Nuôi cấy vi sinh vật

BÀI 1 CHUẨN BỊ DỤNG CỤ PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT I Mục đích Bao gói dụng cụ Biết cách bao gói ,làm nút bông ,khử trùng dụ cụ bằng nồi hấp khử trùng ở áp suất cao và bằng tủ sấy Nắm vững yêu cầu ,nguyên tắc ,các bước thực hiện pha chế và khử trùng môi trường nuôi cấy vi sinh vật Phương pháp khử trùng Làm chết hoàn toàn mọi mầm mống vi sinh vật, kể cả các vi sinh vật có bào tử Đây là khâu quan trọng nhất Khi nghiên cứu vi sinh vật, cần thiết phải khử trùng môi trường, dụng cụ, thiết.

BÀI 1

CHUẨN BỊ DỤNG CỤ - PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT

I Mục đích:

Bao gói dụng cụ: Biết cách bao gói ,làm nút bông ,khử trùng dụ cụ bằng nồi hấp khử

trùng ở áp suất cao và bằng tủ sấy Nắm vững yêu cầu ,nguyên tắc ,các bước thực hiện pha chế và khử trùng môi trường nuôi cấy vi sinh vật

Phương pháp khử trùng: Làm chết hoàn toàn mọi mầm mống vi sinh vật, kể cả các

vi sinh vật có bào tử Đây là khâu quan trọng nhất Khi nghiên cứu vi sinh vật, cần thiết phải khử trùng môi trường, dụng cụ, thiết bị để tránh sự phát triển lẫn lộn các hệ vi sinh vật ngoại lai vào giống vi sinh vật đang nghiên cứu

Pha môi trường: Là hỗn hợp gồm các chất dinh dưỡng và các chất có nhiệm vụ duy trì

thế oxi hóa khử ,áp suất thẩm thấu của tế bào và sự ổn định của độ pH của môi trường

II Nguyên tắc:

Bao gói dụng cụ: để nuôi cấy vi sinh vật phải đạt độ trung tính, phải thật sạch và khô,

không bị nứt mẻ Cần cẩn thận để dụng cụ sau khi khử trùng vẫn đảm bảo vô trùng trong lớp giấy gói và lấy ra sử dụng dễ dàng

Phương pháp khử trùng:

 Tiêu diệt toàn bộ vi sinh vật ngoại lai hiện diện trong môi trường

 Tạo điều kiện vô trùng cho môi trường để kết quả phân lập, nuôi cấy chính xác

 Không làm biến tính môi trường, không làm biến tính một số chất trong môi trường

 Sau khi khử trùng, trong môi trường không sản sinh ra các chất độc gây chết vi sinh vật nuôi cấy

 Phải đảm bảo điều kiện vô trùng tuyệt đối sau khi khử trùng

 Bảo đảm an toàn đối với người sử dụng

Phương pháp làm môi trường:

 Dựa trên cơ sở nhu cầu về các chất dinh dưỡng và khả năng đồng hóa các chất dinh dưỡng của từng loại vi sinh vật

 Đảm bảo sự cân bằng về áp suất thẩm thấu giữa môi trường và tế bào vi sinh vật nên cần điều chỉnh tỷ lệ và nồng độ các chất trong thành phần môi trường

 Đảm bảo các điều kiện hóa lý cần thiết cho các hoạt động trao đổi chất của vi sinh vật

III Tiến hành và phương pháp:

Cách làm nút bông: Dùng miếng bông không thấm nước cuộn lại, nhét vào miệng ống

nghiệm sao co vừa đủ chặt Cách làm nút gòn này được áp dụng cho các chai lọ, bình cầu, bình tam giác, cách làm cũng tương tự như đối với ống nghiệm Nhưng lượng gòn sử dụng

phải nhiều hơn và có thể được bọc bằng một lớp vải gạc Về yêu cầu:

 Nút gòn có kích thước và độ chặt vừa phải

 Đầu nút phải tròn, gọn, phần ngoài lớn hơn phần trong ống nghiệm

 Lấy nút ra hay đóng vào dễ dàng

Cách bao gói dụng cụ: Với các dụng cụ sau khi làm nút bông ,cần được bao gói phần

có nút bông bằng giấy dầu hay giấy báo để khi hấp khử trùng nút bông không bi ướt và đảm bảo điều kiện vô trùng tốt hơn Cách làm như sau:

 Cắt các mãnh giấy hình chữ nhật với kích thước tùy theo dụng cụ cần bao gói

 Quấn giấy quanh phần đầu của nút bông

 Gập ống giấy sát vào nút bông ở mặt trước và hai bên

 Gập nốt phần giấy còn lại và cài sâu vào hai bên

 Khử trùng dụng cụ thủy tinh bằng phương pháp nhiệt khô

Các hộp petri , ống hút thủy tinh bền với nhiệt có thể dược khử trùng bằng phương pháp sấy ở 170°trong 2 giờ trong tủ sấy Trong trường hợp này, các ống hút cần được nhét nút bông không thấm nước ở đầu hút Hợp petri ,ống hút ,các dụng cụ cần khử trùng khác được gói kín bằng giấy hoặc giấy nhôm trước khi sấy

Khử trùng dụng cụ, môi trường bằng nồi áp lực: Phương pháp này được thực hiện

trong nồi vô trùng ở áp suất cao Là thiết bị làm bằng kim loại, chịu nhiệt độ v à áp suất cao,

có khả năng tự động điều chỉnh áp suất và thời gian khử trùng theo yêu cầu của người sử dụng

Pha chế môi trường (môi trường PGA,môi trường pepton lỏng ,môi trường Gause):

Cân, đong chính xác từng thành phần của môi trường và pha chế đúng theo trình tự đã hướng dẫn

o Với môi trường lỏng: các chất cân đong xong cho hòa tan vào nước.

o Với môi trường đặc: là môi trường lỏng có bổ sung thêm agar (1,5-2,5%) Cân hóa

chất hòa tan vào nước, bổ sung lượng nước vừa đủ theo công thức Cho agar vào, đun

sôi và khuấy đều cho đến khi agar vừa tan.

Khử trùng môi trường: Tùy theo tính chất và điều kiện cụ thể của từng loại môi

trường mà chế độ và phương pháp khử trùng khác nhau

Bảo quản và kiểm tra môi trường: Môi trường chưa dùng cần được bảo quản ở chỗ

mát, hạn chế tác dụng của ánh sáng, nhiệt độ từ 0-5°C và không để môi trường bị khô Trước khi sử dụng, để kiểm tra độ vô khuẩn của môi trường người ta thường đặt chúng vào tủ ấm

37°C, trong 48-72h Sau khi lấy ra quan sát loại bỏ các môi trường có vi sinh vật phát triển

và chỉ sử dụng những ống nghiệm, những đĩa petri có môi trường đạt yêu cầu

IV Thực hành, kết quả và nhận xét:

(Mỗi tổ pha 2 môi trường để thực hành sau đó sẽ dùng chung môi trường với nhau)

 Thực hành bao gói và khử trùng các loại dụng cụ: ống nghiệm ,ống hút,que gạt,đĩa

petri,bình tam giác ,…

 Thực hành pha môi trường dinh dưỡng nuôi cấy vi sinh vật:

 Môi trường PGA (potato glucose agar) dùng nuôi cấy nấm mốc Dùng 60g khoai

tây,6g glucose ,6g agar,300ml nước cất,pH=6.5 Cân lượng cần thiết cho môi trường

đủ cho 300ml ,môi trường PGA Khoai tây gọt sạch vỏ ,dùng dao cắt lát ,nấu sôi rồi lọc lấy nước khiết Cho glucose vào dung dịch chiết khoai tây và làm tan hoàn toàn

Bổ sung lượng nước cho đủ theo công thức Dùng agar vào ,đun sôi và khuấy đều cho đến khi agar tan hoàn toàn Dùng phễu thủy tinh rót môi trường vào ống nghiệm để làm thạch nghiêng Đậy ống nghiệm bằng nút bông Khử trùng 1atm/15 phút Sau khi hấp vô trùng xong , lấy ra và để nghiêng một góc 20° Để nguội cho môi trường đặc lại

 Môi trường pepton lỏng: nuôi cấy vi khuẩn Dùng cao thịt 1.5g ,pepton 3g ,nước cất

300ml Cân đúng thành phần trên cho vào trong cốc chứa 300ml nước cất Đem đun nhẹ cho tan đều Dùng phễu thủy tinh rót vào mỗi ống nghiệm(25 ống nghiệm ).Đậy nút bông, gói giấy và hấp vô trùng 1atm/15 phút

 Môi trường Gause: để nuôi cấy xạ khuẩn Dùng 6g tin bột tan ,0.15g K2HPO4 ,0.15g MgSO4.7H2O ,0.3g KNO3,0.15g NaCl , 0.03g FeSO4 Pha trong 2 bình tam giác 150ml Đậy nút bông ,gói giấy và hấp vô trùng

KÊT QUẢ VÀ NHẬN XÉT: Môi trường PGA nghiêng (potato glucose agar)

Hình PGA thạch nghiêng

BÀI 2 NUÔI CẤY, QUAN SÁT SỰ PHÁT TRIỂN CỦA VI SINH VẬT

I Mục đích:

- Nắm vững các nguyên tắc và mục đích của việc nuôi cấy vi sinh vật

- Thực hiện được các thao tác cấy truyền từ ống giống sang các loại môi trường thạch nghiêng, thạch đứng, thạch đĩa

- Theo dõi, quan sát và ghi nhận sự phát triển của vi sinh vật trên các loại môi trường nuôi cấy

Dụng cụ:

- Bút ghi ống nghiệm, gòn thấm

- Que cấy vòng, que cấy móc

- Đèn cồn, giá để ống nghiệm

- Các ống môi trường thạch nghiêng (Pepton, Hansen, PGA), thạch đĩa ( Pepton, Hansen, PGA), môi trường lỏng ( Pepton, Hansen,PGA)

- Các ống giống vi khuẩn ( E Coli, Bac Subtilis, Streptococus), nấm men

(Saccharomyces ), nấm sợi (Aspergillus, Penicillium, Mucor, Rhizopus )

II Nguyên Tắt

Mọi thao tác nuôi cấy đều phải thực hiện trong điều kiện vô trùng để tránh tạp nhiễm Môi trường và dụng cụ nuôi cấy phải được khử trùng triệt để

Duy trì tốt các điều kiện nuôi cấy để vi sinh vật phát triển:

Để đảm bảo vi sinh vật phát triển tốt, sau khi cấy xong phải quan tâm đến các điều kiện nuôi dưỡng Có nhiều điều kiện ảnh hưởng đến sự phát triển của vi sinh vật, nhưng đáng chú ý nhất là những điều kiện sau

Nhiệt độ

Tùy loài vi sinh vật, chọn nhiệt độ tối thích cho sự phát triển của chúng và duy trì sự ổn định nhiệt độ đó Dựa vào nhiệt độ tối thích cho sự phát triển của vi sinh vật, người ta chia chúng làm 3 nhóm sau đây:

Vi sinh vật ưa ấm có nhiệt độ tối thích 20-30ºC

Vi sinh vật ưa nóng có nhiệt độ tối thích 55-60ºC

Vi sinh vật ưa lạnh có nhiệt độ tối thích 10-15ºC

Để duy trì nhiệt độ thích hợp, ta sử dụng các tủ hoặc phòng ấm có bộ phận điều chỉnh nhiệt độ tự dộng luôn luôn duy trì nhiệt độ ở mức nhất định nào đó

Độ ẩm

Để đảm bảo độ ẩm cho vi sinh vật phát triển ta có thể thực hiện bằng các cách sau:

Khi chuẩn bị môi trường phải đảm bảo đủ lượng nước

Phun nước vô khuẩn vào phòng nuôi hoặc để nước bốc hơi trong tủ ấm

Điều kiện hiếu khí và yếm khí:

Nuôi hiếu khí

Cung cấp thường xuyên và đầy đủ oxy cho vi sinh vật có thể thực hiện bằng các biện pháp:

Lớp môi trường nuôi cấy có độ dày vừa phải ( 2-8cm) có thể nuôi trong ống nghiệm, khay, bình tam giác

Các bình chứa canh trường được lắc thường xuyên trong quá trình nuôi để cung cấp thêm oxy cho vi sinh vật

Nếu nuôi cấy sâu trong môi trường lỏng, thì phải tiến hành sục khí thường xuyên hay định kỳ

Nuôi kỵ khí

Ngăn cách không cho vi sinh vật tiếp xúc với oxy bằng cách:

Sau khi cấy xong ta đổ lên bề mặt môi trường một lớp dầu paraphin, dầu vazolin hoặc lớp thạch dày khoảng 2cm Cách này đơn giản dễ áp dụng Chú ý: dầu và thạch phải vô khuẩn, dầu phải trung tính

Cấy đâm sâu trong môi trường đặc

Nuôi cấy trong bình hút chân không, có thể dùng những ống nghiệm đặc biệtgieo cấy xong hút hết không khí rồi hàn kín lại

Đun sôi môi trường 20-30 phút rồi làm nguội nhanh để đuổi hết oxy trong đó

Dùng hóa chất để loại trừ oxy của không khí trong dụng cụ nuôi

Có thể nuôi vi sinh vật hiếu khí cùng vi sinh vật kỵ khí Phương pháp này thì khó áp dụng

III Tiến Hành và Phương Pháp

Phương pháp chung của việc cấy chuyền

ví dụ: cấy chuyền từ ống nghiệm chứa giống sang ống nghiệm chứa môi trường gồm các thao tác chính sau:

Đốt đèn cồn lên

Tay trái cầm 2 ống nghiệm: ống giống nằm ở ngoài, ống môi trường ở trong, giữ cả 2 ống hơi nghiêng

Tay phải cầm que cấy và khử trùng trên ngọn đèn cồn cho đến khi nóng đỏ dây cấy

Dùng ngón út và ngón áp út kẹp nút bông vào lòng bàn tay xoay nhẹ, kéo nút bông ra và giữ trên tay đến khi đậy lại

Hơ nóng để khử trùng không khí ở miệng 2 ống nghiệm

Đợi khi que cấy vừa nguội, khéo léo đưa que cấy tiếp xúc với khuẩn lạc trong ống giống Rút que cấy ra, không để que cấy chạm vào thành ống nghiệm và đưa vào ống nghiệm môi trường để thực hiện thao tác cấy chuyền

Rút que cấy ra, khử trùng lại phần không khí nơi miệng ống nghiệm rồi đậy nút bông lại

Để các ống nghiệm vào giá, đốt lại que cấy trên đèn cồn rồi để vào chỗ cũ

Dán nhãn ghi tên giống vi sinh vật, ngày cấy, tên môi trường vào thành ống nghiệm

Chú ý: Cách cấy chuyền này có thể tiến hành từ canh trường đặc ( hoặc lỏng) sang môi

trường đặc (hoặc lỏng)

Nếu ống giống là canh trường lỏng, ngoài việc dùng que cấy còn có thể dùng pipet để hút canh trường Pipet phải được chuẩn bị và làm vô khuẩn trước ( rửa sạch, sấy khô, bọc giấy, khử trùng) Khi dùng tháo giấy ra và dùng ngay Dùng xong cắm pipet vào dung dịch khử khuẩn

Phương pháp cấy trên thạch nghiêng

Phương pháp này dùng để cấy các vi sinh vật hiếu khí

Thông thường dùng que cấy vòng, trình tự tiến hành giống như trên Nhưng sau khi lấy được giọt canh trường vi sinh vật vào đầu que cấy rồi, ta tiếp tục như sau:

Đưa đầu que cấy vào tận đáy ống nghiệm

Nhẹ nhàng hòa giọt canh trường vi sinh vật vào giọt nước ngưng tụ ở đáy ống nghiệm

Nhẹ nhàng và từ từ kéo đầu que cấy trên mặt thạch từ đáy lên trên theo các kiểu như sau: Theo kiểu hình chữ chi

Theo hình vòng xoắn

Theo đường vạch ngang song song

Một số kiểu cấy trên ống thạch nghiêng

Phương pháp cấy trên đĩa petri

Có thể cấy trên đĩa petri theo một trong hai cách: dùng que cấy vòng, dùng pipet Trong phạm vi bài này chúng ta chỉ thực hiện theo cách dùng que cấy vòng và trình tự được thực hiện như sau:

Để đĩa petri lên bàn

Dùng que cấy lấy canh trường vi sinh vật theo thư tự và yêu cầu vô trùng như đã nêu phần trên

Tay trái hé mở nắp hộp vừa đủ để cho đầu que cấy vào

Nhẹ nhàng và nhanh chóng lướt que cấy trên mặt thạch theo các kiểu:

Theo hình chữ chi trên toàn bộ bề mặt thạch

Theo những đường song song

Theo 4 hình chữ chi ở bốn góc của đĩa thạch

Trong quá trình cấy, vì lượng vi sinh vật sẽ bị giảm dần theo đường cấy nên khi vi sinh vật phát triển, càng gần cuối đường số khuẩn lạc càng thưa dần

Các kiểu cấy trên thạch đĩa

IV Thực hành, kết quả và nhận xét:

5.1 E.coli

E.coli sau 3 ngày nuôi cấy bằng phương pháp cấy ria trên đĩa thạch và ống nghiệm nghiên ở

môi peptone, các khuẩn lạc bắt đầu phát triển thành các đóm tròn trắng đục và phát triển đều theo ria cấy không có dấu hiệu nhiễm các sinh vi sinh vật bên ngoài hình dạng khuẩn lạc

E.coli tròn không đều bề mặc khuẩn hơi bóng mép khuẩn lạc bằng phẳng kích thước khuẩn

lạc từ 1 đến 3 mm , tốc độ sinh trưởng vừa, môi trường trong Suy ra ống giống tốt, thao tác trong quá trình nuôi cấy được đảm bảo vô trùng

E.coli sau 6 ngày nuôi cấy bằng phương pháp cấy ria trên đĩa thạch và ống nghiệm nghiên ở

môi peptone, các khuẩn lạc bắt đầu phát triển thành các đóm tròn trắng đục đậm hơn 3 ngày đầu và phát triển đều theo ria cấy không có dấu hiệu nhiễm các sinh vi sinh vật bên ngoài

hình dạng khuẩn lạc E.coli không đều, bề mặc khuẩn hơi bóng mép khuẩn lạc bằng phẳng kích thước khuẩn lạc từ 3 đến 7 mm, các bào tử E.coli bị rơi xuống trong quá trình nuôi cấy

bắt đầu phát triển , tốc độ sinh trưởng vừa, môi trường bị đục dần Suy ra ống giống tốt, thao tác trong quá trình nuôi cấy được đảm bảo vô trùng

Hình ảnh E.coli dưới đèn sau 3 ngày nuôi cấy

5.2 Aspergillus

Aspergillus sau 3 ngày nuôi cấy bằng phương pháp cấy điểm trên đĩa thạch và ống nghiệm

nghiên ở môi trường thích hợp PGA, các sợi nấm bắt đầu phát triển mạnh, dạng hình sợi không đồng đều, có màu xám đen kích thước khoảng 5 đến 6 cm bề các sợi nấm hơi xù xì gấp nếp, mép khuẩn lạc gợn sóng Môi trường phát triển của nấm sợi bị đục, nấm phát triển nhanh trong môi trường, không tạo ván trong môi trường.Không có hiện tượng nhiễm các vi

sinh vật khác ngoài môi trường nuôi cấy Suy ra môi trường nuôi cấy ổn định ống giống tốt, thao tác trong quá trình nuôi cấy được đảm bảo vô trùng

Hình ảnh Aspergillus được nuôi cấy qua 3 ngày.

Aspergillus sau 6 ngày nuôi cấy bằng phương pháp cấy điểm trên đĩa thạch và ống nghiệm

nghiên ở môi trường thích hợp PGA , các sợi nấm phát triển mạnh và ổn định, dạng hình sợi không đồng đều, khuẩn lạc có màu xanh đen kích thước khoảng 5 đến 6 cm phát triển khắp đĩa petri, bề các sợi nấm hơi xù xì gấp nếp, mép khuẩn lạc gợn sóng Môi trường phát triển của nấm sợi bị đục, nấm phát triển nhanh trong môi trường, không tạo ván trong môi trường Không có hiện tượng nhiễm các vi sinh vật khác ngoài môi trường nuôi cấy Suy ra môi trường nuôi cấy ổn định ống giống tốt, thao tác trong quá trình nuôi cấy được đảm bảo vô trùng

5.2 Nấm men Saccharomyces

Sau 3 ngày nuôi cấy nấm men Saccharomyces bắt đầu có dấu hiệu bị nhiễm, xuất hiện 2

hình dạng khuẩn lạc, hình dạng đầu tiên của nấm men có khuẩn lạc hình tròn bán kinh khoản

2 đến 3 mm, kích thước không đều các khuẩn lạc có màu trắng đục bề mặc gồ gề, mép

khuẩn lạc mịn, dạng mỡ, hình dạng thứ 2 của vi sinh vật bị nhiễm có màu đèn khuẩn lạc có hình sợi, mép khuẩn lạc có các sợi, bề mặc gồ gề, kích thước khuẩn lạc từ 2 đến 3 cm nghi ngờ là nấm mốc Môi trường phát triển trong, không bị vấn đục Tốc độ phát triển vừa Suy

ra môi trường nuôi cấy ổn định, thao tác nuôi cấy hoặc môi trường nuôi cấy không đảm bảo

kỹ thuật dẫn đến nhiễm nấm mốc

Hình ảnh Nấm men Saccharomyces sau 3 ngày

nuôi cấy

Sau 6 ngày nuôi cấy nấm men Saccharomyces bị nhiễm, xuất hiện 2 hình dạng khuẩn lạc,

hình dạng đầu tiên của nấm men có khuẩn lạc hình tròn bán kinh khoản 2 đến 3 mm do bị nấm mốc cạnh tranh chất dinh dưỡng, kích thước không đều các khuẩn lạc có màu trắng đục

bề mặc gồ gề, mép khuẩn lạc mịn, dạng mỡ, hình dạng thứ 2 của vi sinh vật thứ 2 nghi ngờ

là nấm mốc có màu đèn khuẩn lạc có hình sợi, mép khuẩn lạc có các sợi, bề mặc gồ gề, kích thước khuẩn lạc từ 3 đến 4 cm, mốc bắt đầu phát triển dày lên và hút hết chất dinh dưỡng trong môi trường dẫn đến khuẩn lạc của nấm men không phát triển được Môi trường phát triển trong, không bị vấn đục Tốc độ phát triển vừa Suy ra môi trường nuôi cấy ổn định, thao tác nuôi cấy hoặc môi trường nuôi cấy không đảm bảo kỹ thuật dẫn đến nhiễm nấm

móc.

BÀI 3 QUAN SÁT HÌNH THÁI VI SINH VẬT DƯỚI KÍNH HIỂN VI

I Mục đích:

-Nắm vững cách sử dụng kinh hiển vi quang học, đặc biệt là kỹ năng sử dụng vật kinh dầu -Biết cách làm tiêu bản ( tạm thời) quan sát một số đặc điểm của vi sinh vật dưới kính hiển vi

- Nắm vững phương pháp làm tiêu bản phòng ẩm quan sát cuống sinh bào tử nấm mốc

-Nắm vung nguyên tắc, các bước thực hiện khi làm tiêu bản cố định nhuộm màu và quan sát được các đặc điểm sinh học của vi sinh vật trên kính hiển vi