ml dung dịch NaCl 10% ta lấy 0,1ml NaCl và 0,9ml nước

Lấy 3 ống nghiệm, cho vào:

- Ống 1: 0,5ml dung dịch amylase đã pha loãng và 0,5ml NaCl 1%

- Ống 2: 0,5ml dung dịch amylase đã pha loãng và 0,5ml CuSO4 1%

- Ống 3: 0,5ml dung dịch amylase đã pha loãng và 0,5ml nước cất

Tiếp tục cho vào mỗi ống 1ml dung dịch hồ tinh bột 1%, lắc đều Để cả 3 ống ở nhiệt độ phòng khoảng 3-5 phút Sau đó cho 1-2 giọt thuốc thử lugol hoặc iod Nhận xét và giải thích

là chất hoạt hóa

- Ống 2: Có màu xanh tím chứng tỏ tinh bột không bị thủy phân nên khi cho thuốc thử lugol vào thì môi trường có màu xanh tím đặc trưng (Vì ở nhiệt độ phòng tinh bột có phân tử amylozo dạng xoắn theo kiểu lò xo có lỗ rỗng nên tinh bột hấp thụ iod trong lugol cho màu xanh tím đặc trưng) Như vậy, sự xuất hiện của CuSO4

14

trong thí nghiệm đã ức chế quá trình thủy phân tinh bột của enzyme amylase Vì vậy, CuSO4 là chất ức chế

- Ống 3: Có màu của thuốc thử Tinh bột bị thủy phân 1 phần thành dextrin nhưng

do enzyme amylase cần thời gian để thủy phân tinh bột nên màu xanh tím bị mất màu dần sau khi xuất hiện Thời gian diễn ra phản ứng lâu hơn ống 1 nhưng vẫn

có xảy ra Vì vậy nước không phải là chất xúc tác cũng không phải là chất ức chế

15

Bài 2: ENZYME BROMELINE

Ứng dụng enzyme bromelin trong làm mềm thịt

Bromeline là protease có nguồn gốc thực vật Bromeline có nhiều trong các phần khác nhau của cây dứa: quả, chồi, thân, vỏ,…

Dĩa 1: Bổ sung 20 ml nước dứa, ngâm trong ít nhất 2 giờ

Dĩa 2: Bổ sung 20 ml enzyme protease đã pha loãng 10 lần, ngâm trong ít nhất 2 giờ Dĩa 3: Không xử lí (đối chứng), bổ sung 20 ml nước, ngâm trong ít nhất 2 giờ

Sau 2 giờ, đun nóng thịt trong các đĩa trên trong 5 phút ở 1000C Quan sát, đánh giá và so sánh mùi vị, cấu trúc của thịt giữa các mẫu

Thảo luận:

16

a) Kết quả:

- Dĩa 1 (nước dứa): Thịt có vị chua nhất, ít dai nhất, mềm, dễ rã

- Dĩa 2 (enzyme protease): Thịt có vị chua, thơm, có độ dai

- Dĩa 3 (đối chứng): Thịt có vị ngọt, thịt dai nhất

b) Nh ận xét và giải thích:

- Dĩa 1: Thịt mềm nhất do trong dứa có enzyme bromelain có khả năng phân cắt các liên kết peptide nội phân tử protein để chuyển phân tử protein thành các đoạn nhỏ gọi là các peptide

- Dĩa 2: Thịt mềm do enzyme protese có tác dụng thủy phân protein có trong thịt làm mềm cấu trúc thịt

- Dĩa 3: Thịt còn dai, thơm mùi thịt do không có tác dụng của enzyme

Kết luận:

Enzyme bromeline trong dứa có tác dụng làm mềm thịt và tăng hương vị thơm ngon, vì thế được ứng dụng rộng rãi trong chế biến thực phẩm: nhà nấu, trong công nghiệp,… Bên cạnh đó, enzyme protease có tác dụng làm mềm thịt và tăng hương vị, nhưng có tác dụng

Hình ảnh thịt trước và sau khi hoàn thành thí nghiệm

17

thấp hơn enzyme bromline Vì thế, tùy vào mục đích sử dụng, nhu cầu của mỗi người, mỗi công ty mà sử dụng loại enzyme phù hợp để được kết quả tốt nhất

BÀI 3: ENZYME PECTINASE

➢ Enzyme Pectinase là một loại enzyme được tìm thấy trong thành tế bào thực vật Enzyme này chuyển hóa pectin thành pectic acid bằng cách xúc tác quá trình khử ester của nhóm methoxyl trong pectin

➢ Pectinase hiện là một phần không thể thiếu trong các ngành công nghiệp nước ép trái cây và các ứng dụng công nghệ sinh học khác, bởi vì chúng giúp chất lượng nước ép được trong, đồng nhất và ổn định khi sản xuất với quy mô lớn Chúng còn được sử dụng trong dinh dưỡng trẻ em, chiết xuất dầu, nước cam đóng hộp, chiết xuất đường từ quả chà là

I Xác định hoạt tính pectinase bằng phương pháp so màu

1) Nguyên tắc:

Là phương pháp dựa trên việc so sánh cường độ màu của dung dịch nghiên cứu với dung dịch tiêu chuẩn có nồng độ xác định Phương pháp này mất ít thời gian hơn các phương pháp hóa học khác Nguyên tắc của phương pháp này là xác định lượng acid galacturonic được tạo ra nhờ sự thủy phân của enzyme peptinase Cơ chất pectin không tạo kết tủa bởi ZnSO4

Lấy 5ml dung dịch Anthrone cho vào ống nghiệm, sau đó cho 2,5ml dung dịch lọc

đã pha loãng, lắc mạnh trong 10 phút Tiếp tục cho vào nồi cách thủy ở 70°C/12 phút rồi lấy ra làm nguội đến nhiệt độ phòng Pha loãng 10 lần và tiến hành đo giá trị OD ở bước sóng X = 585 nm

Làm một ống nghiệm đối chứng bằng cách thay dung dịch enzyme bằng nước cất rồi tiến hành đo giá trị OD

4) Kết quả:

➢ OD đối chứng = 1,642

➢ OD thí nghiệm = 1,956

=> ΔOD = OD thí nghiệm – OD đối chứng = 0,314

Vậy, ta tính được hoạt tính pectinase bằng 0,09636

Với:

➢ OD: mật độ quang của dung dịch sau phản ứng ở bước sóng X = 585nm

➢ M: thể tích của dung dịch phản ứng (ml)

− Với kết quả thu được 0,09636, hoạt tính của pectinase sau 60 phút biến đổi được 0,09636ml pectin thành acid galcturonic

II Ứng dụng pestinase trong nước ép trái cây

1 Nguyên tắc:

Enzyme pectinase là một nhóm enzyme thủy phân các chất pectin, sản phẩm tạo thành là acid galacturonic, galactose, methanol Enzyme pectinase được sử dụng rộng rãi trong sản xuất nước quả để làm tăng tốc độ lọc và hiệu suất ép, đồng thời trong quá trình tồn trữ nước quả sẽ không bị đục do pectin bị lắng trở lại

2 Dụng cụ và hóa chất:

❖ Hóa ch ất:

- Cân 50g táo, rửa sạch, xay nhuyễn với 100ml nước cất sau đó lọc lấy dịch

- Dùng pipet hút 18ml dịch trên cho vào ống nghiệm của 5 ống khác nhau

- Thêm dung dịch pectinase 1% vào từng ống nghiệm với thể tích tuần tự trong các ống là 0; 0,5; 1; 1,5 và 2ml

- Sau đó thêm nước cất vào cho mỗi ống đủ 20ml

1 đến ống 3, dung dịch trong ống 3; 4; 5 có tốc độ chảy qua giấy lọc gần như nhau

Giải thích:

Quá trình lọc giúp cải thiện chỉ tiêu độ trong của nước ép, sau quá trình xử lý dịch

ép với enzyme pectinase, mạch pectin bị cắt nhỏ từ đó làm giảm độ nhớt của dịch ép (giải thích cho sự khác nhau về thời gian chảy của các dung dịch qua giấy lọc) Tốc độ chảy của các ống 3; 4; 5 có thể giải thích do sự kết hợp của enzyme và cơ chất

(enzyme và cơ chất kết hợp với nhau theo một tỷ lệ, đến một ngưỡng nhất định nếu có tăng nồng độ enzyme thì tốc độ phản ứng vẫn không thay đổi) Nước quả đục là hệ huyền phù trong đó phần tử rắn (thịt quả) có kích thước nhỏ, trong nước quả, sự có mặt của hợp chất polyphenol với pectin tạo nên những kết tủa không tan Sự có mặt của pectinase sẽ thúc đẩy nhanh quá trình phân giải pectin thành các phân tử hòa tan từ

đó sẽ cải thiện độ trong của dịch ép

22

Kết luận:

Enzyme pectinase có ảnh hưởng đáng kể đến việc làm trong dịch ép táo