NĂM 2021, TẬP 12, SỐ 2

Mục đích của nghiên cứu là tăng độ ổn định của vỏ bao bằng cách kết hợp pectin và ion calci ở dạng calci hydrophosphat DCP nhằm kéo dài Tlag với 2 mục tiêu chính: Chứng minh được sự thay

Tập 12 – Tr 1-59

Số 2/2021

NGHIÊN CỨU DƯỢC & THÔNG TIN THUỐC 2021, TẬP 12, SỐ 2

Journal of Pharmaceutical Research and Drug information 2021, Vol 12 No2

MỤC LỤC

Số 2, 2021

CONTENTS

No2, 2021

và in vivo cho viên nén berberin giải phóng tại

Nguyen Van Lam, Nguyen Thach Tung,

Pham Thi Minh Hue

verapamil hydroclorid kết dính niêm mạc miệng

Nguyễn Thị Thanh Duyên, Phạm Văn Hùng, Chu

Phương Hồng, Trần Thị Hải Yến,

Lê Ngọc Khánh, Đàm Thanh Xuân

Preparation of mucoadhesive buccal patches

Nguyen Thi Kieu Anh, Tran Thi Lan, Dang Thi Ngoc Lan, Ngo Minh Thuy

và acid 4-hydroxybenzoic trong dược liệu bẹ cây

móc bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

Đào Thị Vui, Trần Hồng Linh, Nguyễn Thị

Phương, Nguyễn Thị Hà Ly, Phương Thiện Thương

4-Hydroxybenzoic acid in the Collar of Caryota

mitis by HPLC

Dao Thi Vui, Tran Hong Linh, Nguyen Thi

Phuong, Nguyen Thi Ha Ly, Phuong Thien Thuong

vancomycin trong máu trên bệnh nhân nhiễm

khuẩn huyết tại Trung tâm Bệnh Nhiệt đới,

Bệnh viện Bạch Mai

Nguyễn Hoàng Anh, Lưu Thị Thu Trang, Trần Thu Hương, Nguyễn Thu Minh, Đoàn Thu Trà, Đỗ Duy Cường,

Vũ Đình Hòa, Nguyễn Hoàng Anh

Therapeutic drug monitoring of vancomycin

in septic patients: an evaluation at Tropical Disease Center, Bach Mai hospital

Nguyen Hoang Anh, Luu Thi Thu Trang, Tran

Thu Huong, Nguyen Thu Minh, Doan Thu Tra, Do Duy Cuong,

Vu Dinh Hoa, Nguyen Hoang Anh

(Adinandra lienii Hien & Yakovlev)

Đỗ Văn Hiệu, Vũ Thị Kim Oanh, Nguyễn Hữu Quân,Văn Thị Mỹ Huệ, Phạm Hà Thanh Tùng, Lê Nguyễn Thành, Hoàng

Thị Minh Hiền,Đỗ Hải Hà

Isolated compounds from the leaves of

Adinandra lienii Hien & Yakovlev

Do Van Hieu, Vu Thi Kim Oanh, Nguyen Huu Quan, Van Thi My Hue, Pham Ha Thanh Tung, Le Nguyen Thanh,

Hoang Minh Hien, Do Hai Ha

giúp tăng mức độ hài lòng của người bệnh ngoại

trú tại bệnh viện Nội tiết Trung ương

Nguyễn Thị Song Hà, Lê Thị Uyển,

Lê Thu Thủy, Nguyễn Phương Chi

Training for pharmacists - a potential solution for improving patient satisfaction at the National Hospital of Endocrinology

Nguyen Thi Song Ha, Le Thi Uyen,

Le Thu Thuy, Nguyen Phuong Chi

54 ĐIỂM TIN THÔNG TIN THUỐC – CẢNH

GIÁC DƯỢC

PHARMACOVIGILANCE HIGHLIGHTS

Nguyễn Văn Lâm*, Nguyễn Thạch Tùng, Phạm Thị Minh Huệ

Trường Đại học Dược Hà Nội

*Tác giả liên hệ: lamnv@hup.edu.vn

(Ngày gửi đăng: 26/10/2020 – Ngày duyệt đăng: 07/4/2021)

SUMMARY

Rheology study was used for characterizing viscoelastic propertises of pectin – water dispersion and the effect of calcium hydrophosphate portion on it’s sol – gel tranformation Calcium hydrophosphate (DCP) was mixed with pectin and coated on berberin tablets using dry powder coating technique as described in previous study There was a significant correlation between DCP portion and and T lag The in vitro

T lag was about 5 – 8h but in vivo T lag was 1,5 – 2 higher (about 8-15h) X-ray imaging study in healthy volunteers showed most of tablets located at colon before disintegrating

Từ khóa: Bao khô, giải phóng tại đại tràng, pectin, lưu biến học, chuyển dạng rắn –

lỏng

Đặt vấn đề

Viên nén berberin giải phóng tại đại tràng được bào chế nhằm tập trung nồng độ thuốc cao tại đại tràng để tăng hiệu quả điều trị của thuốc Các nghiên cứu trước sử dụng pectin làm tá dược bao để kiểm soát quá trình giải phóng theo mô hình phân hủy sinh học nhờ vi sinh vật đại tràng Tuy nhiên, thời gian tiềm tàng (Tlag) của viên bao vẫn còn thấp chưa đảm bảo đưa được dược chất tới đại tràng Nguyên nhân là do vỏ bao pectin dễ bị hòa tan bởi môi trường hòa tan nên hạn chế khả năng kiểm soát giải phóng dược chất [1], [2]

Mục đích của nghiên cứu là tăng độ ổn định của vỏ bao bằng cách kết hợp pectin

và ion calci ở dạng calci hydrophosphat (DCP) nhằm kéo dài Tlag với 2 mục tiêu chính: Chứng minh được sự thay đổi đặc tính lưu biến của pectin có ảnh hưởng tới

khả năng giải phóng dược chất và đánh giá được khả năng rã in vivo của viên berberin

bao bởi pectin kết hợp DCP Phương pháp phân tích lưu biến học được áp dụng để xác định cơ chế kéo dài Tlag cũng như lựa chọn tỉ lệ kết hợp giữa DCP và pectin Khả năng

đưa thuốc tới đại tràng và khả năng rã in vivo của viên được đánh giá bằng phương

pháp chụp X-quang trên người tình nguyện có dùng thuốc

Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu

Nguyên liệu: Berberin clorid (DĐVN V), Pectin LM102 AS (GENIUS Pectin),

sorbitol (DĐVN V), glycerin (DĐVN V), natri croscamelose (DĐVN V), celulose vi tinh thể (DĐVN V), Erapac (TCCS), ethanol (DĐVN V), calci hydrophosphat (DĐVN V), Xenetic® 300 (Guerbet – Pháp), bari sulfat (DĐVN V), magnesi stearat (DĐVN V), talc (TCCS), magnesi stearat (TCCS), Aerosil (TCCS)

Thiết bị: Thiết bị bao bột khô (cải tiến từ thiết bị bao truyền thống ERWEKA)

Thiết bị phân tích lưu biến Anton Par MCR 302

Phương pháp bào chế viên berberin 100 mg:

Thành phần 1 viên: Berberin hydroclorid (100 mg), Avicel (33 mg), Erapac (33 mg), natri croscarmelose (10 mg) Nhào ẩm với dung dịch PVP 10 % trong ethanol rồi

Nghiên cứu Dược & Thông tin thuốc, 2021, Tập 12, Số 2, trang 2-8

2

xát hạt qua rây 1000 Sấy ở 60 oC tới hàm ẩm 9 %, sửa hạt qua rây 350 và 800 rồi trộn với tá dược trơn (cứ 100 mg berberin trộn với 3 mg talc, 1 mg Aerosil, 1 mg magnesi stearat) và dập viên có đường kính 10 mm, độ cứng 8 – 10 kp

Phương pháp bào chế viên berberin 100 mg chứa chất cản quang: Trộn bột

kép theo tỉ lệ: 100 mg berberin, 50 mg barisulfat, 33 mg Avicel, 33 mg Erapac, 10 mg natri croscarmelose Nhào ẩm với dung dịch chứa 10% PVP và 10 % Xenetic® 300 trong ethanol rồi xát hạt qua rây 1000 Sấy ở 60 oC tới hàm ẩm 9 %, sửa hạt qua rây

350 và 800 rồi trộn với tá dược trơn (cứ 100 mg berberin trộn với 3 mg talc, 1 mg

Aerosil, 1 mg magnesi stearat) và dập viên có đường kính 10 mm, độ cứng 8 – 10 kp

Phương pháp bao viên: Chuẩn bị bột bao (Pectin : talc tỉ lệ khối lượng 95 : 5

hoặc pectin : DCP tỉ lệ khác nhau) và dịch bao (Sorbitol : glycerin : nước tỉ lệ 20: 60 : 20) Cho khoảng 50 g viên nhân (khoảng 250 viên) vào nồi bao Điều chỉnh tốc độ nồi bao phù hợp Quá trình bao trải qua các bước: Phun dịch (15 giây) – ngừng phun dịch – phun bột (15 giây) – ngừng phun bột Quá trình sẽ lặp đi lặp lại cho đến khi viên đạt được khối lượng vỏ bao 200% so với khối lượng viên nhân Viên sau khi bao được ủ ở nhiệt độ 60 oC trong 12 giờ và bảo quản ở nhiệt độ phòng trong lọ nhựa, nắp kín

Phương pháp phân tích lưu biến học: Phân tán pectin hoặc hỗn hợp pectin –

calci hydrophosphat vào dung dịch đệm phosphat pH 6,8 ở tỉ lệ 10% Tiến hành phân tích đặc tính lưu biến trên thiết bị Anton Par, kiểu thiết bị plate – plate (đường kính đĩa 40mm, khoảng cách 2 đĩa từ 1 – 2 mm), chọn chức năng đo biến thiên tần số từ 0,1 – 100 rad/s Đặc tính lưu biến của mẫu được đánh giá qua sự thay đổi giá trị của

modul lưu trữ (storage modulus) – đặc trưng cho khả năng bền vững của cấu trúc mẫu

và modul hao tổn (loss modulus) – đặc trưng cho khả năng biến dạng của cấu trúc

mẫu

Phương pháp đánh giá giải phóng in vitro: Đánh giá liên tiếp qua các môi

trường: 900ml acid hydrocloric 0,1M trong 2 giờ, tiếp theo là 900 ml dung dịch đệm phosphat pH 6,8 trong 6 giờ tại nhiệt độ thử 37 oC , tốc độ khuấy 100 vòng/phút Định lượng dược chất giải phóng ra bằng phương pháp đo quang tại bước sóng 345 nm

Phương pháp đánh giá giải phóng in vivo: Được tiến hành dựa trên phương

pháp của tác giả Nguyễn Thạch Tùng [3] Cho người tình nguyện uống 1 viên nén bao chứa berberin 100 mg + chất cản quang Thời điểm uống là 2 tiếng trước khi ăn Sau

đó tiến hành chụp X-quang để theo dõi đường đi của thuốc trong đường tiêu hóa và đánh giá thời điểm + vị trí rã của viên Khoảng cách giữa các lần chụp là 1 giờ

Kết quả nghiên cứu

Phân tích lưu biến học

Tất cả các mẫu pectin : nước, pectin : calci hydrophosphat : nước đều được khảo sát khoảng tuyến tính nhớt để xác định thông số đo lưu biến phù hợp Kết quả khảo sát cho thấy khoảng tuyến tính nhớt của các mẫu đo đều nằm trong khoảng 0,1 – 10 % biên độ dao động tại tần số 10 rad/s Do đó, phép đo biến thiên tần số dao động sẽ được thực hiện ở biên độ dao động 1 % để đảm bảo ổn định mẫu đo Kết quả phân tích cho thấy:

Pectin khi phân tán ở tỉ lệ 10% trong nước có tính chất của 1 dung dịch kể cả ở

trạng thái nghỉ (modul hao tổn có giá trị cao hơn modul lưu trữ ở tất cả các giá trị tần

số biến dạng), khi phối hợp DCP với pectin, khoảng cách modul lưu trữ và modul hao tổn hẹp dần và giá trị của cả modul hao tổn và modul lưu trữ đều tăng dần cho thấy hệ

Hình 1 Kết quả phân tích lưu biến học đánh giá ảnh hưởng của tỉ lệ DCP kết hợp

đến đặc tính chuyển dạng rắn – lỏng của hệ pectin – nước

Ở tỉ lệ phối hợp là 0,04 % DCP, hệ có đặc tính của chất rắn khi ở trạng thái nghỉ (tần số biến dạng thấp <1 rad/s) và quay trở lại tính chất dung dịch nhớt khi tần số biến dạng > 1 rad/s Khi tăng tỉ lệ DCP phối hợp lên 0,5 %, hệ đã có tính chất của chất rắn nhiều hơn nên phải ở tần số biến dạng > 10% mới chuyển sang trạng thái dung

dịch nhớt Ở các tỉ lệ 1 và 2 % DCP, modul lưu trữ luôn cao hơn modul hao tổn ở tất

cả các tần số biến dạng chứng tỏ hệ ở trạng thái rắn hoàn toàn Như vậy, khi phối hợp pectin với DCP, sẽ thay đổi đặc tính của hệ petin – nước từ thuộc tính chất lỏng sang thuộc tính chất rắn do đó sẽ làm tăng độ ổn định vật lý của hệ hơn Cơ chế của sự chuyển dạng này có lẽ là do DCP khi gặp nước đã điện ly 1 phần tạo ra Ca2+ kết hợp với các nhóm -COO- trên mạch pectin tạo ra calci pectinat là chất không tan do đó

thay đổi đặc tính lưu biến của hệ

Kết quả thử giải phóng in vitro

Kết quả thử giải phóng ở hình 2 cho thấy kết hợp DCP và pectin, sẽ kéo dài thời

gian tiềm tàng (T lag) cho viên bao so với chỉ sử dụng pectin làm vỏ bao Ở các tỉ lệ

DCP là 1 %, 1,5 %, 2 % đều cho T lag đảm bảo đưa được thuốc đến đại tràng (> 5 giờ)

Tỉ lệ DCP càng cao thì T lag càng kéo dài, tuy nhiên khi lượng DCP vượt quá 1,8 % thì

T lag có xu hướng giảm Không những vậy, tại tỉ lệ 2,2 % viên lại giải phóng dược chất

nhanh hơn cả so với không dùng DCP ở vỏ bao (T lag = 3 giờ) Các tỉ lệ DCP từ 1 – 2

% đều giúp tạo ra T lag từ 5-8 giờ rất thích hợp cho viên giải phóng tại đại tràng Như

vậy, việc phối hợp DCP vào vỏ bao để kéo dài T lag chỉ có hiệu quả ở tỉ lệ thấp của

DCP (1-2 %) Kết quả kéo dài T lag nhờ kết hợp DCP với pectin trong công thức vỏ bao phù hợp với dự đoán ở nghiên cứu tính chất lưu biến của hệ pectin – nước

Nghiên cứu Dược & Thông tin thuốc, 2021, Tập 12, Số 2, trang 2-8

4

Hình 2 Khả năng giải phóng của viên

BBR bao với bột bao là hỗn hợp pectin :

DCP

Hình 3 Đồ thị giải phóng của viên nhân BBR

trong môi trường pH 6,8

Hình 4 Mô hình các lớp trạng thái tồn tại

khác nhau của hệ pectin – nước tạo ra trong

quá trình viên berberin bao tiếp xúc với môi

trường hòa tan

Hình 5 Ảnh hưởng của calci đến độ bền của hệ gel pectin – nước [4]

Kết hợp giữa kết quả phân tích lưu biến và thử hòa tan in vitro, có thể đưa ra giả

thiết: Viên nén bao berberin có vỏ bao là pectin ở trạng thái rắn (100 % pectin), khi tiếp xúc môi trường hòa tan, nước sẽ liên tục thấm vào khiến nồng độ pectin ở lớp ngoài cùng sẽ giảm dần từ 100 % (vỏ bao nguyên vẹn) đến 0 % khi vỏ bao đã bị hòa

tan hoàn toàn (Hình 4) Tốc độ hòa tan vỏ bao bị ảnh hưởng bởi độ bền của hệ pectin

nước tạo ra, nếu hệ pectin – nước có tính chất của chất lỏng đặc trưng bởi khả năng dễ dịch chuyển, biến dạng, hệ sẽ nhanh chóng bị bào mòn Ngược lại, nếu hệ pectin – nước mang đặc tính của chất rắn, với khả năng duy trì trạng thái ổn định lâu, khó bị

biến dạng hay dịch chuyển, hệ sẽ tồn tại lâu hơn, nhờ đó kéo dài T lag cho viên hơn Trong quá trình thử hòa tan, nồng độ của pectin ở lớp ngoài cùng sẽ giảm dần Các phân tích lưu biến học cho thấy, khi nồng độ pectin giảm còn 10 % thì hệ đã có tính chất của 1 dung dịch nhớt và do đó dễ dàng bị bào mòn do chuyển động của viên cũng như của môi trường hòa tan Khi kết hợp với DCP ở tỉ lệ >1 % thì hệ vẫn duy trì trạng thái gel (elastic) ngay cả khi nồng độ pectin trong hệ pectin - nước giảm xuống 10 %, nhờ đó làm chậm quá trình thấm sâu tiếp theo của nước và do đó làm chậm quá trình

hình thành các tủa calci pectinat ngay trong gel hiện tượng này đã được mô tả trong

các thử nghiệm của Wanasawas (Hình 5) [4]

Kết quả đánh giá in vivo

Trước khi đánh giá độ rã in vivo với viên nén berberin có phối hợp thêm chất cản

quang, cần đánh giá xem chất cản quang có làm thay đổi giải phóng dược chất từ viên không Quá trình thẩm định phương pháp định lượng đã cho thấy chất cản quang sử

dụng trong viên không ảnh hưởng tới kết quả phân tích Hình 3 cho thấy không có sự

khác biệt về khả năng giải phóng dược chất in vitro từ viên nén berberin có sử dụng

chất cản quang và không sử dụng chất cản quang (f2 = 81 và quá trình thẩm định phương pháp định lượng đã chứng minh chất cản quang không ảnh hưởng tới kết quả định lượng)

Viên nhân BBR rã hoàn toàn sau khi uống từ 15 – 30 phút (Hình 6) Quá trình rã

được quan sát khá rõ với hình ảnh vệt chất cản quang được giải phóng ra trong quá

trình viên thuốc di chuyển xuống phía dưới đường tiêu hóa Thời gian rã in vivo khá

phù hợp với kết quả thu được khi thử giải phóng in vitro ở hình 3 Như vậy, việc thêm

chất cản quang không ảnh hưởng tới quá trình giải phóng dược chất của viên

Hình 6, Ảnh X-quang quá trình rã của viên nhân trong đường tiêu hóa người tình nguyện

(A Thời điểm vừa uống thuốc: Viên ở đầu tá

tràng; B Sau khi uống 15 phút, Viên bắt đầu rã

đồng thời di chuyển xuống dưới ruột non tạo ra

vết giải phóng chất cản quang; C Sau 30 phút,

viên đã rã hoàn toàn, chỉ còn quan sát vệt mờ chất cản quang)

Các kết quả đánh giá khả năng giải phóng in vivo của viên nén berberin bao giải

phóng tại đại tràng được tổng hợp ở bảng 1 và hình 7 Nhìn chung, ở cả 2 tỉ lệ pectin :

DCP khảo sát đều đảm bảo đưa được thuốc tới đại tràng với tỉ lệ 1,5 % DCP sẽ giúp viên bao rã ở ½ cuối của đại tràng trong khi với tỉ lệ 1,0 % DCP sẽ giúp viên rã ở đoạn

Nghiên cứu Dược & Thông tin thuốc, 2021, Tập 12, Số 2, trang 2-8

Bảng 1 Kết quả đánh giá khả năng giải phóng thuốc in vivo của viên nén BBR bao

với hỗn hợp pectin và DCP ở các tỉ lệ DCP khác nhau

Người

tình

nguyện

Thời điểm rã (giờ) Vị trí viên rã

Thời gian đến đại tràng (giờ)

Tỉ lệ 1,0 % Tỉ lệ 1,5 % Tỉ lệ

1,0 % Tỉ lệ 1,5 %

Tỉ lệ 1,0 %

Tỉ lệ 1,5 %

lệ 100 : 1) (A - Sau 11 giờ, viên tới đại tràng lên B - Viên bắt đầu rã sau 12 giờ C - Sau 12 giờ 30 phút, viên rã gần hết D - Sau 13 giờ viên rã hoàn toàn)

Bàn luận

Các nghiên cứu trước đây đã xác định được thành phần dịch bao cho viên nén berberin giải phóng tại đại tràng bào chế bằng kỹ thuật bao bồi Tuy nhiên, viên berberin bao vẫn chưa đạt được thời gian tiềm tàng phù hợp cho hệ giải phóng thuốc tại đại tràng [1], [2] Nguyên nhân là do quá trình bao vẫn chỉ sử dụng 100 % pectin

dụng thành công trên viên nén metronidazol giải phóng tại đại tràng với cùng phương pháp bào chế [3] Tuy nhiên, tỉ lệ HPMC sử dụng khá cao (50 % so với pectin) ảnh hưởng đáng kể tới khả năng kiểm soát giải phóng nhờ vi sinh vật của pectin Để giải quyết vấn đề khó khăn này, nghiên cứu đã tiến hành cải thiện đặc tính lưu biến của pectin để tăng độ bền của vỏ bao và đã thành công trong việc kéo dài Tlag lên 6 giờ

trong thử nghiệm in vitro cũng như đưa được thuốc tới đại tràng trong thử nghiệm in

vivo Trong bào chế các hệ mang thuốc, polyme kiểm soát giải phóng là nhóm tá dược

rất hay được sử dụng Phần lớn các nghiên cứu tại Việt Nam về hệ mang thuốc đều sử dụng phân tích nhiệt để đánh giá tính chất của polyme nhằm lựa chọn công thức phù hợp nhưng lại ít lưu tâm tới tính chất lưu biến Tính chất lưu biến của polyme không chỉ ảnh hưởng tới độ bền vật lý mà còn ảnh hưởng tới tốc độ di chuyển của phân tử thuốc trong hệ gel tạo ra bởi tương tác giữa polyme – nước do đó chắc chắn sẽ có ảnh hưởng tới khả năng giải phóng dược chất khỏi hệ Do đó, xác định tính chất lưu biến của tá dược là một thao tác quan trọng cần được bổ sung để xác định thành phần công thức tối ưu của hệ mang thuốc cũng như để hiểu rõ hơn về cơ chế kiểm soát giải phóng

Phương pháp đánh giá độ rã in vivo sử dụng trong nghiên cứu mới chỉ xác định

được đường di chuyển và thời gian tiềm tàng một cách tương đối Để có thể chứng

minh thuyết phục hơn cần, tiến hành đánh giá khả năng giải phóng in vivo.Tuy nhiên,

đây lại là các thử nghiệm rất phức tạp và tốn kém Với điều kiện nghiên cứu có hạn thì

đánh giá độ rã in vivo đơn giản và ít tốn kém hơn cũng là lựa chọn phù hợp bởi các kết

quả thu được cũng giúp cung cấp cái nhìn trực diện về quá trình kiểm soát giải phóng của dạng thuốc, giúp người nghiên cứu sàng lọc nhanh để lựa chọn công thức phù hợp cho các nghiên cứu tiếp theo

Kết luận

Bằng các kết quả phân tích lưu biến và thử giải phóng in vitro, nghiên cứu đã lựa

chọn được hỗn hợp pectin : calci phosphat theo tỉ lệ 99 : 1 (khối lượng/khối lượng)

làm vỏ bao cho viên nén berberin giải phóng tại đại tràng Kết quả thử giải phóng in

vivo cho thấy viên sau khi bao đã đưa thuốc tới đúng đại tràng và giải phóng hoàn

toàn thuốc tại đó

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Nguyễn Văn Lâm, Bùi Thị Oanh, Nguyễn Thạch Tùng, et al (2018), "Nghiên

cứu ảnh hưởng của thành phần dịch bao tới khả năng giải phóng dược chất của

viên nén berberin giải phóng tại đại tràng bào chế bằng kỹ thuật bao bồi", Tạp

chí Nghiên cứu dược và thông tin thuốc, 9(4), tr 2-8

2 Nguyễn Văn Lâm, Nguyễn Hồng Thúy, Nguyễn Thạch Tùng, et al (2016),

"Lựa chọn chất hóa dẻo cho lớp bao bồi viên berberin giải phóng tại đại tràng

bằng kỹ thuật quét nhiệt vi sai điều biến nhiệt", Tạp chí Nghiên cứu dược và

thông tin thuốc, 4+5, tr 15-18

3 Tung N.-T., Pham T.-M.-H., Nguyen T.-H., et al (2016), "Pectin/HPMC dry

powder coating formulations for colon specific targeting tablets of

metronidazole", Journal of Drug Delivery Science and Technology, 33, pp

19-27

Nghiên cứu Dược & Thông tin thuốc, 2021, Tập 12, Số 2, trang 2-8

8

4 Wanasawas P., Sinchaipanid N., Fell J T., et al (2013), "Influence of pectin

and calcium pectinat films on in vitro drug release from coated theophylline

pellets", Journal of Drug Delivery Science and Technology, 23(5), pp 465-470

Bước đầu nghiên cứu bào chế miếng dán verapamil hydroclorid kết

dính niêm mạc miệng

Nguyễn Thị Thanh Duyên*, Phạm Văn Hùng, Chu Phương Hồng,

Trần Thị Hải Yến, Lê Ngọc Khánh, Đàm Thanh Xuân

Trường Đại học Dược Hà Nội

(Ngày gửi đăng: 12/1/2021 – Ngày duyệt đăng: 07/4/2021)

SUMMARY

The main objective of this study was to develop mucoadhesive bilayered buccal patches of verapamil hydrochloride by solvent evaporation technique The mucoadhesive bilayered buccal patches include a backing layer and a drug-loaded adhesive layer The backing layer was prepared using different types of ethyl cellulose (EC) and different ratios of diethyl phthalate (DEP) to EC While the drug-loaded adhesive layer was formulated using different types and concentrations of hydroxypropylmethylcellulose (HPMC), polyvinylpyrrolidone K30 (PVP K30), propylene glycol (PG) and polyethylene glycol 400 (PEG 400) All the prepared patches were evaluated for drug content, mucoadhesive ability, ex-vitro permeation and amount of verapamil diffusing through the backing layer The suitable verapamil buccal mucoadhesive patch formulation contained

a backing layer of EC N7, with DEP and EC (with the ratio of DEP to EC was 2:5); and a drug-loaded mucoadhesive layer of verapamil, with verapamil, HPMC E15, PG, PVP K30 in the ratio 1:1:0.3:0.25 This patch was well adhered to mucosa over the 6 hours study period and 93.21% of verapamil was released through mucosa after 6 hours and the ratio of verapamil diffused through backing layer was less than 3%

TỪ KHÓA: buccal mucoadhesive patch, hydroxypropylmethylcellulose, verapamil

hydrochloride

Đặt vấn đề

Hiện nay, đường uống vẫn là đường dùng thuốc phổ biến nhất, tuy nhiên lại gặp nhiều vấn đề về sinh khả dụng do tác động của nhiều yếu tố như: thức ăn, chuyển hóa bước đầu qua gan, các vấn đề về độ hòa tan Hệ kết dính niêm mạc miệng là hệ mang thuốc có khả năng bám vào khoang miệng nhờ đó có thể giải phóng thuốc vào khoang miệng hoặc đưa thuốc thấm qua niêm mạc miệng vào hệ tuần hoàn [7] Dó đó, khắc phục được một số nhược điểm của dạng thuốc đường uống

Verapamil là thuốc chẹn kênh calci, sử dụng phổ biến trong điều trị cao huyết áp, chống loạn nhịp nhanh Verapamil hydroclorid có độ tan tốt, tính thấm tốt; hấp thu trên 90 % khi uống Tuy nhiên, sinh khả dụng thấp (20 – 35 %) do chuyển hóa mạnh bước đầu qua gan [1] Để khắc phục nhược điểm này, hệ kết dính niêm mạc miệng đã và đang được nghiên cứu trên thế giới [8], [9]…, song ở Việt Nam còn ít Vì thế, chúng tôi tiến hành đề tài:

“Bước đầu nghiên cứu bào chế miếng dán verapamil hydroclorid kết dính niêm mạc

miệng” với mục tiêu bào chế được miếng dính niêm mạc miệng verapamil gồm hai lớp

(lớp màng dính niêm mạc chứa dược chất và lớp màng nền) có thời gian bám dính phù hợp (trên 6 giờ), dược chất được giải phóng gần như hoàn toàn trong thời gian bám dính

Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu Dược & Thông tin thuốc, 2021, Tập 12, Số 2, trang 9-17

(Trung Quốc), diethyl phthalat (DEP), propylen glycol (PG) (Trung Quốc), ethanol 96 %, nước tinh khiết

Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp bào chế:

* Bào chế màng dược chất

Dung dịch polyme: Phân tán HPMC trong nước nóng (70 - 80 oC), khuấy từ 30 phút, siêu âm 60 phút, thu được dung dịch HPMC Chuẩn bị dung dịch chứa dược chất: hòa tan lần lượt dược chất và chất hóa dẻo (PG, PEG 400), PVP K30…, vào một lượng ethanol 96 %, siêu âm 15 phút, khuấy, thu được dung dịch dược chất Phối hợp dung dịch chứa dược chất vào dung dịch HPMC, khuấy từ 30 phút, siêu âm 45 phút, để qua đêm (khoảng 18 giờ) để loại bọt khí Đổ khuôn: với lượng verapamil là 10 mg/cm2 Bay hơi dung môi trong tủ sấy áp suất giảm ở áp suất, nhiệt độ thích hợp, đến khi hàm ẩm của màng đạt 3 – 6 % [8], [9]

* Bào chế lớp màng nền EC: Hòa tan EC trong ethanol 96 % để được dung dịch

EC 5 %, thêm DEP, khuấy từ 20 phút, siêu âm 45 phút, để qua đêm loại bỏ bọt khí, đổ khuôn 8x8 cm thu màng EC chứa 15 mg EC/cm2 Bay hơi dung môi trong tủ sấy áp suất giảm ở áp suất, nhiệt độ thích hợp, đến khi hàm ẩm của màng đạt 3 – 6 % [2], [8]

* Kết hợp 2 màng (tạo miếng dán 2 lớp): Phun dung dịch ethanol 96 % lên 2 lớp

màng rồi dán ngay 2 lớp màng lại với nhau, để ổn định bốc hơi dung môi ở nhiệt độ phòng thu được miếng dán 2 lớp [2]

Phương pháp đánh giá

* Hình thức: Đánh giá bằng cảm quan

* Khối lượng: Cân khối lượng của màng 2x2 cm trên cân phân tích, tiến hành với

10 màng sau đó tính khối lượng trung bình và độ lệch chuẩn

* Độ đồng đều hàm lượng: tiến hành định lượng hàm lượng dược chất trong màng như phần định lượng, thực hiện với 6 màng 2x2 cm, tính giá trị trung bình, độ lệch chuẩn (SD) và độ lệch chuẩn tương đối

* Độ bền gấp: Được xác định bằng cách gấp nhiều lần tại 1 vị trí một góc 270o của màng (màng dính 2x2 cm2), số lần gấp cho tới khi màng bị rách thành 2 phần Tiến hành 3 lần sau đó tính giá trị trung bình và độ lệch chuẩn [2], [9]

* pH của màng: Đặt 1 màng VRM 2x2 cm lên đĩa petri, thêm 5ml nước cất lên bề mặt để trương nở trong 1 giờ Đổ dung dịch vào ống nghiệm và đo pH bằng máy đo pH Tiến hành 3 lần sau đó tính giá trị trung bình [6]

* Độ dày màng: Tiến hành đo độ dày màng VRM 2x2 cm được đo ở 5 vị trí (vị trí

trung tâm và 4 vị trí góc) Màng được cắt ngang thành lớp mỏng khoảng 1 mm bằng dao lam rồi cho lên phiến kính sao cho mặt cắt nằm ngang rồi đo độ dầy bằng kính hiển vi gắn camera Nikon Eclipse Ci-L Tính độ dầy trung bình và độ lệch chuẩn [9]

* Định lượng dược chất trong lớp màng dược chất: Sử dụng phương pháp đo VIS tại bước sóng λmax= 278 nm [8]

UV-Mẫu thử: Cắt nhỏ màng 2x2 cm cho vào bình định mức 100 ml, thêm khoảng 70

ml dung dịch đệm phosphat pH 6,8, siêu âm 30 phút để hòa tan dược chất từ màng, để yên

6 giờ Bổ sung đệm vừa đủ 100 ml, lắc đều lọc, loại 20 ml dịch lọc đầu Hút 5,0 ml dịch lọc vào bình định mức 50 ml, thêm đệm vừa đủ

Mẫu chuẩn: Cân chính xác khối lượng dược chất chuẩn tương đương lượng dược chất trong một màng 2x2 cm (mc), pha tương tự mẫu thử Mẫu trắng là dung dịch đệm tương ứng Đo độ hấp thụ tử ngoại của các mẫu thử và mẫu chuẩn tại bước sóng 278 nm

Từ đó, tính được lượng dược chất thực tế có trong màng dưới dạng % so với lý thuyết, hoặc mg/cm2

* Khả năng bám dính: Xác định thời gian bám dính ex-vitro trên niêm mạc ruột

lợn

Cách tiến hành: niêm mạc ruột lợn (sử dụng trước 6 giờ sau khi mổ), rửa với nước cất và tráng bằng dung dịch đệm phosphat pH 6,8, sau đó cắt thành miếng kích thước 3x6cm Sử dụng máy thử độ rã cải tiến, môi trường thử là 800 ml đệm phosphat pH 6,8 ở

37 ± 1 ℃ Cố định niêm mạc ruột lợn kích thước 3x6 cm lên phiến kính bằng keo dán cyanoacrylat Màng Verapamil 2x2 cm2 được nhúng vào nước 1 giây và dán miếng dán theo chiều lớp cốt dính chứa dược chất lên niêm mạc ruột Tiến hành thử: thiết bị di chuyển thẳng đứng sao cho ở vị trí thấp nhất màng thử chìm hoàn toàn trong dung dịch đệm và ở vị trí cao nhất thì màng thử không ở trong dung dịch Thời gian bám dính (TGBD) được xác định từ khi bắt đầu thử đến khi màng bong ra khỏi vị trí dán [5]

* Khả năng giải phóng dược chất qua màng bằng bình Franz với màng khuếch tán

là niêm mạc má lợn Màng niêm mạc má lợn được tách bằng kéo tỉa và dao lam bỏ hết phần mô mỡ liên kết đến độ dày khoảng 500 µm, (màng phải đảm bảo được tính nguyên vẹn và quản bằng đệm pH 6,8 ở nhiệt độ 4 – 8 ℃ nếu chưa sử dụng ngay) [4], [6], [8], [10]

Chuẩn bị miếng dán kết dính niêm mạc miệng: gồm 2 lớp (lớp cốt dính chứa dược chất

và lớp màng nền), hình tròn, đường kính 1,5 cm; màng thử giải phóng là màng niêm mạc

má lợn với diện tích khuếch tán là 1,767 cm2;

Điều kiện thử: môi trường khuếch tán: 7ml đệm pH 6,8 ở nhiệt độ 37 ± 0,5 ºC; tốc độ khuấy: 400 vòng/phút

Dán miếng dán kết dính niêm mạc miệng verapamil theo chiều lớp cốt dính chứa dược chất tiếp xúc trực tiếp với màng niêm mạc má lợn Tiến hành thử Lấy mẫu: tại các thời điểm 0,5; 1, 2, 3, 4, 5, 6 giờ (tương đương t = 1 ÷ 7) Bổ sung 1 ml môi trường hòa tan vào cốc thử và lấy ra 1 ml dịch trong cốc thử Pha loãng mẫu thử bằng đệm pH 6,8 và đo quang ở bước sóng 278 nm Mẫu chuẩn làm tương tự mẫu chuẩn ở phần định lượng Mẫu trắng là dung dịch đệm làm môi trường thử hòa tan Từ đó tính ra được lượng dược chất giải phóng qua màng ở từng thời điểm

* Đánh giá sự giải phóng ngược dược chất qua màng nền EC

Tiến hành tương tự như đánh giá giải phóng dược chất qua màng niêm mạc má lợn, thay đổi một số điều kiện thử [2]: 1/ Màng thử giải phóng dược chất: màng cellulose acetat (kích thước lỗ xốp 0,45 μm); 2/ Mẫu thử: đặt màng thử với màng nền EC hướng xuống dưới tiếp xúc với màng cellulose acetat

Kết quả và bàn luận

Khảo sát xây dựng mô hình miếng dán kết dính niêm mạc miệng

Để phù hợp với đặc điểm sử dụng của bệnh nhân, màng được bào chế với mục tiêu giải phóng trong 6 giờ với mô hình 2 lớp: lớp màng nền và lớp màng giả dược (placebo) - HPMC (dược chất được thay thế bằng lactose)

* Khảo sát công thức màng nền

Tiến hành bào chế màng nền với 2 loại EC là EC N7 và EC N20 ở điều kiện nhiệt độ bay hơi 45±1°C, áp suất 30-40 kPa [2] Kết quả cho thấy EC N7 cho màng phẳng, trong, không có bọt khí; còn EC N20 màng xuất hiện vân sóng, dày Do với cùng nồng độ, dung dịch của EC N20 có độ nhớt cao hơn, dễ bị co kéo trong quá trình bay hơi, tạo thành các đường vân sóng, đồng thời tạo thành màng dày hơn Vì vậy, EC N7 được chọn để tiếp tục khảo sát

Khảo sát tỷ lệ chất hóa dẻo DEP/EC sử dụng trong thành phần màng (15 %, 20 %,

30 %, 40 %, 50 %) Kết quả cho thấy tỷ lệ DEP/EC là 40 % cho màng nền có đặc tính đạt

Nghiên cứu Dược & Thông tin thuốc, 2021, Tập 12, Số 2, trang 9-17

ngâm trương nở trong dung dịch pH 6,8 có màu trắng đục, mềm không gây cảm giác cứng khi chạm vào sẽ làm hạn chế được cảm giác khó chịu của bệnh nhân khi dùng Từ các kết quả khảo sát đã lựa chọn được công thức màng nền (tương ứng 100 cm2) là: EC N7 1,5 g; DEP 0,6 g; EtOH 96 % 30 ml Kí hiệu là công thức B

* Khảo sát công thức màng placebo

Tiến hành khảo sát công thức màng dính placebo với 4 loại HPMC: E5, E15, K4M

và K15M Ngoài ra trong công thức màn nên còn bổ sung lactose (đóng vai trò chất giả dược) và PVP K30 điều chỉnh sự bám dính PG có tỷ lệ là 25 % so với polyme Bào chế màng với các điều kiện nhiệt độ bay hơi 45±1 °C, áp suất 40-50 kPa [2] Thành phần công thức khảo sát và đặc tính bám dính của màng, trình bày ở bảng 1

Bảng 1 Các công thức khảo sát màng placebo

Về loại HPMC: CT1, CT2, CT5, CT6 màng đều dễ tạo thành, màng phẳng, trong

suốt, mềm dẻo, không có bọt khí Thời gian bám dính lần lượt là 2,6 ± 0,4 giờ, 3,7 ± 0,3 giờ, 2,5 ± 0,6 giờ, 3,6 ± 0,5 giờ CT3 khả năng tạo màng khó, màng phẳng, mỏng, trong suốt, mềm dẻo, xuất hiện bọt khí, thời gian bám dính > 6 giờ CT4 khả năng tạo màng khó, màng có vân sóng trên bề mặt, trong suốt, mềm dẻo, nhiều bọt khí, thời gian bám

dính > 6 giờ

HPMC K4M và K15M (CT3, CT4) trương nở mạnh trong nước, dung dịch có độ nhớt cao hơn rất nhiều so với HPMC E5 và E15 (CT1, CT2, CT5, CT6) do đó gây co kéo tạo thành các đường gợn sóng, bọt khí, trong quá trình khuấy trộn khó loại bỏ 4 công thức CT1, CT2, CT5, CT6 có khả năng tạo màng dễ, màng phẳng, mềm dẻo, không có bọt khí TGBD giảm dần theo thứ tự loại HPMC: K15M > K4M > E15 > E5 TGBD của bốn màng CT1, CT2, CT5, CT6 chưa đạt 6 giờ, cần nghiên cứu thêm Tuy nhiên để quá trình bào chế màng dược chất – HPMC không gặp khó khăn, sử dụng polyme HPMC E5 và E15 để tiếp tục nghiên cứu

(CT1-CT6) không ảnh hưởng nhiều đến khả năng tạo màng và TGBD của màng Sử dụng lactose làm giả dược, khi bào chế màng chỉ có thể nhận định được bước đầu về sự thuận tiện trong bào chế, hình thức màng, thời gian bám dính, nhưng cần được kiểm chứng thực

tế trên dược chất verapamil hydroclorid về đặc tính chất lượng của màng

K30 sử dụng thì TGBD của màng tăng lên từ 1 giờ (công thức P1) đến hơn 6 giờ (công thức P3) Màng P4 rất dễ hút ẩm, dễ thay đổi chất lượng, khó thao tác trong quá trình khảo sát Có thể sử dụng PVP K30 trong khoảng 2,5-5 mg/cm2 (P2, P3) để tiếp tục khảo sát khi đưa vào màng dược chất

Khảo sát công thức màng chứa dược chất

Căn cứ vào kết quả nghiên cứu màng placebo, tiến hành khảo sát màng chứa dược chất như sau:

*Khảo sát ảnh hưởng của HPMC E5, HPMC E15 đến khả năng giải phóng VRM qua màng niêm mạc

Tiến hành bào chế với nhiệt độ bay hơi 45±1 ℃, áp suất 40 – 50 kPa

Công thức (CT) V1, V2, V5, V6, V7 cho màng phẳng, trong suốt, mềm dẻo, không

có bọt khí CT V3 cho màng phẳng, trong, màng hơi dày, độ bền kém, không có bọt khí

CT V4 bề mặt màng xuất hiện gợn sóng, màng dày, kém linh hoạt, độ bền kém, không có bọt khí CT V8, V9 bề mặt màng có gợn sóng, màng dày, kém linh hoạt, không có bọt khí Kết quả đo khả năng dược chất thấm qua màng được trình bày trong bảng 3

Bảng 3 Tỷ lệ dược chất thấm qua màng niêm mạc má lợn

với màng chứa HPMC E5, E15 (%) (n=3, TB ± SD)

Nhận xét: Khi tăng lượng HPMC giúp kéo dài khả năng giải phóng dược chất

Màng sử dụng HPMC E15 cho khả năng kiểm soát giải phóng dược chất tốt hơn màng sử dụng HPMC E5 Với CT V7 vừa cho màng có hình thức đẹp vừa có khả năng kéo dài giải phóng hơn 6 giờ (đạt 93,14 %) Khi tăng lượng HPMC, nồng độ dược chất trên đơn vị thể tích màng giảm nên chênh lệch nồng độ giữa màng dược chất và môi trường giảm, tốc độ khuếch tán và thấm dược chất từ màng niêm mạc sang môi trường giảm Độ dày của màng cũng tăng lên dẫn đến quãng đường khuếch tán của dược chất tăng, đồng thời tăng thời gian hòa tan, ăn mòn màng nên kéo dài thời gian giải phóng dược chất Vì vậy, CT V7 có thành phần HPMC E15, tỷ lệ HPMC/VRM: 1,0, lượng VRM: 1,0g được chọn để tiếp tục khảo sát

* Khảo sát ảnh hưởng của PVP K30 đến khả năng giải phóng dược chất qua màng niêm mạc

Chủ yếu PVP tham gia vào tạo cốt màng, bám dính màng, tác động đến tính thấm màng

Mục đích chính là đánh giá ảnh hưởng đến khả năng giải phóng dược chất qua màng niêm mạc má lợn Thiết kế công thức gồm V7 làm công thức cơ bản (0,25 g PVP/

100 cm2 màng), V7.1, V7.2 lần lượt thay đổi lượng PVP là 0,375 g và 0,500 g cho 100

cm2 màng, thành phần cố định gồm (cho 100 cm2 màng): VRM: 1,0g; HPMC E15: 1,0g; PG: 0,25 g dung môi H2O:EtOH(1:4): 50ml Bào chế màng, kết quả thử giải phóng dược chất qua màng Kết quả được trình bày trong bảng 4 và hình 1

Nghiên cứu Dược & Thông tin thuốc, 2021, Tập 12, Số 2, trang 9-17

Bảng 4 Tỷ lệ dược chất thấm qua màng niêm mạc má lợn khi thay đổi tỷ lệ PVP (%)

Hình 1 Đồ thị biểu diễn tỷ lệ DCTQ của các màng VRM với PVP K30

Nhận xét: CT V7, V7.1 cho màng phẳng, trong suốt, mềm dẻo, không có bọt khí,

riêng màng V7.2 dễ hút ẩm và chuyển màu trắng đục Kết quả thử giải phóng cho thấy: Khi tăng lượng PVP K30 thì mức độ thấm dược chất qua màng giảm; khi lượng PVP tăng lên 1,0 mg/cm2 thì tỷ lệ DCTQ giảm xuống còn 80,33 % (6h); khi lượng PVP là 0,25 mg/cm2 thì tỷ lệ DCTQ tại thời điểm 6 giờ khá cao (93,14 %) PVP K30 là một polyme, làm tăng chỉ số trương nở của màng dược chất VRM, làm giảm nồng độ dược chất trên một đơn vị thể tích, dẫn tới VRM mất nhiều thời gian để khuếch tán khỏi màng hơn, vì vậy làm kéo dài thời gian giải phóng dược chất V7 cho màng có đặc điểm hình thức đạt, TGBD đạt, khả năng kiểm soát giải phóng tốt nhất, tỷ lệ DCTQ tại 6 giờ cao (93,14 %) Chọn V7 để tiếp tục khảo sát

* Khảo sát ảnh hưởng của chất hóa dẻo (PG, PEG 400) đến khả năng giải phóng dược chất qua màng niêm mạc

Chất hóa dẻo, ngoài ảnh hưởng đến đặc tính của màng còn ảnh hưởng đến tính bám dính của màng, khả năng thấm dược chất qua màng sinh học Trong thực nghiệm, công thức được thiết kế gồm V7, V7.3, V7.4 (thay đổi tỷ lệ PG), V7.5-V7.7 (thay đổi tỷ lệ PEG) (bảng 5)

Bảng 5 Các công thức khảo sát màng VRM với PVP K30, PG, PEG 400 (tương

Tiến hành bào chế màng, kết quả thử giải phóng qua màng niêm mạc má lợn được trình bày ở bảng 6 và hình 2; 3

Bảng 6 Tỷ lệ dược chất thấm qua màng niêm mạc má lợn

khi thay đổi tỷ lệ PG và PEG 400 (%) (n=3, TB± SD)

Công

V7 32,81±1,99 47,36±1,01 65,23±1,27 73,22±1,51 82,39±2,36 89,48±1,82 93,14±1,29

Hình 2 Đồ thị biểu diễn tỷ lệ DCTQ của màng VRM với chất hóa dẻo PG

Hình 3 Đồ thị biểu diễn tỷ lệ DCTQ của các màng VRM với chất hóa dẻo PEG 400

giữa hai loại chất hóa dẻo; khi tăng lượng chất hóa dẻo dược chất giải phóng đều tăng nhẹ

PG và PEG 400 có nhiều nhóm hydroxyl (OH) những giờ đầu giúp tăng cường khả năng hydrat hóa của màng, tăng trương nở, làm tăng giải phóng dược chất; những giờ sau, khi màng đã trưởng nở đến một mức độ nhất định, quá trình giải phóng dược chất ổn định lại Màng V7.3 có hình thức đẹp, độ mềm dẻo linh hoạt tốt hơn màng V7, khả năng kiểm soát giải phóng dược chất tốt: tỷ lệ DCTQ tại các thời điểm đồng đều và tại thời điểm 6 giờ cao (trên 90 %)

Từ kết quả khảo sát đưa ra công thức bào chế màng kết dính niêm mạc miệng của

VRM như sau (Công thức tương ứng 100 cm 2 )

Nghiên cứu Dược & Thông tin thuốc, 2021, Tập 12, Số 2, trang 9-17

Kết quả đánh giá một số chỉ tiêu màng verapamil đã lựa chọn:

Hình thức: Phẳng, nhẵn, màng trong, mềm dẻo, không có bọt khí; Khối lượng

trung bình (n=10): 174,4 ± 3,2 mg; Độ đồng đều hàm lượng: TB: 98,8 % (đạt); RSD: ± 1,45 %; Độ dày: lớp màng dược chất: 166,07 ± 1,65 µm, màng hai lớp: 285,12 ± 7,88 µm;

pH bề mặt: 6,55; Độ bền gấp: > 300 lần; Thời gian bám dính: > 6 giờ Khả năng giải phóng dược chất qua màng khá đều sau từng khoảng thời gian và đạt 93,21 % sau 6h Các kết quả đều phù hợp với đặc điểm sử dụng của màng

Đánh giá khả năng giải phóng ngược dược chất qua màng nền EC

Thử tính thấm ngược dược chất qua màng nền EC Kết quả được trình bày ở bảng

Kết luận

Đã khảo sát và xây dựng được công thức bào chế màng kết dính niêm mạc miệng verapamil hydroclorid 40 mg với diện tích 2x2 cm2, gồm lớp màng nền: EC N7: 60,0 mg, DEP: 24,0 mg; lớp màng kết dính chứa dược chất: VRM: 40,0 mg, HPMC E15: 40,0 mg, PVP K30: 10,0 mg, PG: 12,0 mg Màng thu được có hình thức cảm quan, khả năng bám dính, các chỉ tiêu (pH bề mặt, độ dày, hàm lượng và đồng đều hàm lượng) đều đạt yêu cầu

và phù hợp với đặc điểm sử dụng màng, khả năng kiểm soát dược chất tốt (sau 6 giờ cho 93,21 % dược chất thấm qua niêm mạc), hạn chế được lượng dược chất thấm ngược màng

EC qua ra ngoài khoang miệng (<3 %)

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Bộ Y tế (2018), Dược thư quốc gia Việt Nam, Nhà xuất bản Y học, tr.1465-1467

2 Nguyễn Thị Thanh Duyên, Nguyễn Phúc Nghĩa và cộng sự (2019), “Bước đầu nghiên

cứu bào chế màng propranolol dính niêm mạc miệng”, Tạp chí dược học, 517(5), tr

26-31

3 Abruzzo Angela, Bigucci Federica, et al (2012), "Mucoadhesive chitosan/gelatin

films for buccal delivery of propranolol hydrochloride", Carbohydrate polymers,

87(1),pp 581-588

4 Kulkarni U., Mahalingam R., et al (2010), "Porcine buccal mucosa as in vitro model: effect of biological and experimental variables", J Pharm Sci, 99(3), pp 1265-77

5 Nafee N A et al (2004), "Mucoadhesive delivery systems I Evaluation of

mucoadhesive polymers for buccal tablet formulation", Drug development and

industrial pharmacy, 30 (9), pp 985-993

6 Patel V F., Liu F., et al (2012), "Modeling the oral cavity: in vitro and in vivo evaluations of buccal drug delivery systems", Journal Control of Release, 161(3), pp

746-56

7 Rajeshwari G Annigeri Manisha Jadhav (2014), "Mucoadhesive patch: a novel drug

delivery.", Research and reviews: journal of pharmacy and Pharmaceutical sciences,

9 Subhash Chandra Bose Penjuri Saritha Damineni, Nagaraju Ravouru (2013),

"Formulation and evaluation of verapamil hydrochloride transmucosal drug delivery

system", Thai Journal of Pharmaceutical Sciences, 37 pp 25-38

10 Upendra Kulkarni, Ravichandran Mahalingam, S Indiran Pather, Xiaoling Li, Bhaskara Jasti (2008), “Porcine Buccal Mucosa as an In Vitro Model: Relative Contribution of Epithelium and Connective Tissue as Permeability Barriers”,

Pharmaceutics, Preformulation And Drug Delivery, pp.471-483

Nghiên cứu Dược & Thông tin thuốc, 2021, Tập 12, Số 2, trang 18-24

Xây dựng phương pháp HPTLC xác định một số thuốc kháng histamin H1

trộn trái phép trong chế phẩm đông dược

Nguyễn Thị Kiều Anh*,Trần Thị Lan, Đặng Thị Ngọc Lan, Ngô Minh Thúy

Trường Đại học Dược Hà Nội

*Tác giả liên hệ: anhntk@hup.edu.vn

(Ngày gửi đăng: 22/02/2021 – Ngày duyệt đăng: 07/4/2021)

SUMMARY

The use of herbal remedies and dietary supplements for treatment of rashes, allergies, colds, flu symptom has greatly increased However, some herbal products advertised as “all natural” have been found to be adulterated with synthetic H1 antihistamine The objective of this study was to develop rapid, selective and suitably sensitive high performance thin layer chromatography method to quantify amount of cinnarizine, chlorpheniramine maleate, cyproheptadine hydrocloride, loratadine, promethazine hydrocloride in real samples Analytical conditions are: Adsorbent of HPTLC Silicagel 60 GF254; application volume of 5 µL; developing solvent system of cyclohexane: acetone: triethylamine (8: 2: 0.5 v/v/v) and detection of UV light 254 nm This method was validated in terms of selectivity, linearity, accuracy and precision in accordance with AOAC, ICH guidelines The HPTLC method was successfully applied to the analysis of 18 commercially available products in Vietnamese market 5 samples were found positive with one target substance

Key words: HPTLC, determine, H1 antihistamine drugs, illegal, herbal products

Đặt vấn đề

Sử dụng thảo dược để điều trị mẩn ngứa, dị ứng đã được dùng phổ biến theo kinh nghiệm dân gian Song song với việc dùng thảo dược dạng thô, thì các chế phẩm đông dược với các dạng bào chế khác nhau đã được thương mại hóa nhằm tiện lợi cho người sử dụng Tuy nhiên, vì lợi nhuận, một số người sản xuất trộn thêm thuốc hóa dược vào chế phẩm đông dược để nhanh đạt được hiệu quả mong muốn do đó bán được số lượng nhiều Một số sản phẩm thảo dược được quảng cáo là “hoàn toàn tự nhiên” đã bị phát hiện có pha trộn với thuốc kháng histamin H1 tổng hợp [1], [2], [4], [7] Tình trạng này là mối quan tâm không những của các cơ quan quản lý mà còn của cộng đồng khi có nhiều báo cáo về các rủi ro ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe người dùng

Quy trình phân tích các thành phần của chế phẩm đông dược rất phức tạp

nhóm kháng histamin H1 trộn trái phép trong chế phẩm đông dược là MS/MS [2], [7], UHPLC-Q/TOF-MS [6], GC-MS [8], CE – MS [5], HPLC-PDA [1] Các phương pháp này có độ đặc hiệu, độ nhạy cao nhưng thiết bị đắt tiền, vận hành phức tạp Do đó, nghiên cứu này được thực hiện với mục tiêu xây dựng được phương pháp đơn giản, nhanh, đảm bảo tính đặc hiệu để định tính, định lượng đồng thời 5 thuốc kháng histamin H1 phổ biến trộn trái phép trong chế phẩm đông dược dạng rắn bằng HPTLC và ứng dụng phát hiện các dược chất này trong chế phẩm đông dược đang lưu hành trên thị trường

LC-Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu

Nguyên liệu

Chất chuẩn: Cyproheptadin hydroclorid (CYP) 100,64 %, độ ẩm 7,6 %,

SKS 0102126; clorpheniramin maleat (CLO) 99,75 %, SKS QT021070215;

thuốc Trung ương; cinnarizin (CIN) 99,7 %, SKS: QT082060916 (Viện Kiểm nghiệm thuốc TP Hồ Chí Minh)

Mẫu nền (mẫu placebo): Mẫu nền gồm 3 dạng bào chế là viên hoàn (N1)

dựa trên bài thuốc Ngân kiều tán (9 vị dược liệu); cốm (N2) dựa trên bài thuốc Liên kiều bại độc tán (14 vị dược liệu) và nền viên nang (N3) dựa trên bài thuốc Tiêu phong tán gia giảm (11 vị dược liệu) Các thành phần được bào chế thành cao hoặc làm thành bột, bổ sung thêm tá dược và bào chế thành mẫu placebo dùng trong nghiên cứu

Mẫu thử: 18 mẫu chế phẩm đông dược, thực phẩm bảo vệ sức khỏe dạng

viên nang cứng, viên hoàn cứng và bột điều trị hoặc hỗ trợ điều trị mề đay mẩn ngứa, dị ứng đang lưu hành tại Việt Nam, trong đó 2 chế phẩm được mua qua mạng internet; 6 chế phẩm được mua tại các nhà thuốc đông y; 10 chế phẩm còn lại do người sử dụng nghi ngờ gửi đến kiểm tra

Dung môi, hóa chất: Đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích

Thiết bị: Hệ thống sắc kí lớp mỏng hiệu năng cao HPTLC CAMAG, CAT No

027.6200 (Thụy Sỹ): bộ phận chấm bán tự động, bộ phận khai triển tự động, máy chụp ảnh, phần mềm điều khiển winCATS và phần mềm videoScan của CAMAG Bản mỏng HPTLC silicagel 60 F254 của Merck (Đức)

Phương pháp nghiên cứu

Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký: Phương pháp HPTLC gồm pha tĩnh

HPTLC silica gel 60 F254; phát hiện dưới đèn UV 254 nm và quét phổ vết tương ứng của chất phân tích trên máy scanner để định tính và lựa chọn bước sóng định lượng; thể tích phun mẫu 5µl, thời gian bão hòa dung môi 20 phút, thời gian sấy bản mỏng sau triển khai là 20 phút ở 100 oC Khảo sát bằng thực nghiệm các hệ dung môi pha động, lựa chọn dung môi khai triển tách được các chất phân tích cho kết quả vết gọn

Xử lý mẫu: Sử dụng điều kiện xử lý mẫu trong tài liệu [1] có thay đổi, cụ thể

là mẫu thử được nghiền mịn, làm đồng nhất, cân chính xác một lượng bột mẫu thử (hoặc mẫu nền) khoảng ½ liều dùng vào ống ly tâm Thêm chính xác 25 ml methanol Lắc xoáy 5 phút, siêu âm 10 phút ở nhiệt độ phòng, ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút Lấy chính xác 2 ml dịch trong phía trên, cô dưới luồng khí nitrogen tới cắn Hòa tan cắn trong 1,00 mL methanol và lọc qua màng lỗ lọc 0,45 µm

Thẩm định phương pháp: Theo hướng dẫn của AOAC [3] với các tiêu chí

gồm độ đặc hiệu, độ phù hợp của hệ thống, độ chọn lọc, khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), độ lặp lại, độ đúng

Ứng dụng: Mẫu thử là các chế phẩm đông dược được xử lý và phân

tích theo phương pháp đã xây dựng Tính kết quả dựa vào đường chuẩn xây dựng trong cùng ngày phân tích với r 0,995

Kết quả nghiên cứu

Khảo sát và lựa chọn điều kiện phân tích

Khảo sát điều kiện sắc ký

Thực hiện khảo sát trên bản mỏng silicagel 60 F254 với các hệ dung môi

Nghiên cứu Dược & Thông tin thuốc, 2021, Tập 12, Số 2, trang 18-24

methanol: amoniac ( 8:2:0,8), thể tích mẫu thử 5 µm, phát hiện tại UV 254 nm

Kết quả cho thấy hệ 2 cho vết của các chất nghiên cứu gọn và tách nhau rõ ràng

Tuy nhiên, các vết còn khá gần nhau, do đó cần tiếp tục điều chỉnh tỷ lệ dung môi Kết quả ở hình 1 phân tích với hệ pha động cyclohexan: aceton: triethylamin (8: 2: 0,5 tt/tt/tt) cho phép tách tốt các chất nghiên cứu với Rf của CLO, LOR, PRO, CYP, CIN lần lượt là 0,27; 0,35; 0,46; 0,56 và 0,74

Khảo sát bước sóng phát hiện

Tiến hành quét phổ UV từ bước sóng 200 nm đến 400 nm tại vị trí vết của

5 chất phân tích trong sắc ký đồ của chuẩn đơn và chuẩn hỗn hợp và được minh họa ở hình 2 đối với PRO Kết quả CIN có cực đại hấp thụ ở 254 nm; CLO là

224 và 250 nm; CYP là 226, 253 và 287 nm; LOR là 254 nm; PRO là 254 nm và

305 nm Do đó, lựa chọn bước sóng 254 nm để phát hiện cả 5 chất phân tích

Từ các kết quả khảo sát, điều kiện HPTLC được lựa chọn là: Bản mỏng HPTLC Silicagel 60 GF254; hệ dung môi khai triển gồm cyclohexan: aceton: triethylamin (8: 2: 0,5 tt/tt/tt); thể tích chấm mẫu là 5 µL; phát hiện ở bước sóng

254 nm

Thẩm định phương pháp phân tích

Tính chọn lọc: Phân tích đồng thời 3 mẫu gồm hỗn hợp chuẩn CLO,

LOR, PRO, CYP, CIN nồng độ mỗi chất 0,1 mg/ml, mẫu placebo và mẫu placebo thêm chuẩn hỗn hợp cùng nồng độ 0,1 mg/ml trên hệ thống HPTLC Kết quả cho thấy trên sắc ký đồ của cả 3 mẫu nền thêm chuẩn xuất hiện pic có

Rf tương đương với vết thu được trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn, còn trên sắc ký

đồ của mẫu placebo không xuất hiện pic tương ứng về vị trí với vết của các chất phân tích Do đó, phương pháp có tính chọn lọc đảm bảo Kết quả được minh họa ở hình 1 đối với nền N3

Hỗn hợp chuẩn Mẫu nền (N3) Mẫu nền thêm chuẩn

Hình 1 Sắc ký đồ đánh giá độ chọn lọc của phương pháp

Độ thích hợp hệ thống: Phân tích lặp lại 6 lần dung dịch hỗn hợp chuẩn

CLO, LOR, PRO, CYP, CIN tại nồng độ 0,1 mg/ml trên hệ thống HPTLC với các điều kiện đã lựa chọn Từ đó, tính độ lặp lại (RSD) về diện tích pic (S pic) của từng chất Kết quả RSD đối với CLO, LOR, PRO, CYP và CIN lần lượt là 0,79 %; 0,77 %; 1,34 %; 1,81 % và 1,77 % (<2,0 %)

Xây dựng đường chuẩn: Xây dựng đường chuẩn đối với mỗi chất trong

khoảng 25 – 250 µg/ml pha trong methanol và tiến hành sắc ký Xây dựng đường chuẩn biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ chất phân tích với diện tích pic tương ứng được phương trình hồi qui và tính hệ số tương quan đối với mỗi chất Kết quả được trình bày ở bảng 1

các dung dịch có nồng độ mỗi chất là 1; 2; 4; 6; 8 và 10 µg/mL Tiến hành sắc

ký, phát hiện và xử lý hình ảnh sắc ký đồ bằng phần mềm videoscan LOD là nồng độ thấp nhất có S/N khoảng 3 (tín hiệu đáp ứng của pic gấp khoảng 3 lần đường nhiễu nền), LOQ là nồng độ có S/N khoảng 10 Kết quả được trình bày ở bảng 1

Bảng 1 Kết quả đánh giá độ tuyến tính và LOD, LOQ của phương pháp

LOD ( µg/mL)

LOQ

( µg/mL)CIN 25 - 250 y = 106,0 x + 4441 0,999 2a,c ; 3b 6a,c ; 10bCLO 25 - 250 y = 82,54 x + 1100 0,995 2a,c ; 3b 6a,c ; 10b

CYP 25 - 250 y = 100,2 x + 4010 0,998 2a,c ; 3b 6a,c ; 10bLOR 25 - 250 y = 100,7 x + 4445 0,998 2a,c ; 3b 6a,c ; 10b

PRO 25 - 250 y = 121,3 x + 5740 0,998 2a,c ; 3b 6a,c ; 10b

a : Nền N1; b : Nền N2; c : Nền N3

Độ đúng và độ chính xác: Độ đúng và độ chính xác trong ngày được xác

định bằng cách thêm chính xác chuẩn hỗn hợp vào chính xác khoảng 2,50 g nền mẫu N1; 0,70 g nền mẫu N2 và 1,60 g nền mẫu N3 để sau khi xử lý mẫu được các dung dịch có nồng độ mỗi chất lần lượt là 25 µg/mL; 100 µg/mL và 200 µg/mL tương ứng các mức nồng độ định lượng thấp, trung bình, cao Mỗi mức nồng độ tiến hành lặp lại 6 lần Độ đúng và độ chính xác khác ngày được tiến hành tương tự nhưng vào ngày phân tích khác Phân tích bằng sắc ký Lượng chất tìm lại tính theo đường chuẩn xây dựng trong cùng ngày phân tích Đánh giá kết quả dựa trên số liệu của 2 ngày phân tích Kết quả được trình bày trong bảng 2

Bảng 2 Kết quả đánh giá độ đúng và độ chính xác của phương pháp

RSD (%) (n=12)

Độ thu hồi

(%)

RSD (%)

Độ thu hồi (%)

RSD (%)

CIN 90,9-98,4 1,2-4,3 91,6-97,6 1,2-4,2 94,8-100,5 1,7-4,0 CLO 95,1-102,8 1,5-4,8 95,3-102,6 1,4-3,2 95,9-99,4 1,8-4,3 CYP 93,8-103,1 1,1-4,6 95,8-103,2 1,1-4,6 94,1-100,8 1,3-4,0 LOR 92,7-103,7 1,0-4,0 92,9-101,4 1,1-4,5 96,5-99,7 1,6-4,3 PRO 92,8-99,2 1,0-3,6 90,6-97,9 1,6-4,2 95,8-100,4 2,2-4,6 Kết quả ở bảng 2 cho thấy trên cả 3 nền N1, N2, N3, phương pháp có độ đúng khá cao trong khoảng từ 90,6 % -103,7 % và RSD 1,0% - 4,8% đạt theo yêu cầu của AOAC 2016 ( tỷ lệ thu hồi 80 – 110 % và độ lặp lại RSD < 7,3 % ở mức nồng độ < 100 ppm; tỷ lệ thu hồi 90 -107 %, RSD < 5,3 % ở mức nồng độ

100 ppm - 0,1 %)

Ứng dụng

Áp dụng phương pháp đã xây dựng phân tích trên 18 mẫu chế phẩm đông dược, thực phẩm bảo vệ sức khỏe điều trị hoặc hỗ trợ điều trị mề đay mẩn

Nghiên cứu Dược & Thông tin thuốc, 2021, Tập 12, Số 2, trang 18-24

mẫu dương tính với 1 trong 5 chất nghiên cứu Cụ thể là, có 3 mẫu người sử dụng mua đặt hàng qua internet gửi phân tích dương tính với chất nghiên cứu, trong đó

1 mẫu nang cứng phát hiện dương tính PRO với hàm lượng 1,67 mg/g (tương ứng 0,90 mg/ đơn vị mẫu); 1 mẫu bột dương tính CYP với hàm lượng 0,65 mg/g (tương ứng 3,24 mg/ đơn vị mẫu); 1 mẫu bột dương tính LOR với hàm lượng 0,25 mg/g (tương ứng 1,63 mg/ đơn vị mẫu) Có 1 mẫu bột và 1 mẫu viên hoàn mua đặt hàng qua internet dương tính với CLO với hàm lượng 0,52 mg/g và 0,84 mg/g mẫu tương ứng với 3,29 mg và 2,71 mg hoạt chất trong 1 đơn vị mẫu Kết quả phát hiện 2 mẫu dương tính với CLO của nghiên cứu cũng tương đồng với kết quả phân tích bằng LC-MS/MS (do dùng mẫu thử là mẫu dương tính của nghiên cứu đã công bố [2]) Kết quả được minh họa ở hình 2 và hình 3

Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) là hình thức tiên tiến của sắc

ký lớp mỏng với kích thước hạt pha tĩnh giảm xuống khoảng 5 µm, độ đồng đều cao cho phép nâng cao hiệu quả tách rõ rệt so với bản mỏng thông thường Đặc biệt, với bộ phận scanner của thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

vết chất phân tích tách ra trên sắc đồ do đó chất phân tích được định tính không chỉ dựa vào Rf như với TLC, mà còn được đánh giá độ tinh khiết pic và chồng phổ so với chuẩn Ưu điểm nổi bật của phương pháp xây dựng được là thao tác đơn giản, thiết bị không quá đắt tiền, đặc biệt thời gian phân tích ngắn với bản mỏng kích cỡ 20 x 10 cm có thể triển khai sắc ký phân tích đồng thời 15 mẫu thử trong thời gian khoảng 30 phút ít hơn rất nhiều so với phương pháp phân tích khác Tuy nhiên, độ nhạy của phương pháp LOD là 2 µg/mL đối với dung dịch sắc ký tương ứng với 25 µg/g mẫu thấp hơn so với

sử dụng UHPLC-Q/TOF-MS 0,02 – 16,04 ng/mL [6]; LC-MS/MS 0,006 - 6,0 µg/L [7], HPLC-PDA 0,3 mg/ mL [1] nhưng ngang bằng với phương pháp GC-

MS 10 - 1000 μg/g [8] Kết quả phân tích mẫu thực cho thấy 5 mẫu dương tính với 1 trong 5 chất nghiên cứu trong số 18 mẫu thử nghiệm có mức nồng độ nằm trong khoảng từ 10 – 80 % liều điều trị Do đó, với mức LOD xác định được của

5 dược chất kháng histamin H1 cho phép phát hiện mức trộn các thuốc hóa dược

ở mức tối thiểu 1/80 (tức là 1,25 %) của liều điều trị nên độ nhạy của phương pháp đáp ứng yêu cầu phân tích

Kết luận

Nghiên cứu đã xây dựng được phương pháp HPTLC đơn giản, nhanh, đảm bảo độ đặc hiệu để định tính, định lượng đồng thời 5 thuốc kháng histamin H1 CLO, LOR, PRO, CYP, CIN trộn trong chế phẩm đông dược Điều kiện xác định được là bản mỏng HPTLC Silicagel 60 GF254 với hệ dung môi khai triển gồm cyclohexan: aceton: triethylamin (8: 2: 0,5 tt/tt/tt), bước sóng định lượng cả 5 chất là 254 nm Quy trình phân tích được thẩm định tuân thủ theo các tiêu chí của AOAC về tính chọn lọc, tính thích hợp hệ thống, khoảng tuyến tính, độ thu hồi, độ chính xác Ứng dụng phương pháp xây dựng được để phân tích

18 mẫu chế phẩm đông dược điều trị hoặc hỗ trợ điều trị dị ứng, mẩn ngứa, cảm cúm đang lưu hành trên thị trường, phát hiện thấy 5/18 mẫu (chiếm 27,7

%) mẫu có trộn 1 trong 5 thuốc kháng histamin H1 nghiên cứu Các chế phẩm này đều là được mua bằng hình thức đặt hàng qua internet không có số đăng ký/ số công bố do đó người dùng cần cân nhắc khi sử dụng các sản phẩm không có nguồn gốc xuất xứ rõ ràng, không đăng ký

Lời cảm ơn : Nghiên cứu này được hỗ trợ kinh phí từ đề tài cấp Bộ Y tế

«Xây dựng phương pháp phân tích đồng thời một số thuốc tân dược nhóm

kháng histamin và chống tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm đông

dược bằng HPTLC, HPLC và LC-MS/MS», giai đoạn 2021 - 2022

Tài liệu tham khảo

1 Trần Thị Lan , Nguyễn Thị Quỳnh, Nguyễn Thị Kiều Anh (2020), “Nghiên cứu xác định một số thuốc kháng histamin H1 trộn trái phép trong chế phẩm

Đông dược bằng HPLC-PDA”, Tạp chí Dược học,528 (4), tr 35-40

2 Phạm Thị Thanh Tuyền, Nguyễn Thị An, Đinh Thị Thanh Hải,Trần Thúy Hạnh, Nguyễn Thị Kiều Anh (2018), "Nghiên cứu phát hiện các thuốc chống dị

ứng trộn trái phép trong chế phẩm đông dược bằng LC-MS/MS", Tạp chí Dược

học,517 (3), tr 70-74

Nghiên cứu Dược & Thông tin thuốc, 2021, Tập 12, Số 2, trang 18-24

4 Calahan J., Howard D., Almalki A J., Gupta M P & Calderon A I (2016),

"Chemical Adulterants in Herbal Medicinal Products: A Review", Planta Med,

82(6), pp.505-515

5 Cheng HL, Tseng M-C, Tsai P-L, Her GR Analysis of Synthetic chemical drugs in adulterated Chinese medicines by capillary electrophoresis/electrospray ionization mass spectrometry Rapid Communications in Mass Spectrometry 2001;15(16):1473–80

6 Kim Eun Hye, Seo Hee Seung, et al (2017), "Reliable screening and confirmation of 156 multi-class illegal adulterants in dietary supplements based

on extracted common ion chromatograms by ultra-high-performance liquid

chromatography-quadrupole/time of flight-mass spectrometry", Journal of

Phương Thiện Thương2

1 Trường Đại học Dược Hà Nội

2 Viện Dược liêu Tác giả liên hệ: daothivui@yahoo.com (Ngày gửi đăng: 19/12/2020 - Ngày duyệt đăng: 27/4/2021)

SUMMARY

A method for simultaneous quantification of 5-hydroxymethylfurfural (5-HF) and 4-hydroxybenzoic acid (4-HB) in the collar of Caryota mitis using HPLC-UV technique was developed and validated The HPLC analysis was carried out on a Lichrospher RP-18 column at 25 o C, with mobile phase of acetonitrile and 0.1 % aqueous phosphoric acid in gradient condition, the flow rate of 0.7 mL/min, detection wavelength at 254 nm All calibration curves displayed a good linear relationship (r 2 =0.999) The validation results displayed the good accuracy, repeatability, linearity, and selectivity according to the ICH guideline The contents of 5-HF and 4-

HB in the collar of Caryota mitis were determined to be 1.01 mg/g and 0.16 mg/g, respectively The developed method could be used for determination of the quality of the collar of Caryota mitis with 5-hydroxymethylfurfural and 4-hydroxybenzoic acid as chemical markers

Từ khóa: bẹ cây móc, Caryota mitis, acid 4-hydroxybenzoic,

5-hydroxymethylfurfural, sắc ký lỏng hiệu năng cao

Đặt vấn đề

Cây móc có tên khoa học là Caryota mitis Lour., là một loài thực vật có hoa

thuộc họ Arecaceae Ở nước ta, cây móc được tìm thấy ở nhiều địa phương Theo y học cổ truyền, bẹ của cây móc có vị đắng chát, tính bình, được sử dụng trong các trường hợp kiết lỵ, đi ngoài ra máu, rong kinh, băng huyết và có trong một số bài thuốc cầm máu [1], [2], [3] Cho đến nay, mới chỉ có một số ít nghiên cứu về thành

phần hóa học và tác dụng sinh học của bẹ cây móc Caryota mitis Lour [5] Hầu hết

các nghiên cứu trong nước và trên thế giới đã công bố về thành phần hoá học và tác

dụng sinh học của các bộ phận khác nhau (dầu hạt, lá) từ cây Caryota mitis Lour [8],

[9], trong đó một số chất đã được phân lập và chứng minh có tác dụng sinh học đặc trưng như rutin, quercetin, kaempferol, acid chrologenic Qua khảo sát thực nghiệm cho thấy các chất này không thấy có (hoặc có rất ít) trong bộ phận bẹ cây móc Từ bộ phận bẹ cây móc, nhóm nghiên cứu đã chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc của 02 hợp chất gồm: 5-hydroxymethylfurfural và acid 4-hydroxybenzoic Trong 2 hợp chất này, acid 4-hydroxybenzoic là hoạt chất đã được chứng minh có một số tác dụng sinh học nhưkháng khuẩn, chống dị ứng, hạ đường huyết, chống viêm, chống kết tụ tiểu cầu, chống oxy hóa [7] Hợp chất 5-hydroxymethylfurfural cũng được chứng minh có một số tác dụng sinh học như chống oxy hóa, chống tăng sinh [11], tuy nhiên 5-hydroxymethylfurfural còn là chất gây độc, có thể có ảnh hưởng xấu đến sức khỏe con người, được DĐVN và một số tiêu chuẩn qui định giới hạn trên trong thực phẩm, dược phẩm [6], [10], vì vậy hàm lượng 5-HF trong mẫu bẹ cây móc cũng cần được kiểm soát

Từ những thực tiễn trên, nhóm nghiên cứu tiến hành nghiên cứu xây dựng, phát

Nghiên cứu Dược & Thông tin thuốc, 2021, Tập 12, Số 2, trang 25-32

26

hydroxymethylfurfural và acid 4-hydroxybenzoic trong dược liệu bẹ cây móc nhằm góp phần tiêu chuẩn hóa chất lượng dược liệu, kiểm soát hàm lượng 5-hydroxymethylfurfural trong bẹ cây móc

Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là bộ phận bẹ cây móc thu hái tại huyện Chương Mỹ, Hà

Nội vào tháng 11 năm 2018 Mẫu cây được xác định tên khoa học là Caryota mitis

Lour., họ Cau (Arecaceae) bởi Ths Nghiêm Đức Trọng, Bộ môn Thực vật, Trường Đại học Dược Hà Nội Các mẫu nghiên cứu được lưu giữ tại Bộ môn Dược lý, Trường Đại học Dược Hà Nội

Chất đối chiếu

Hai hợp chất đối chiếu 5-hydroxymethylfurfural (ký hiệu là 5-HF) và acid hydroxybenzoic (ký hiệu là 4-HB) được phân lập từ dược liệu bẹ cây móc Thông tin

về các hợp chất này được trình bày trong bảng 1 Độ tinh khiết của 2 chất 5-HF và

4-HB được xác định bởi HPLC, tính theo phần trăm diện tích pic, kiểm tra với 3 hệ dung môi khác nhau, quan sát tại các bước sóng 210 nm, 254 nm và 366 nm

Bảng 1 Thông tin về 2 chất đối chiếu dùng trong nghiên cứu

Thiết bị

Hệ thống HPLC (Shimadzu, Nhật Bản) gồm: bơm LC–20AD, bộ tiêm mẫu tự động SIL–20AHT, detector UV-VIS, Cột Lichrospher RP-18 (250 x 4,6 mm; 5µm); phần mềm Labsolution để điều khiển chương trình, truy xuất hình ảnh và số liệu trên máy HPLC

Phương pháp nghiên cứu

Chuẩn bị các dung dịch đối chiếu 5-HF và 4-HB

Dung dịch đối chiếu 5-HF: Cân và pha chính xác một lượng chất đối chiếu 5-HF trong methanol để thu được dung dịch có nồng độ chính xác khoảng 0,4 mg/ml Từ dung dịch này, tiến hành pha loãng bằng methanol theo các tỷ lệ khác nhau để thu được các dung dịch đối chiếu 5-HF có nồng độ lần lượt là 42,8; 32,1; 21,4; 10,7; 4,28;

2,14 µg/ml dùng để xây dựng đường chuẩn

Dung dịch đối chiếu 4-HB: Cân và pha chính xác một lượng chất đối chiếu 4-HB trong methanol để thu được dung dịch có nồng độ chính xác khoảng 0,3 mg/ml Từ dung dịch này, tiến hành pha loãng bằng methanol theo các tỷ lệ khác nhau để thu

Cân chính xác một lượng bột dược liệu khoảng 1,00 g (đã nghiền thành bột) vào bình nút mài 100 ml Thêm 50 ml methanol 80 %, lắc đều Đun hồi lưu cách thủy ở nhiệt độ 70 oC trong 60 phút Lọc lấy dịch qua giấy lọc vào bình định mức 50 ml, bổ

sung vừa đủ thể tích bằng methanol 80 % Lọc qua màng lọc 0,45 µm thu được dung

dịch mẫu thử dùng cho phân tích sắc ký HPLC

Thẩm định phương pháp phân tích

Phương pháp phân tích được đánh giá về tính tuyến tính, độ lặp lại, hiệu suất thu hồi, giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) theo hướng dẫn của ICH [4]

Trong đó: C là nồng độ của 5-HF (hoặc 4-HB) trong dung dịch mẫu thử (µg/ml)

tính từ đường chuẩn, V là thể tích pha mẫu thử (ml), m là khối lượng mẫu thử (mg), B

là hàm ẩm của mẫu thử (%)

Kết quả nghiên cứu

Khảo sát điều kiện tiến hành sắc ký

Khảo sát bước sóng phân tích định lượng

Tiến hành đo phổ UV của 5-HF và 4-HB (trong methanol) để tìm bước sóng hấp thụ cực đại Kết quả thu được cho thấy phổ UV của 5-HF có 2 bước sóng cực đại ở

250 nm và 280 nm; phổ UV của 4-HB có cực đại hấp thụ ở 254 nm Từ phổ UV của 2 chất, tham khảo một số tài liệu về định lượng 5-HF và 4-HB, lựa chọn bước sóng 254

nm để định lượng đồng thời cả hai chất 5-HF và 4-HB trong dược liệu bẹ cây móc

Khảo sát dung môi pha động và chương trình rửa giải

Tiến hành khảo sát một số điều kiện dung môi pha động khác nhau như

MeOH-H2O, ACN-H2O, ACN-acid phosphoric 0,1 % Kết quả cho thấy khi sử dụng hệ dung môi ACN-acid phosphoric 0,1 % sắc ký đồ thu được có hiệu quả tách tốt nhất Vì vậy chúng tôi lựa chọn hệ dung môi pha động là ACN-acid phosphoric 0,1 % với chương trình rửa giải như bảng 2, tốc độ dòng là 0,7 ml/phút

Bảng 2 Chương trình dung môi rửa giải

Thời gian (phút) ACN (%) Acid phosphoric 0,1% (%)

Xây dựng đường chuẩn

Xây dựng đường chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ chất phân tích Mỗi dung dịch được tiêm trên hệ sắc ký 3 lần, diện tích pic trung bình thu được sẽ là số liệu để dựng đường chuẩn Kết quả được biểu diễn trên Hình 2

Nghiên cứu Dược & Thông tin thuốc, 2021, Tập 12, Số 2, trang 25-32

250 500 750 1000 1250 1500 1750

mV Detector A Ch1:254nm

Mẫu thử dược liệu bẹ cây móc

(1-dược liệu bẹ cây móc; 2-hợp chất 5-HF; 3-hợp chất 4-HB; 4-mẫu trắng)

Hình 1 Sắc ký đồ HPLC khảo sát dung môi pha động

Hình 2 Đường chuẩn của 5-HF và 4-HB

Phương trình đường chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc giữa diện tích pic vào nồng

độ 5-HF (khoảng nồng độ 2,14-42,8 µg/ml) và 4-HB (khoảng nồng độ 1,70-34,0 µg/ml) đều có hệ số tương quan R2=0,999 cho thấy giữa nồng độ 5-HF (4-HB) và giá trị diện tích pic có tương quan tuyến tính tốt, vì vậy phương pháp xây dựng có thể áp dụng để phân tích định lượng 5-HF và 4-HB

Khảo sát phương pháp xử lý mẫu

Khảo sát dung môi chiết

Tiến hành khảo sát với các dung môi chiết xuất bao gồm ethanol, methanol và hỗn hợp của 02 dung môi này với nước ở các tỷ lệ từ 50-100 % Kết quả thu được ở