Chuyển gen vào cây bông

Trong đó, ba phương pháp sau đây được sử dụng phổ biến:  Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens  Chuyển gen bằng phương pháp phi sinh học  Chuyển gen bằng tế bào trần Từ lâ

ĐẠI HỌC HUẾ ĐẠI HỌC KHOA HỌC HUẾ KHOA SINH HỌC

- -BÀI TIỂU LUẬN

TÌM HIỂU KHẢ NĂNG CHUYỂN NẠP GEN CỦA HAI GIỐNG BÔNG VẢI COKER312 VÀ VN36P

BẰNG PHƯƠNG PHÁP VI KHUẨN

AGROBACTERIUM TUMEFACIENS

Giảng viên hướng dẫn : PGS TS Nguyễn Hoàng Lộc

Huế,1-2013

I.MỞ ĐẦU……… …4

II.TỔNG QUAN TÀI LIỆU……… 5

2.1 Sơ lược về cây bông vải……….5

2.1.1 Vị trí phân loại………5

2.1.2 Tính đa dạng……… 5

2.2 Chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens……… 6

2.2.1 Đặc điểm vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens……… ….6

2.2.2 Ti-plamid……… 7

III PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………….……….14

3.1.Chuẩn bị vật liệu nuôi cấy………14

3.2 Quy trình chuyển nạp gen……… 14

3.2.1 Nguồn plasmid……….14

3.2.2 Chuẩn bị vi khuẩn……….15

3.2.3 Lây nhiễm……….15

3.2.4 Thanh lọc……… 16

3.3 Các chỉ tiêu theo dõi………17

IV.KẾT LUẬN……… 17

V.TÀI LIỆU THAM KHẢO……… 18

BẢNG CHÚ THÍCH CHỮ VIẾT TẮT

AMP: Adenosine 5’- monophosphate

ATP: Adenosine 5’- triphosphate

AS: Acetosyringone

Bp: base pair

ctv: cộng tác viên

cs: cộng sự

DNA: Deoxyribonucleotic acid

GUS: enzyme β-glucuronidase

kb: kilobase

lacZ: gen β-galactosidase

LB: Left border

Mb: megabase

MSCo: MS co-culture medium

Ori: origin of replication

PMI: Enzyme Phosphomannose isomerase

Pmi: gen pmi

plasmid Ti: tumour inducing plasmid

RB: Right border

T-DNA: transferred DNA

Vir: gen vir

Vir: virulence

2,4-D: 2,4-dichlorophenoxy acetic acid

v/v: volume/volume

w/v: weight/volume

I.MỞ ĐẦU

Cho đến nay hơn 150 loài thực vật khác nhau, trong đó có rất nhiều loài cây trồng, đã được chuyển gen thành công Để tạo ra cây biến đổi gen trong những năm qua một loạt các phương pháp khác nhau

đã được thực hiện Trong đó, ba phương pháp sau đây được sử dụng phổ biến:

 Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

 Chuyển gen bằng phương pháp phi sinh học

 Chuyển gen bằng tế bào trần

Từ lâu người ta đã quan tâm nhiều đến việc cải thiện đặc tính di truyền của các loài cây bông vải Mặc dù có nhiều giống bông vải tốt được tạo ra theo các phương pháp lai tạo và chọn lọc truyền thống, nhưng dường như các giống bông đó khó có thể khai thác được các nguồn gen có lợi một cách hiệu quả Việc ứng dụng công nghệ di truyền thực vật có thể thúc đẩy việc tạo ra các giống cây bông có nhiều đặc tính ưu việt về đặc tính nông học như tính kháng sâu bệnh hại, thuốc diệt cỏ và tính chống chịu với các đều kiện bất lợi của môi trường (rét, khô hạn, phèn, mặn…) và các tính trạng số lượng cũng như chất lượng của bông và sợi.

Bài tiểu luận này nhằm tìm hiểu khả năng chuyển nạp gen của hai

giống bông vải Coker 312 và VN36P bằng phương pháp vi khuẩn

Agrobacterium tumefaciens.

II.TỔNG QUAN TÀI LIỆU:

2.1 Sơ lược về cây bông vải:

2.1.1 Vị trí phân loại:

Cây bông vải thuộc Ngành hiển hoa bí tử (Angiospermatophyta), Lớp song

tử diệp (Dicotyledoneae), Họ Malvaceae, Chi Gossypium.

2.1.2 Tính đa dạng;

Chi Gossypium rất đa dạng, có 39 loài, trong đó có 5 loài được trồng phổ

biến trên thế giới,và có 3 loài được trồng ở Việt Nam: G arboreum, G hirsutum,

G.barbadense

2.1.2.1 Gossypium arboretum:

Loài G arboretum (loài bông Cỏ) có dạng hình thoáng, thân mảnh, lá nhỏ,

lông ít, rễ cộc nhỏ với bộ rễ ăn nông, chịu được mưa, cuống quả dài rủ xuống, đầu quả quay xuống đất, vỏ quả mỏng, chín sớm, hạn chế được hiện tượng thối quả khi gặp mưa lúc bông nở Về phẩm chất xơ bông Cỏ : thô, tỉ lệ xơ thấp, độ mịn kém

Cỏ hiện có ở Việt Nam thuộc 2 loài phụ: G arboreum ssp neglectum và

G.arboreum ssp nanking.

2.1.2.2 Gossypium hirsutum:

Loài Gossypium hirsutum (loài bông Luồi) thường là cây hàng năm, cây

cao, lá to, mặt lá phẳng Cành lá khỏe, số lượng lá nhiều, quả tròn, mặt quả nhẵn, trọng lượng hạt bông trung bình trong một quả đạt 5 - 6g Bông Luồi có nhiều

loài phụ như : G.hirsutum ssp Mexicanum, G.hirsutum ssp punctatum,

G.hirsutum ssp panicultum…

2.1.2.3 Gossypium barbadense:

Loài Gossypium barbadense còn gọi là bông Hải Đảo, cây tương đối to,

chín muộn, lá to, khía sâu, màu xanh đậm Thân cành lá gần như không có lông, đài không có răng cưa rõ rệt và thường chỉ gợn hình làn sóng Hạt thường nhẵn, không có xơ ngắn, xơ dài màu trắng hoặc cà phê sữa Bông Hải Đảo có nhiều loài

phụ như: G barbadense ssp darwinii, G barbadense ssp ruderale, G.

barbadense ssp ventiforlum.

2.1.2.4 Gossypium herbaceum:

Loài này phân bố chủ yếu ở các sa mạc, khí hậu khô nóng như vùng Trung

Á, TâyBắc Trung Quốc, Châu Phi, chưa thấy trồng ở Việt Nam

2.1.2.5 Gossypium tricuspidatum:

Loài này khá giống loài G hirsutum, cây và lá to, chín hơi muộn, xơ dài và

mịn Loài này đòi hỏi đất tốt, nhiều nước, nhiệt độ cao, chống chịu sâu bệnh khá

và được trồng nhiều ở Nam Mỹ Loài bông này không có ở Việt Nam

2.2 Chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens:

Chuyển nạp gen là kỹ thuật đưa một hay nhiều gen lạ đã được thiết kế ở dạng DNAtái tổ hợp vào bộ gen của sinh vật đang nghiên cứu Những thành tựu của kỹ thuật nuôi cấy mô và kỹ thuật tái tổ hợp DNA đã mở ra triển vọng đối với chuyển nạp gen ở thực vật bậc cao, tạo ra những tính trạng di truyền mới như kháng sâu bệnh hại, thuốc diệt cỏ… Sự chuyển nạp gen thành công trên cây trồng

đã được ghi nhận bằng cách sử dụng plasmid Ti, thông qua vi khuẩn

Agrobacterium tumefaciens để đưa gen mong muốn vào trong bộ gen cây trồng.

Phương pháp sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens để chuyển nạp gen còn

được gọi là phương pháp chuyển nạp gen gián tiếp

2.2.1 Đặc điểm vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens:

Giống Agrobacterium được chia làm một số loài dựa trên triệu chứng gây bệnh và kí chủ Một số loài thuộc chi Agrobacterium như: A radiobacter ( loài nay không gây bệnh cho cây), A tumefaciens và A rhizogens gây bệnh khối u và bệnh cổ rễ…

Hình 2.1 Khối u do Agrobacterium tumefaciens gây ra trên thực vật A:

một khối u lớn trên thân cây hoa Hồng; B: các khối u trên cành Nho (Deacon và ctv, 2005).

Agrobacterium tumefaciens là vi khuẩn hình que, gram âm, có khả năng di

động, không sinh bào tử và có quan hệ gần gũi với vi khuẩn cố định đạm

Rhizobium Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens là vi khuẩn hiếu khí, có 5- 11

lông roi, vi khuẩn này phát triển tối ưu ở nhiệt 290C trong môi trường có bổ sung

mangan và succinate như là nguồn cacbon duy nhất Agrobacterium tumefaciens là

vi khuẩn gây bệnh khối u trên cây (chủ yếu là cây hai lá mầm) khi xâm nhiễm vào

cây Bộ nhiễm sắc thể vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens dạng vòng có kích

thước là 2,6Mb Ngoài ra vi khuẩn còn mang plasmid lớn có kích thước 200

-800 kb, chính plamid này là nguyên nhân gây ra khối u trên cây khi vi khuẩn này xâm nhập Plasmid này có tên gọi là Plasmid Ti, hầu hết các gen gây khối u đều nằm trên plasmid này Khi rễ cây xuất hiện vết thương thì tế bào vi khuẩn sẽ di chuyển về phía vết thương và xâm nhập vào cây qua vết thương đó Vi khuẩn độc mang một hoặc nhiều plasmid, một trong số đó là Plasmid Ti Plasmid Ti mang các gen để xác định kí chủ và triệu chứng khi nhiễm vào cây Những vi khuẩn không mang Plasmid Ti thì được xem như là vi khuẩn không độc và không có khả năng gây bệnh khối u cho cây Khối u đầu tiên xuất hiện nhỏ màu trắng, ban đầu được tìm thấy ở gốc cây Các khối u lớn dần và xuất hiện các vết lốm đốm nâu đen

do các tế bào ngoại biên chết đi Các khối u có thể mền và xốp và có thể bị vỡ vụn khi chạm vào, nhưng cũng có thể cứng và xuất hiện các u nhỏ Các khối u có đường kính đến 30 cmnhưng phổ biến là 5 – 10 cm Cây bị nhiễm vi khuẩn sẽ trở nên còi cọc, lá úa vàng và rất nhạy cảm với các điều kiện môi trường Khi xâm nhiễm vào cây một phần gen trên Plasmid Ti sẽ gắn vào bộ gen của cây làm cho các tế bào phát triển mạnh và sản xuất ra một chất đặc biệt gọi là Opine Vi khuẩn

sẽ sử dụng chất này như một nguồn cacbon

2.2.2 Ti-plamid

Plasmid Ti là một DNA vòng tách rời với nhiễm sắc thể của vi khuẩn và có khả năng nhân lên một cách độc lập trong tế bào vi khuẩn Việc xác định Plasmid

Ti như một nguyên lý tạo bướu TIP (tumor inducing principle) đã đánh dấu bước

khởi động của một giai đoạn mới trong nghiên cứu về Agrobacterium

tumefaciens Điều này đã mở ra khả năng nghiên cứu cấu trúc và chức năng của

plasmid bằng kỹ thuật di truyền phân tử

Plasmid Ti có cấu trúc bao gồm: đoạn T- DNA mang các gen tổng hợp các hormone thực vật và vùng gen vir, ngoài ra còn có một số gen mã hoá cho việc tái sinh plasmid, cho việc tiêu hoá opine Trong cấu trúc của Plasmid Ti , hai yếu tố quan trọng cần cho sự chuyển gen vào cây là đoạn T- DNA bao gồm cả trình tự 25

bp ở hai cánh của đoạn T- DNA và gen vir

Hình 2.2.Ti-plasmid của

Agrobacterium dạng

nopalin T-DNA:

Transfer-DNA, LB: Bờ trái RB: Bờ

phải, ori: khởi đầu sao chép của A.tumefaciens.

noc: Phân giải nopalin, nos: Tổng hợp nopalin tmr: Tổng hợp cytokinin, tms: Tổng hợp auxin, tra:

Vận chuyển tiếp hợp, vir:

Vùng virulence (vùng độc tính) (Trần Thị Lê và cs, 2006)

2.2.2.1 Chức năng của T-DNA:

T-DNA là một đoạn DNA có kích thước 10-30 kb, trong đó có chứa gen mã hoá cho việc tổng hợp auxin, cytokinin, opine và các gen gây khối u Trong Plasmid Ti, vị trí của T-DNA được giới hạn bởi bờ phải và bờ trái Trình tự nucleotide của bờ phải và bờ trái tương tự nhau và đều có kích thước 25bp Tuy nhiên, bờ trái của T-DNA có thể được bỏ qua trong chuyển nạp T-DNA, trong khi

đó bờ phải lại cần thiết và tiến trình chuyển nạp diễn ra với bờ phải trước và tiến dần về phía trái Việc đảo ngược bờ phải sẽ làm yếu đi khả năng tạo khối u ( Zhu

và ctv, 2000)

T-DNA mã hóa một vài protein và các protein này biểu hiện trong tế bào cây được chuyển gen làm kiểu hình cây thay đổi lớn Các gen trên T-DNA có thể biểu hiện trong tế bào cây bằng cách mô phỏng các gen của cơ thể đa bào T-DNA

mã hóa cho 13 protein và những vùng không sao mã của các gen được chuyển mang nhiều đặc điểm của các gen trong cây, yếu tố tăng cường sao mã, các vị trí gắn đuôi poly A của cơ thể đa bào Một nhóm các gen của T-DNA điều khiển tổng hợp các hormone sinh trưởng của cây, những hormon này làm các tế bào tăng sinh

và làm thay đổi hình dạng bên ngoài Sản phẩm của gen iaaM và gen iaaH điều khiển sự chuyển hoá tryptophan thông qua indolacetamin thành indolacetic axit (auxin) Sản phẩm của gen ipt giúp gắn kết isopentenyl pyrophosphat với AMP và

các enzyme trong cây được cho là chuyển hoá isopentenyl-AMP thành cytokinin zeatin bằng cách loại bỏ nhóm phosphoribosyl và loại bỏ phân tử hydro của một nhóm methyl của isopentenyl Hai gentrên T-DNA khác được cho là có chức năng trong tạo khối u là 5 và tml (cũng còn gọi là 6b) Sản phẩm của gen 5 điều khiển sinh tổng hợp indole-3-lactate, đó là một chất đồng đẳng với auxin Trong khi đó gen tml làm tăng mức độ nhạy cảm của các tế bào cây với phytohormon bằng một

cơ chế chưa được giải thích Gen tml có thể kích thích tạo các khối u ngay cả khi vắng mặt các gen gây khối u khác

Một nhóm gen được chuyển thứ hai đều khiển sản xuất nguồn dinh dưỡng cho vi khuẩn, đó là các opine Đây là một dạng kết hợp giữa một aminoacid với một keto acid hoặc một đường Các tế bào chuyển gen tổng hợp và tiết ra một số lượng lớn các opine Các opine này hấp dẫn vi khuẩn mang kiểu gen tiêu biểu (bên ngoài vùng T-DNA và thường trên plasmid độc) cần cho việc phân giải các opine được tổng hợp từ khối u Dựa trên các kiểu opine đựơc tạo ra từ các khối u mà phân chia nhóm vi khuẩn Agrobacterium thành các chủng như là: octopine, nopaline, succinamopine và leucinopine

Hiện có ít nhất là 20 loại opine khác nhau, mỗi chủng tạo ra và phân giải một nhóm opine chuyên biệt Gen ocs mã hóa cho octopine synthase, enzyme này gắn pyruvate với arginine, lysine, histidine hoặc ornithine để tạo ra octopine, lysopine, histopine hoặc octopinic acid và tất cả những opine này đều được phát hiện trong các khối u Sản phẩm của gen mas2’ được cho là làm kết nối glutamine hoặc glutamic acid với glucose (mặc dù đều này chưa đựơc chứng minh bằng thực nghiệm), trong khi đó sản phẩm của mas1’ lại làm giảm bớt các dạng trung gian mannopine và mannopinic acid Sản phẩm của gen ags sẽ làm lacto hóa mannopine thành agropine Mannopine và agropine cũng có thể lactate hóa thành agropinic acid Bởi vậy, các khối u được tạo ra bởi Plasmid Ti kiểu octopine có thể tạo 4 loại octopine và 4 kiểu thuộc nhóm mannityl opine

Hình 2.3 Sơ đồ biểu diễn quá trình di chuyển DNA của Ti-plasmid 1:

T-DNA với bờ phải và bờ trái được chèn vào Ti-plasmid 2: Sợi đơn được cắt ra

nhờ protein được mã hóa bởi gen virD2 3: Sợi đơn của T-DNA được giải phóng

và kết hợp với protein do virD2 và virE2 mã hóa, chỗ đứt ở sợi đơn thứ hai được

tổng hợp bổ sung 4: Lấp đầy chỗ trống trong Ti-plasmid (đường gạch nối đậm) Sợi T-DNA tự do được vận chuyển vào tế bào thực vật ở dạng phức hệ DNA-protein.( Trần Thị Lệ và cs, 2006).

2.2.2.2 Chức năng của các gen vir:

Vùng vir trên Plasmid Ti có khoảng 25 gen được nhận biết trong 7 đơn vị phiên mã là: virA, virB, virC, virD, virE, virG, virF và vùng này có kích thước

khoảng 30- 40 kbp Những gen vir này mã hoá cho các vai trò như: nhận ra tế bào thực vật, tấn công vào tế bào thực vật, gia công đoạn DNA, chuyển nạp đoạn T-DNA và có lẽ có cả vai trò trong sự xâm nhập của T-T-DNA vào tế bào kí chủ

Các gen vir có vai trò trong việc nhận diện ra vết thương của cây thông qua dấu hiệu hoá học tiết từ vết thương Các tín hiệu hoá học từ vết thương ở tế bào cây chủ tạo ra được nhận biết trước tiên bởi VirA protein, rồi đến VirG protein để làm kích hoạt các gen độc khác ở vùng vir, tạo ra các protein cần thiết Gen vir được kích hoạt tối đa ở pH acid với sự hiện diện của các hợp chất phenol như là acetosyringone (AS), chất mà được giải phóng khi tế bào cây bị tổn thương Biểu hiện cơ bản của gen virA tổng hợp nên protein nằm trong màng tế bào, protein VirA đáp ứng với sự trao đổi chất của vết thương của cây VirA có thể đáp ứng nhạy cảm với sự thay đổi của môi trường Với một nồng độ AS thích hợp VirA có thể được kích thích bởi đường, các opine khối u hoặc amino acid(Zhu và ctv, 2000) Protein VirA sẽ tự phosphoryl hoá, sự tự phosphoryl hoá này sẽ làm protein nội bào VirG được phosphoryl hoá bởi aspartic acid còn lại sau khi VirA tự phosphoryl hoá và kích hoạt sao mã cho tất cả các gen vir Các promoter của gen vir có kích thước khoảng 12bp trong trình tự “vir box”

Các gen vir có vai trò trong việc tạo sợi đơn T-DNA trong vi khuẩn và đưa sợi đơn T-DNA vào trong tế bào cây Các protein được mã hoá bởi gen virD và virE thực hiện chức năng tạo ra phức hợp T-DNA Protein VirD2 là một endonuclease, protein này sẽ cắt T- DNA tại vị trí nucleotide thứ 3 và thứ 4 trên trình tự bờ vai 25 bp để tạo ra phân tử sợi đơn T-DNA và liên kết đồng hoá trị với đầu 5’ của sợi đơn T-DNA Protein VirD2 được tinhsạch từ oligonucleotide sợi đơn mang các trình tự bờ vai ở vị trí tương đồng Protein VirE2 là một protein gắn trên sợi đơn DNA , nó sẽ bảo vệ T-DNA khỏi sự phân giải của các enzyme nuclease trong tế bào cây, protein VirE2 là protein chiếm số lượng nhiều nhất Protein VirE2 và VirD2 mang trình tự định vị nhân, trình tự này giúp thúc đẩy sự hấp thu phức hợp T-DNA vào nhân Hai sản phẩm của gen vir khác cũng được cho

là có chức năng trong việc tạo gia công T-DNA là: VirC1 và VirC2 VirC1 đã được thấy gắn kết vào vùng “overdrive”, vùng này nằm gần bờ phải, và bởi vậy giúp tăng cường sự cắt T-DNA ở vị trí bờ vai của VirD1/VirD2 endonuclease Một số tác giả khác cho rằng VirC1 và VirC2 không cần cho tạo sợi đơn T-DNA nhưng khi vắng mặt hai protein này thì hiệu quả chuyển nạp T-DNA vào cây khá thấp Do đó đề nghị rằng chúng có chức năng trong việc xuất T-DNA (Zhu và ctv, 2000) Ngoài ra, Protein VirD2 được cho làcó chức năng trong sự hòa hợp T-DNA, bởi nó gắn vào đầu 5’ của T-T-DNA, đưa T-DNAvào nhân tế bào và lưu lại cùng với T-DNA trong các bước hòa hợp Hai giả thuyết về chức năng của protein VirD2 trong sự hòa hợp T-DNA đã được đề nghị: VirD2 hoạt động như một integrase và VirD2 hoạt động như một ligase