BIẾN NẠP GEN CHUYỂN HÓA ACID BÉO OMEGA 3 (GEN GmFAD3) VÀO VI KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFACIENS VÀ BƯỚC ĐẦU CHUYỂN GEN VÀO CÂY MÈ (SESAMUM INDICUM L.)

Dầu mè là một loại dầu thực vật chứa nhiều chất béo dễ tan nên được hấp thụ trực tiếp vào tế bào và được cơ thể tiêu dùng ngay.. Vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens đã được thừa nhận là

VÀ BƯỚC ĐẦU CHUYỂN GEN VÀO

CÂY MÈ (SESAMUM INDICUM L.)

BIẾN NẠP GEN CHUYỂN HÓA ACID BÉO OMEGA 3 (GEN GmFAD3) VÀO VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens VÀ BƯỚC ĐẦU CHUYỂN GEN

VÀO CÂY MÈ (Sesamum indicum L.)

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Các số liệu, kết quả trong luận văn là trung thực và

chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Ký tên

VÕ THỊ THUÝ HUỆ

5

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến:

Quí Thầy Cô trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh đã tận tâm hướng dẫn, truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt thời gian học tập

Thầy Bùi Minh Trí đã tận tình hướng dẫn tôi hoàn thành công trình nghiên cứu này

Giáo sư Anders S Carlsson đã giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện nghiên cứu tại Thuỵ Điển

Chương trình hợp tác nghiên cứu Việt Nam – Thụy Điển/Sida-Sarec đã tạo điều kiện cho tôi thực hiện nghiên cứu

Quí Nhà trường, khoa Nông học và Phòng Sau đại học đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành khoá học

Gia đình, các bạn, đồng nghiệp đã động viên, chia sẻ và góp ý cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

TÓM TẮT

Đề tài: “Biến nạp gen chuyển hóa acid béo Omega 3 (gen GmFAD3) vào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và bước đầu chuyển gen vào cây mè (Sesamum

indicum L.) ” được thực hiện tại Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi

trường, Trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh và Đại học Nông nghiệp (SLU)- Thuỵ Điển

Mục tiêu của đề tài là biến nạp plasmid Ubi GmFAD3 vào hai dòng vi khuẩn

Agrobacterium tumefaciens GV3101, GV2260 và sử dụng hai dòng vi khuẩn này để

chuyển gen GmFAD3 vào cây mè Kết quả cho thấy rằng sau khi biến nạp bằng xung điện ở 2.5 kV thì plasmid Ubi GmFAD3 đã hoàn toàn hợp nhất vào hai dòng

vi khuẩn GV3101 và GV2260, kết quả đã được kiểm chứng bằng kỹ thuật giải trình

tự DNA Sử dụng hai dòng vi khuẩn vừa biến nạp để chuyển gen vào cây mè bằng

kỹ thuật nhúng hoa Thí nghiệm chuyển gen được thực hiện ở các giai đoạn phát triển khác nhau của nụ hoa Hạt thu được từ những cây chuyển gen đã được sàng lọc bằng kháng sinh kanamycin Nồng độ kanamycin thích hợp cho chọn lọc cây mè chuyển nạp gen là 75mg/L Chất kết dính bề mặt silwet L-77 cho hiệu quả chuyển gen cao ở nồng độ 0,05% Tỉ lệ chuyển gen cao nhất (14,4%) khi chủng vi khuẩn ở thời điểm nụ hoa 20 ngày sau khi nhúng hoa nở Dòng vi khuẩn GV2260 cho tần số chuyển gen là 5,1% cao hơn gấp hai lần so với dòng GV3101 80% cây mè T1 kháng kanamycin (75mg/L) cho kết quả dương tính khi thực hiện phản ứng khuếch

đại PCR gen npt II Phân tích PCR cũng cho thấy sự hiện diện của gen GmFAD3 trong bộ gen của cây mè T1 Sự hiện diện của cả hai gen npt II và GmFAD3 trong

cây mè T1 kháng kanamycin cho thấy đã chuyển thành công toàn bộ đoạn T-DNA vào bộ gen cây mè

for Biotechnology and Environment, Nong Lam University and Swedish University

of Agriculture –(SLU)- Sweden

The objective of the thesis was to transform UbiGmFAD3 plasmid into two Agrobacterium strains (GV3101 and GV2260) and the use of these strains in creating

transgenic sesame Results shown that after transformation in pulsed electric field at 2.5

kV, UbiGmFAD3 plasmid including FAD3 gene was completely intergrated into two A.tumefaciens strains (GV3101 và GV2260) as indicated by DNA sequencing.

The two bacterial strains were, then used to deliver GmFAD3 gene into sesame plants using floral dipping technique Sesame plants at different flowering stages were used for floral dipping experiments The matured seeds obtained from the experimented plants were screened for transformants The concentration of kanamycin suitable for selection of putative transformants was 75mg/L Highest successful transformation was achieved when silwet L-77 was added to the dipping medium at concentration of 0.05%(v/v) The best transformation frequency of 14.4% was recorded for flowers that opened 20 days after dipping The bacterial strain GV2260 gave more than twice as many transformants as GV3101 did and reached an overall transformation frequency of 5.1% Up to 6.8% of the T1 plants that survived on kanamyicin added medium gave positive signal as indicated by

PCR amplification of the npt II gene The presence of npt II and GmFAD3 genes as

confirmed by PCR in the seedling resistance to kanamycin shown successful transfer of the complete T-DNA into the plant genome

MỤC LỤC

Trang chuẩy y i

Lý lịch cá nhân ii

Lời cam đoan iii

Lời cảm tạ iv

Tóm tắt v

Summary vi

Mục lục vii

Danh sách các chữ viết tắt xi

Danh sách các hình xii

Danh sách các bảng xiii

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu đề tài 2

1.3 Giới hạn đề tài 2

Chương 2 TỔNG QUAN 3

2.1 Nguồn gốc và sự phân bố cây mè 3

2.2 Phân loại và đặc điểm thực vật học cây mè 3

2.3 Công dụng và giá trị kinh tế 4

2.3.1 Công dụng 4

2.3.2 Giá trị dinh dưỡng 4

2.4 Tình hình sản xuất mè trên Thế giới và Việt Nam 5

2.5 Tổng quan về dầu thực vật và các acid béo 7

2.5.1 Acid béo omega 3 8

2.5.2 Các nguồn acid béo n-3 9

2.5.3 Sinh tổng hợp acid béo và triacylglycerol trong hạt 12

2.6 Thàh phần acid béo trong hạt mè 12

9

2.7 Biến đổi thành phần acid béo trong mè 14

2.8 Các nghiên cứu chuyển gen trên cây mè……… 15

2.9 Thành phần của gen chuyển nạp 17

2.9.1 Promoter 17

2.9.2 Gen thông báo (reporter gene) 17

2.9.3 Chỉ thị chọn lọc (selectable marker) 18

2.10 Các vector 18

2.10.1 Vector đồng nhập (cointergrating vector)……… 19

2.10.2 Vector hai nguồn (binary vector)……….… 19

2.11 Các phương pháp chuyển nạp gen phổ biến……….20

2.11.1 Chuyển nạp gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 21

2.11.2 Chuyển nạp gen bằng phương pháp PEG (polyethylene glycol) 25

2.11.3 Chuyển nạp gen bằng phương pháp sử dụng xung điện (electroporation) 25

2.11.4 Chuyển nạp gen bằng phương pháp bắn gen (biolistic)……….25

2.12 Tình hình nghiên cứu cây trồng chuyển gen ở Việt Nam và trên Thế giới… 26

2.12.1 Tình hình nghiên cứu cây trồng chuyển gen ở Việt Nam……… 26

2.12.2 Tình hình nghiên cứu cây trồng chuyển gen trên Thế giới………27

Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30

3.1 Địa điểm nghiên cứu 30

3.2 Vật liệu thí nghiệm 30

3.2.1 Giống mè 30

3.2.2 Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và các gen chuyển nạp 30

3.2.3 Hoá chất………….……… 31

3.2.3.1 Hoá chất dùng trong quy trình chuyển gen 31

3.2.3.2 Hoá chất dùng trong li trích DNA 33

3.2.3.3 Hoá chất dùng trong phản ứng PCR 33

3.2.4 Thiết bị và dụng cụ 33

3.3 Phương pháp thí nghiệm 34

3.3.1 Biến nạp plasmid pHTS Ubi GmFAD3 vào vi khuẩn Agrobacterium

tumefaciens ……… ……… 34

3.3.1.1 Plasmid và vi khuẩn biến nạp 34

3.3.1.2 Biến nạp plasmid pHTS Ubi GmFAD3 vào 2 dòng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 34

3.3.1.3 Kiểm tra sản phẩm vi khuẩn sau khi biến nạp 35

3.3.2 Thiết lập qui trình biến nạp vi khuẩn vào cây mè 36

3.3.2.1 Chuẩn bị cây mè trước khi chuyển gen 36

3.3.2.2 Thiết lập quy trình chuyển gen……… 37

3.3.3 Sàng lọc kháng sinh 38

3.3.4 Phản ứng PCR khuếch đại gen GmFAD3 39

3.3.4.1 Li trích DNA 39

3.3.4.2 Phản ứng PCR 40

3.3.4.3 Điện di……… 41

3.4 Dự kiến kết quả đạt được 42

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN……….………….…….43

4.1 Biến nạp plasmid pHTS Ubi GmFAD3 vào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens….………43

4.2 Kiểm tra sản phẩm vi khuẩn sau khi biến nạp……… 44

4.2.1 Kết quả cắt giới hạn bằng enzyme Hind III……….44

4.2.2 Kết quả giải trình tự đoạn gen GmFAD3……….45

4.3 Chuyển gen vào cây mè thông qua vi khuẩn Agrobacterium……….48

4 3.1 Thử nghiệm khả năng kháng tự nhiên của giống mè Exel đối với kanamycin……… 48

4.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chuyển gen bằng kỹ thuật nhúng hoa….50 4.3.2.1 Ảnh hưởng nồng độ Silwet L-77……… 50

4.3.2.2 Ảnh hưởng của tuổi nụ hoa ở thời điểm chủng vi khuẩn Agrobacterium……….….51

4.3.2.3 Dòng vi khuẩn thử nghiệm………54

4.3 Kiểm tra cây chuyển nạp gen……… 54

DHA: docosahexaenoic acid

FADs:fatty acid desaturase

GmFAD3: glycine max fatty acid desaturase 3

PEG: polyethylene glycol

PUFA: poly-unsaturased fatty acid

Tnos: nopaline synthase terminator

Pnos: nopaline synthase promoter

Ubi1-P-int: ubiquitin promoter

13

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1: Chu trình chuyển hoá tạo thành acid béo omega 3……… 8

Hình 2.2: Thành phần của một gen chuyển nạp 18

Hình 2.3: Ti-plasmid của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 22

Hình 3.1: T-DNA của plasmid pHTS Ubi-GmFAD3 ……… 31

Hình 4.1: Kết quả biến nạp plasmid Ubi GmFAD3 vào tế bào vi khuẩn GV3101 (A) và GV2260 (B……… 43

Hình 4.2 : Kết quả điện di sản phẩm cắt bằng enzyme Hind III trên gel agarose 1% 44

Hình 4.3: Sơ đồ vị trí cắt của enzyme Hind III trên cấu trúc của plasmid Ubi GmFAD3 45

Hình 4.4: Kết quả contig trình tự giải được từ priner Ubi R và Ubi F……….46

Hình 4.5: Trình tự đoạn gen GmFAD3 contig từ trình tự hai primer 46

Hình 4.6: Kết quả so sánh của trình tự contig và trình tự chuẩn GmFDA3 công bố trên ngân hàng gen……… …… 47

Hình 4.7: Ảnh hưởng của tuổi nụ hoa đến tạo cây chuyển gen (kết quả thu nhận từ 1 cây)……….…51

Hình 4.8: Cây mè thực hiện chuyển gen bằng kỹ thuật nhúng hoa……… 52

Hình 4.9: Cây mè chuyển gen giả định……….… ….54

Hình 4.10: Kết quả điện di PCR cây mè chuyển gen giả định với cặp mồi khuếch đại đoạn gen npt II……….… 55

Hình 4.11: Điện di sản phẩm PCR từ 10 cây mè kháng kanamycin……… 56

Hình 4.12: Sơ đồ quy trình chuyển gen vào cây mè thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens……….………… 57

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1: Diện tích, năng suất và sản lượng mè trên Thế giới và Việt nam……… 5

Bảng 2.2: Nguồn thực vật điển hình chứa α – linolenic……… 9

Bảng 2.3: Những mục tiêu biến đổi gen ở dầu mè………15

Bảng 2.4: Một số nghiên cứu chuyển gen trên Thế giới……… 27

Bảng 3.1: Thành phần hoá chất của phản ứng cycle sequencing 35

Bảng 3.2: Thành phần hoá chất tham gia phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen npt II 40

Bảng 3.3: Thành phần hoá chất tham gia phản ứng PCR khuếch đại một phần đoạn gen GmFAD3 và một phần promoter 35S 41

Bảng 4.1 : Nồng độ plasmid của hai dòng vi khuẩn GV3101 và GV2260 44

Bảng 4.2: Khả năng kháng tự nhiên của giống mè Exel với kanamycin sau 4 tuần nuôi cấy 49

Bảng 4.3: Ảnh hưởng của nồng độ Silwet đến việc tạo cây mè chuyển gen 50

Bảng 4.4: Ảnh hưởng của tuổi nụ hoa đến việc tạo cây chuyển gen 53

Bảng 4.5: Sự biến đổi về tần số chuyển gen do sự khác biệt giữa các dòng vi khuẩn……… ……… 54

15

Chương 1

MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Mè là một loại thực vật thường được trồng nhiều tại các nước nhiệt đới và ôn đới thuộc vùng Á Châu Hạt mè chứa nhiều dầu Dầu mè là một loại dầu thực vật chứa nhiều chất béo dễ tan nên được hấp thụ trực tiếp vào tế bào và được cơ thể tiêu dùng ngay Ngoài ra, dầu mè còn chứa nhiều chất khoáng và protein có phẩm chất cao Do đó, mè là một loại thực phẩm hữu ích cho sức khỏe của con người trong nhiều phương diện

Vì sự hữu ích mà mè và dầu mè mang lại nên người ta không ngừng mong muốn nâng cao sản lượng cũng như chất lượng mè và dầu mè Chất lượng dầu mè được quyết định bởi thành phần acid béo có trong dầu bao gồm các acid béo không

no, đặc biệt là alpha-linolenic acid (omega 3) Trong hơn hai mươi năm qua, đã có nhiều quan sát thực tế và nghiên cứu khoa học cho thấy Omega- 3 rất hữu dụng trong việc phòng ngừa một số bệnh tật như: các bệnh tim mạch, ung thư vú, nhức đầu và đau khớp xương

Để thực hiện ước muốn cải thiện chất lượng dầu mè, đặc biệt là nâng cao hàm lượng omega- 3, việc ứng dụng thành tựu của công nghệ gen có nhiều ưu thế

so với các kỹ thuật truyền thống Vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens đã được

thừa nhận là một công cụ hữu hiệu cho công tác chuyển gen vào nhiều loại cây

trồng Biến nạp được gen mong muốn vào vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens là

một bước quan trọng để tiến tới việc tạo dựng một hệ thống chuyển gen hoàn chỉnh

Để góp một phần vào công tác nghiên cứu cải thiện chất lượng dầu mè, chúng tôi tiến hành đề tài “Biến nạp gen chuyển hóa acid béo Omega 3 (gen

GmFAD3) vào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và bước đầu chuyển gen vào

cây mè (Sesamum indicum L.) ”

1.2 Mục tiêu đề tài

- Biến nạp gen GmFAD3 vào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

- Bước đầu chuyển được gen GmFAD3 vào cây mè

1.3 Giới hạn đề tài

Vì thời gian có hạn nên kết quả của nghiên cứu chỉ xác nhận sự hiện diện

gen npt II và GmFAD3 trong lá mè bằng kỹ thuật PCR với hai cặp mồi npt II

1s-nptII 4r và p7-35s223r- GmFAD3 4s

Sử dụng 2 dòng vi khuẩn Agrobacterium để nghiên cứu biến nạp và làm

vector chuyển gen

Chương 2

TỔNG QUAN 2.1 Nguồn gốc và sự phân bố cây mè

Các loài mè nói chung có tên khoa học là Sesamum spp., có nguồn gốc từ

châu Phi, là loại cây có dầu được trồng rất lâu đời (vào khoảng 2000 năm trước công nguyên) Mè sớm phát triển ở vùng phía Tây Á, Ấn Độ, Trung Quốc và Nhật Bản Những nơi này được xem như là trung tâm phân bố của cây mè

Hiện nay, mè đã được gieo trồng phổ biến ở vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới và thông qua việc chọn tạo giống thì một số giống có thể trồng thích hợp ở một số nước ôn đới (Tạ Quốc Tuấn và Trần Văn Lợt, 2006)

2.2 Phân loại và đặc điểm thực vật học của cây mè

Cây mè thuộc bộ Tubiflorae, họ Pedaliacea, có 16 chi và khoảng 60 loài

Trên thế giới giống Sesamum gồm hơn 20 loài Mè được trồng là Sesamum indicum

L có số lượng nhiễm sắc thể 2n = 26 Ngoài ra còn có S capennsen, S alanum, S

chenkii, S laniniatum có 2n = 46

Mè có nhiều giống và dòng khác nhau về thời gian sinh trưởng, màu sắc hạt

và dạng cây Hiện nay phân loại giống mè dựa vào những đặc tính thực vật như sau:

- Thời gian sinh trưởng: phân loại giống có thời gian sinh trưởng dài ngày (trên 100 ngày) hoặc giống sinh trưởng ngắn ngày (dưới 100 ngày) Cách phân loại này quan trọng khi chọn giống để luân canh với cây trồng khác như lúa, bắp, đậu, khoai

- Số khía trên trái mè: phân loại các giống mè bốn khía, sáu khía, tám khía, phân loại này dùng để chọn cỡ hạt nhỏ lại

- Trái bị nứt khi thu hoạch hay không bị nứt: phân loại này giúp cho việc thu hoạch đồng loạt hay không

- Màu hạt: Đây là cách phân loại phổ biến nhất Phân biệt hai loại mè là mè

đen (Sesamum indicum L.) và mè vàng (Sesamum orientale L.)

Ngoài các cách phân loại trên, người ta còn phân loại mè theo thời vụ trồng, số hoa ở nách lá, sự phân cành trên thân (Tạ Quốc Tuấn và Trần Văn Lợt, 2006)

2.3 Công dụng và giá trị kinh tế

2.3.1 Công dụng

- Hạt mè: được sử dụng rất phổ biến để chế biến nhiều dạng thức ăn (kẹo mè, chè mè) Trong dân gian, còn dùng mè để nấu cháo (nếp với mè) cho người mẹ cho con bú rất tốt

- Dầu mè: không bị oxy hóa nên không chuyển thành mùi khó chịu, vì trong

mè có chứa chất sesamol, ngăn cản quá trình oxy-hóa

Trong kỹ nghệ, dầu mè sử dụng để bôi trơn máy móc cao cấp: máy bay, máy móc thiết bị nghiên cứu khoa học kỹ thuật Dầu mè còn dùng để pha sơn, pha vecni rất tốt vì có màu láng bóng

Trong y học, dùng để làm thuốc viên con nhộng Dầu mè còn dùng trong

mỹ phẩm, ở Ấn Độ, người ta còn dùng dầu mè để bôi vào tóc cho bóng mượt

2.3.2 Giá trị dinh dưỡng

Mè có giá trị dinh dưỡng cao, trong hạt mè có chứa: 45 - 55% dầu, 19 - 20% protein, 8 - 11% đường, 5% nước, 4 - 6% tro Thành phần acid hữu cơ chủ yếu của

dầu mè là 2 loại acid béo chưa no: acid oleic (C18 H34 O2): 45,3 - 49,4%, acid linoleic (C18 H32 O2): 37,7 - 41,2% (Nguyễn Tiến Mạnh, 1995)

2.4 Tình hình sản xuất mè trên Thế giới và Việt Nam

Về mặt sản xuất, cây mè có khả năng thích ứng rộng, dễ trồng, thời gian sinh trưởng ngắn, rất thích hợp trong việc thâm canh tăng vụ, nâng cao thu nhập trên một đơn vị diện tích đất, nhất là trên đất trồng lúa Nhu cầu dầu mè trên thế giới ngày càng tăng cũng tạo điều kiện tốt cho việc mở rộng trồng mè trong thời gian tới (Nguyễn Mạnh Chinh và Nguyễn Đăng Nghĩa, 2007)

Hiện nay, tuy với diện tích không nhiều, mè đã được trồng khắp các châu lục trên thế giới Sản lượng mè hàng năm trên thế giới theo FAO (2006) hơn 3 triệu tấn.Trong đó chủ yếu là châu Á chiếm gần 60%, còn lại là châu Mỹ, châu Phi Các nước trồng mè nhiều là Ấn Độ, Trung Quốc, Sudan, Mexico, sau đó là Myanmar, Thái Lan, Nigeria, Colombia Năng suất trung bình trên thế giới khoảng 0,3 - 0,4 tấn/ha Ở Mỹ năng suất mè vùng Texas lên tới 2 tấn Trung Quốc 1 tấn/ha Ở Trung Quốc, Thái Lan mè là cây có giá trị xuất khẩu cao (Nguyễn Mạnh Chinh và Nguyễn Đăng Nghĩa, 2007)

Bảng 2.1 : Diện tích, năng suất và sản lượng mè trên thế giới 1999

Quốc gia Diện tích

Nguồn: Tạ Quốc Tuấn và Trần Văn Lợt, 2006

Ở nước ta mè được trồng nhiều ở các tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long Miền Đông Nam Bộ và Trung Bộ (riêng tỉnh An Giang, diện tích trồng mè hiện nay tăng lên đến 16.000 ha) Mè được trồng lâu đời nhất là ở Miền Bắc, nhưng diện tích không mở rộng được vì điều kiện khí hậu và đất đai không thích hợp cho cây trồng phát triển

Theo Tổng cục thống kê năm 2004 diện tích trồng mè cả nước khoảng 40.800 ha, trong đó các tỉnh phía Nam 25.600 ha, phía Bắc 15.200 ha, vùng trồng

nhiều nhất là Bắc Trung Bộ (13.500 ha) Tổng sản lượng trung bình cả nước gần 21.000 tấn, năng suất trung bình cả nước khoảng 0,5 tấn/ha nhiều nhất ở các tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long 0,9 tấn/ha (Nguyễn Mạnh Chinh và Nguyễn Đăng Nghĩa, 2007) Tại vùng Châu Phú - An Giang, năng suất đạt từ 400 - 600kg/ha Nếu

áp dụng biện pháp thích hợp, năng suất mè có thể đạt 1 tấn/ha Các tỉnh đang trồng

mè nhiều ở Đồng Bằng Sông Cửu Long là: Cần Thơ (4.700 ha), Đồng Tháp (1.200 ha), An Giang (600 ha), Long An (400 ha) (Tạ Quốc Tuấn và Trần Văn Lợt, 2006)

2.5 Tổng quan về dầu thực vật và các acid béo

Acid béo là hợp phần cấu trúc của tất cả các lipid trong thiên nhiên Trong

mô bào, acid béo ở dạng tự do với số lượng không lớn và có thể chiết rút ra cùng với mỡ bởi các chất hoà tan mỡ Phấn lớn acid béo là monocarboxyl, có công thức chung là

R- COOHTrong các acid béo, căn cứ vào số nối đôi trong phân tử, người ta phân ra làm 3 loại: acid béo no (không có nối đôi), acid béo chưa no có một nối đôi và acid béo chưa no có nhiều nối đôi Loại acid béo no có nhiều trong thịt, lòng đỏ trứng, sữa và chế phẩm từ sữa (trừ loại sữa tách bơ), cùi dừa, cọ Loại acid béo có một nối đôi thường thấy ở cá mòi, lạc, dầu lạc, dầu ô liu Các acid béo no có vai trò quan trọng trong việc tạo và dự trữ năng lượng, tuy nhiên nếu ăn nhiều sẽ có khả năng tích lũy quá nhiều mỡ, gây hại cho cơ thể

Các loại acid béo có nhiều nối đôi hay còn được gọi là acid béo chưa no cần thiết do cơ thể người và động vật không tự tổng hợp được mà phải hấp thu qua thức

ăn Loại acid béo có nhiều nối đôi mà tiêu biểu là omega-6 (acid linoleic - có 2 nối đôi) và omega-3 (acid alinoleic - có 3 nối đôi) Acid béo chưa no phần lớn sẽ được

sử dụng vào cấu trúc tế bào và mô của cơ thể (Giáo trình sinh hoá, ĐH Quốc gia Tp HCM, 2003)

2.5.1 Acid béo omega 3

Về mặt cấu trúc hoá học acid béo thông thường chứa 3 loại nguyên tố: carbon, hydro và oxy Các nhà hóa học nhìn vào công thức acid béo có chuỗi carbon dài giống như con rắn, đầu là nhóm acid: - COOH (vì vậy mới gọi là acid béo) và đuôi là nhóm methyl: -CH3 Nhóm methyl đuôi có chứa carbon được gọi là carbon omega Khoảng cách từ carbon omega đến nối đôi gần nhất nếu có 3 carbon thì gọi là omega - 3 và acid béo có cấu trúc loại này gọi là acid omega - 3 Tóm lại, con số sau chữ omega nhằm chỉ vị trí của nối đôi trong cấu trúc Acid béo omega -

3 có nhiều ở trong mỡ cá ở vùng biển lạnh và sâu như cá Tuna, cá Salmon (chất lỏng lấy từ mỡ loại này ở nước ta quen gọi là dầu gan cá thu hay dầu cá thiên nhiên)

Hình 2.1 : Chu trình chuyển hoá tạo thành acid béo omega 3

(Nguồn: Fruit and vegetable technology, 2002)

Omega 3 hay còn được gọi là acid α-linolenic (ALA, C18:3;n-3) là acid béo không bão hòa (PUFA) có chức năng sinh lí đặc biệt cần thiết cho quá trình sinh trưởng và phát triển Ngày nay có nhiều nghiên cứu cho thấy omega 3 có tác dụng ngăn ngừa một số bệnh trên người, đặc biệt là bệnh xơ vữa đông mạch Omega 3 thực hiện các phản ứng tổng hợp kéo dài mạch và khử bão hoà tạo thành các acid eicosapentanoic (EPA, C20:5, n-3), docosapentaenoic (DPA, C22:5, n-3) và docosahexanoic (DHA, C22:6; n-3)

2.5.2 Các nguồn acid béo n-3

Acid béo n-3 là những acid béo có dấu nối đôi ở vị trí carbon thứ 3 kể từ gốc

methyl cuối cùng của chuỗi carbon

Nguồn thực vật

7,70 9,15 13,50 0,54 0,26 0,85 0,93 0,67 0,16 0,10 0,07

100,00 100,00 100,00 49,40 54,10 72,00 18,10 50,40 1,44 0,28 0,22

(Nguồn: Souci, Fachmann, Kraut: Food Composition and

Nutrition Tables, 5 Edition, 1994.)

* EPA và DHA

Dầu cá và các loại cá giàu chất béo chứa nhiều EPA và DHA n-3 PUFA chuỗi dài có nguồn gốc từ các sinh vật phù du biển Có sự đa dạng về thành phần acid béo trong cá ngoài tự nhiên vì sự đa dạng về mùa vụ và sự thay đổi nguồn thức

ăn (sinh vật phù du) Các loại cá chình, cá hồi nuôi trồng ở các trại thuỷ sản thường chứa ít EPA và DHA hơn so với khi chúng sống trong các điều kiện tự nhiên như ở biển, sông, hồ

Có sự khác biệt giữa dầu gan cá và dầu thịt Dầu gan cá thì giàu vitamin A, D

và chỉ chứa 13%-22% n-3 PUFA, trái lại dầu thịt cá (thường sản xuất từ cá hồi) chứa khoảng 20-30% EPA, DHA, chứa rất ít vitamin A và D

* Các nguồn acid béo n-3 khác

Các nguồn acid béo n-3 được khai thác hiện nay là ly trích từ các vi sinh vật đơn bào như tảo, nấm Thêm vào đó, vi khuẩn và tảo phân lập từ ruột cá cũng chứa nhiều EPA và DHA

Hiện nay, hai công ty Mỹ OmegaTech và Marker Biosciences đã phát triển

quy trình ly trích đặc hiệu để tạo ra dầu giàu DHA từ động vật, sinh vật phù du hoặc tảo

* Acid béo n-3 và sức khoẻ

Acid béo n-3 đóng một vai trò quan trọng trong việc ngăn ngừa và chữa trị một số bệnh kinh niên như: các loại bệnh ung thư, bệnh viêm nhiễm đường ruột, thấp khớp và có khả năng làm giảm nguy cơ bệnh xơ vữa động mạch (CVD) Acid béo n-3 giúp tăng cường sự phát triển trí não và chức năng sinh lí của trẻ em

Acid béo omega - 3 là tiền chất của DHA và EPA DHA (docosahexaenoic acid) là acid béo không no chuỗi dài có 22 carbon và chứa 6 nối đôi còn EPA là acid béo không no chuỗi dài có 20 carbon và chứa 5 nối đôi Trong cơ thể EPA được xem là acid béo thiết yếu sẽ chuyển hoá thành các chất sinh học quan trọng như prostaglandin, leucotrien

DHA là acid béo quan trọng trong việc tăng cường hoạt động trí não Từ các công trình nghiên cứu các nhà khoa học khuyến cáo nên dùng thực phẩm giàu acid omega -3 và DHA để đạt các lợi ích sau:

- Tác dụng lên não bộ và hệ thần kinh trung ương: thành phần của não là chất béo và DHA chiếm khoảng 1/4 lượng chất béo này Sữa mẹ được xem là chứa nhiều DHA trong khi sữa bò chứa rất ít mà DHA lại đóng vai trò rất quan trọng trong sự phát triển trí não của trẻ Vì vậy sữa mẹ luôn là tốt nhất đối với trẻ còn bú, đặc biệt là trẻ sơ sinh

- Tác dụng bảo vệ tim mạch: nhiều công trình nghiên cứu chứng tỏ DHA làm giảm lượng triglycerid máu, giảm loạn nhịp tim, làm giảm tỷ lệ bệnh động mạch vành, giảm chứng nhồi máu cơ tim Người ta nhận thấy người Eskimo hiếm bị bệnh động mạch vành (động mạch vành bị hẹp bít do cặn mỡ) và dân tộc này ăn rất nhiều

cá có chứa omega - 3 (từ năm 1963 đến 1967 toàn bộ người Eskimo ở vùng Greenland chỉ có 3 người bệnh động mạch vành)

- Đối với người thường xuyên uống rượu, sẽ giảm sự hấp thu và tiêu thụ acid omega - 3 (là chất bảo vệ thần kinh không bị suy thoái) nên nhiều tế bào thần kinh

bị hư hại đưa đến sa sút trí tuệ

Tuy nhiên, nếu dùng nhiều acid béo chưa no nhiều nối đôi thì cũng không lợi Sở dĩ như vậy là vì loại acid béo càng có nhiều nối đôi thì càng có tính oxy hoá mạnh Khi chuyển hoá trong cơ thể, đặc biệt là trong quá trình "đốt cháy" acid béo thành năng lượng làm tăng các gốc tự do trong cơ thể Nếu trong khẩu phần không

có đủ các chất chống oxy hoá như vitamin E, caroten.v.v thì các chất oxy hoá này lại gây hại cho cơ thể

Theo nhu cầu khuyến nghị cho người Việt Nam, năng lượng do lipid cung cấp hàng ngày cần chiếm khoảng 20% nhu cầu năng lượng của cơ thể, không vượt quá 30% nhưng cũng không được dưới 10% Các nhà sản xuất cũng cần cân nhắc khi bổ sung các acid béo chưa no vào sản phẩm của mình sao cho những chất bổ sung là thực sự cần thiết và an toàn cho người tiêu dùng

2.5.3 Biến đổi thành phần acid béo trong dầu dự trữ thực vật

Các cây trồng như: cải dầu, đậu phộng, hướng dương và mè có hàm lượng dầu chiếm khoảng 45% trọng lượng hạt Hầu hết dầu dự trữ được sử dụng cho nhu cầu con người chủ yếu như: bơ thực vật, trộn salad, dầu rán Chỉ một tỉ lệ nhỏ (khoảng 10%) được sử dụng trong công nghiệp dầu nhờn và chế tạo thuốc tẩy, sơn

Đôi khi dầu thực vật thiếu những thuộc tính hữu ích , ví dụ như: tỉ lệ acid béo bão hòa cao khi so sánh với các acid không bão hòa mong muốn, hoặc thuộc tính tan chảy sẽ góp phần làm giảm chất lượng khi giàn trải Có thể cải tiến những thuộc tính này trong dầu thông qua các chuỗi phản ứng hóa học như là: hydro hoá một phần sau đó cắt phân đoạn (Timms, 2005) Tuy nhiên phương pháp này tốn kém và thỉnh thoảng tạo ra những sản phẩm không mong muốn

Phát triển giống cây trồng tạo dầu với chất lượng thích hợp cho nhu cầu thương mại là giải pháp khả thi và tốt hơn so với sự biến đổi hóa học dầu thực vật Cách để đạt được đều này là thuần hóa cây dại, những cây có dầu với những thuộc tính mong muốn Tuy nhiên, những cây dại này đòi hỏi một thời gian dài (khoảng

20 năm) để thích ứng và cần phải có mô hình cơ giới nông nghiệp Đây là giới hạn lớn cho sự phát triển cây có dầu

Thành phần acid béo đã được biến đổi bằng biện pháp nhân giống truyền thống, sử dụng kỹ thuật lai hữu tính cũng như tạo đột biến ở nhiều giống cây trồng

Ví dụ tạo ra giống có hàm lượng acid oleic cao ở đậu nành, hướng dương, cải dầu

và đậu phộng (Burton và ctv, 2004) Mặc dù đã thành công nhưng phương pháp nhân giống truyền thống này dựa vào sự biến đổi xảy ra tự nhiên trong phạm vi một loài hoặc giống

2.6 Thành phần acid béo trong hạt mè

Mè là cây lấy dầu có hàm lượng và chất lượng tương đối cao so với nhiều loại cây trồng lấy dầu khác Hàm lượng dầu chiếm khoảng 34,4% đến 59,8% trọng lượng hạt (Ashri, 1989, 1998) Yếu tố di truyền (giống) và điều kiện môi trường ảnh hưởng đến hàm lượng dầu mè Các giống mè chín muộn có hàm lượng dầu cao hơn

những giống chín sớm (Yermanos và ctv, 1972) Vị trí trái trên cây cũng ảnh hưởng đến hàm lượng dầu, ví dụ như: hạt từ trái trên thân chính thì có hàm lượng dầu cao hơn những hạt ở ngọn và cành (Muthuswamy và Thangavelu, 1993) Giống mè hạt đen thường có hàm lượng dầu thấp hơn giống hạt nâu và trắng, điều này cho thấy có

sự tương quan liên kết giữa hàm lượng dầu và màu sắc của vỏ hạt Kamal-Eldin và Appelqvist (1994) cho rằng hàm lượng dầu trong hạt mè đen thấp là do hàm lượng sợi thô trong vỏ hạt mè cao Vỏ của hạt mè đen thường dày hơn vỏ của hạt mè có màu sáng hơn

Thành phần acid béo trong hạt biến đổi đáng kể tuỳ theo các giống mè khác nhau Có một số giống mè có hàm lượng acid oleic cao khác thường (> 60%) hoặc acid linoleic it (Baydar và ctv, 1999) Vị trí trái trên cây cũng có ảnh hưởng đến hàm lượng acid béo; palmitic, stearic, oleic có khuynh hướng tăng theo vị trí trái trên thân trong khi linoleic thì giảm (Brar, 1977) Thành phần acid béo bị ảnh hưởng mạnh mẽ bởi các yếu tố môi trường, hàm lượng linoleic acid tăng trong điều kiện khí hậu lạnh (Uzun và ctv, 2002)

Bốn acid béo chính yếu có trong dầu mè là: palmitic, stearic, oleic và linoleic, ngoài ra còn có một lượng nhỏ các acid béo khác: linolenic, vaccenic, eicosenoic, arachidic và behenic (Were và ctv, 2001) Hàm lượng oleic và linoleic gần bằng nhau, hợp thành khoảng 85% tổng lượng acid béo

*Lợi ích của dầu mè

Thành phần acid béo là yếu tố chính yếu quyết định chất lượng dầu ăn Dầu

có hàm lượng acid oleic cao, acid béo no thấp là loại dầu tốt cả về phương diện thương mại và giá trị dinh dưỡng Acid béo no gây nguy cơ cho bệnh tim mạch, trái lại các acid chưa no PUFAs (polyunsaturated fatty acids) có lợi cho sức khoẻ con người Dầu mè có hàm lượng acid no thấp (< 15%) và hàm lượng acid béo no đơn

và đa ngang nhau Giá trị dinh dưỡng của dầu mè là acid linoleic, acid béo này cần thiết cho con người

Những nghiên cứu gần đây cho thấy dầu mè có ít cholesterol vì thế làm giảm nguy cơ tăng huyết áp (Sankar và ctv, 2004) và có tác dụng giảm tỉ lệ mắc bệnh ung thư (Miyahara và ctv, 2001) Dầu mè có tác dụng tốt đến sức khoẻ con người là do dầu mè có hàm lượng acid béo no thấp và hoạt tính chống oxi hóa chủ yếu là sesamin Sesamin có tác dụng làm tăng hiệu lực và chức năng vitamin E (tocopherol) Nồng độ γ-tocopherol trong máu cao sẽ làm giảm nguy cơ bệnh tim mạch và bệnh ung thư đường ruột Vì vậy, dầu mè giúp gia tăng sức khoẻ cho người thông qua việc cải thiện hàm lượng vitamin E trong cơ thể (Frank, 2005)

2.7 Biến đổi thành phần acid béo trong mè

* Khía cạnh phân tử

Sự hiểu biết tường tận về các con đường chuyển hóa bao gồm sinh tổng hợp acid béo là điều kiện tiên quyết cho kỹ thuật di truyền nhằm biến đổi thành phần acid béo trong hạt

Gen mã hóa cho các enzyme tổng hợp acid béo đã được phân lập và mô Yukawa và ctv (1996) đã phân lập gen mã hóa enzyme khử bão hòa ∆9 stearoyl-ACP biểu hiện trong hạt Gần đây, gen mã hóa cho enzyme khử bão hòa ∆12 oleoyl-PC được tách dòng đồng thời bởi 2 nhóm nghiên cứu và được mô tả ở mè (Jin và ctv, 2001), cDNA của enzyme khử bão hòa ∆15 linoleoyl-PC đã được phân lập và công bố trên ngân hàng gen (GenBank Accession E12718)

Enzym FADs (fatty acid desaturase) : là enzym khử nối đơn thành nối đôi (desaturase) giữa các nguyên tử cacbon

Gen FAD3 mã hóa enzyme delta 15 desaturase Enzyme này chuyển hóa acid

linoleic (omega 6) thành linolenic (omega 3) thông qua việc hình thành nối đôi ở vị trí carbon 3 (tính từ mạch carbon gốc) Gen FAD3 đã được phân lập từ arabidopsis

và đậu nành

Bảng 2.3 : Những mục tiêu biến đổi gen ở dầu mè

Phương pháp Lợi ích/sử dụng

Mục tiêu

Giảm hoạt tính của enzyme β-ketoacyl, tăng biểu hiện của palmitoyl –ACP thioester

Giảm điều hòa stearoyl –ACP desaturase

Giảm điều hòa oleoyl –ACP desaturase

Tăng biểu hiện của enzyme khử bão hòa

∆12, ∆15

Giảm nhu cầu về hydro hóa, dầu nhờn, xà phồng, dầu thực vật

Giảm nhu cầu về hydro hóa, dầu thực vật, dược liệu, mỹ phẩm

Tăng tính ổn định của dầu, dược phẩm, mỹ phẩm, xà phồng, dầu rán

Cải thiện giá trị dinh dưỡng, dầu salad, mỹ phẩm, lớp phủ ngoài

Nguồn: Yukawa và ctv,1996; Jung và ctv, 2004

2.8 Các nghiên cứu chuyển gen trên cây mè

Mè là một trong những cây lấy dầu quan trọng trên thế giới Ngày nay, việc cải thiện giống cây trồng này bằng phương pháp lai tạo truyền thống đã được tiến hành rộng rãi Trong khi công cụ công nghệ sinh học rất có giá trị cho việc phát triển các giống mới ở phạm vi loài thì vẫn chưa được khai thác ứng dụng nhiều vì thiếu những phương pháp thích hợp Đưa vào cây mè một gen mà chức năng của nó được biết cho phép cải thiện những đặc tính mong đợi của người trồng mè như: chất

lượng dầu (làm tăng hàm lượng các acid béo chưa bão hoà), tính kháng của cây (kháng bệnh, kháng côn trùng)

Cải tạo mè bằng phương pháp chuyển gen gián tiếp sử dụng Agrobacterium đã

thực hiện nhưng chưa mang lại kết quả (Jin và ctv, 2005) Khó khăn chính trong việc tạo ra cây mè chuyển gen là khả năng tái sinh thấp Một nghiên cứu gần đây cho thấy đã thành công trong việc chuyển gen cây trồng này qua ống phấn (Rao và ctv, 2004) nhưng khả năng tin cậy của phương pháp này cần xem xét vì nó rất khó tái sinh ở một số cây trồng Vì thế cần phải phát triển một phương pháp chuyển gen hữu hiệu cho cây mè

Ngày này phương pháp chuyển gen in planta: thấm chân không (vacuum infiltration) ở thời kỳ cây con hoặc ra hoa; nhúng hoa với Agrobacterium mang gen

mong muốn đã được áp dụng thành công ở một số giống cây trồng Ví dụ đã tạo ra cây cỏ alfalfa (Trieu va ctv, 2000), cải thìa (Qing và ctv, 2000) chuyển gen bằng phương pháp thấm chân không

Phương pháp nhúng hoa đơn giản hơn thấm chân không ở chỗ thay thế bước hút chân không bằng cách thêm vào chất kết dính bề mặt trong môi trường nhúng hoa, đạt hiệu quả cao hơn so với thấm chân không

Hiệu quả chuyển gen bằng phương pháp nhúng hoa chịu ảnh hưởng lớn bởi một

số yếu tố như: giai đoạn phát triển của các nụ hoa, thành phần môi trường nhúng hoa, đặc biệt là nồng độ đường, chất kết dính bề mặt và số lần chủng (Clough và Bent, 1998)

2.9.2 Gen thông báo (reporter gene)

Thuật ngữ sự biểu hiện gen (gene expression) thường được dùng trong công tác lai tạo giống cây trồng (plant breeding), trong sinh học phân tử (molecular biology) hay lĩnh vực hoá sinh protein (protein biochemistry) Trong ngành lai tạo giống, sự biểu hiện gen được định nghĩa như là một đặc điểm về kiểu hình hay khả năng sinh trưởng phát triển tốt hơn (về năng suất, chất lượng) của cây trồng trên đồng ruộng Theo Jacobsen (2007), bất cứ phương pháp chuyển gen nào dù là

chuyển nạp gen gián tiếp bằng vi khuẩn Agrobacterium hay chuyển gen trực tiếp

bằng súng bắn gen vẫn cần một phương pháp tin cậy để xác định các tế bào đã nhận gen ngoại lai Với mục đích đó khi thiết kế plasmid, người ta đã sử dụng một hay nhiều gen thông báo Những gen thông báo đều mang chuỗi mã tổng hợp một loại

protein đặc biệt nào đó rất dễ phát hiện trong cây Người ta thường sử dụng gen gus của vi khuẩn E coli làm gen thông báo Gen này tổng hợp enzyme β–glucuronidase

có thể phân giải hợp chất X–gluc (5–bromo–4–chloro–3–indolyl-β–D–glucuronide) tạo thành sản phẩm thủy phân có màu xanh chàm đặc trưng

Một nhóm gen thông báo khác rất chuyên biệt đối với cây ngũ cốc bao gồm các thể activator có tính chất chuyển mã Các thể này điều tiết sự biến dưỡng của

anthocyanin trong cây bắp, ví dụ như R (Ludvig và ctv, 1989), B – Peru (Chandler

và ctv, 1988), C1 (Paz – Ares và ctv, 1987) (trích dẫn bởi Bùi Chí Bửu và Nguyễn

Thị Lang, 2004) Khi những gen này hoạt động sẽ sản sinh ra sắc tố anthocyanin

làm cho tế bào có màu sắc và ta có thể quan sát bằng mắt thường, những màu sắc này rất bền vững (Ludvig và ctv, 1990; Bowen, 1992) (trích dẫn bởi Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004)

2.9.3 Các chỉ thị chọn lọc (selectable marker)

Sau quá trình chuyển gen, cần phải tiến hành chọn lọc để tách riêng các tế bào đã nhận gen mục tiêu và cho vào môi trường tái sinh Thông thường, một plasmid được sử dụng trong chuyển nạp gen sẽ mang các thành phần gen thông báo, chỉ thị chọn lọc và gen mục tiêu Khi các chỉ thị chọn lọc thể hiện, chúng sẽ giúp tế bào tiếp tục sinh trưởng trong môi trường chọn lọc (selective media) thường chứa chất kháng sinh hay thuốc diệt cỏ Các chỉ thị chọn lọc phổ biến hiện nay là gen

nptII mã hóa enzyme neomycin phospho transferase II Enzyme này sẽ xúc tác quá

trình phosphoryl hóa kháng sinh kanamycin và làm bất hoạt kháng sinh này Một

chỉ thị chọn lọc phổ biến khác là gen hph mã hóa enzyme hygromycin phospho transferase có tác dụng làm bất hoạt kháng sinh hygromycin Gen hph tỏ ra rất hữu

hiệu trên cây bắp (Walters và ctv, 1992), cây lúa (Christon và ctv, 1991; Li và ctv, 1993) (trích dẫn bởi Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004)

Hình 2.2: Thành phần của một gen chuyển nạp

(Nguồn: Theo Pighin, 2003)

2.10 Các vector

Plasmid trong Agrobacterium là công cụ tham gia trực tiếp và có vai trò cực

kỳ quan trọng trong việc đưa gen lạ vào trong tế bào thực vật do đó từ plasmid hoang dại, người ta đã cố gắng cải tiến plasmid này sao cho nó hoạt động hiệu quả nhất Hiện nay có 2 loại vector chính dùng trong phương pháp chuyển gen này

2.10.1 Vector đồng nhập (cointergrating vector)

Trước tiên cần loại bỏ các gen giữ chức năng tạo khối u không có lợi cho thực vật trên plasmid, sau đó người ta gắn thêm vào các gen chọn lọc, gen chỉ thị, các promoter cần thiết cho gen mục tiêu biểu hiện và các promoter giúp cho plasmid

nhân lên được trong tế bào E.coli và Agrobacterium Cụ thể như sau:

- Vùng polylinker có nhiều vị trí cắt giới hạn cho phép chèn vào các gen mục tiêu muốn đưa vào thực vật và vùng bờ trái và bờ phải của plasmid được bao bọc bởi 25 cặp base lặp lại

- Gen chọn lọc chứa các gen kháng sinh hoặc thuốc diệt cỏ v.v dùng để chọn lọc các cá thể đã được chuyển gen

- Gen kháng kháng sinh nằm ngoài vùng T-DNA giúp chọn lọc các tế bào vi khuẩn có mang plasmid (Monica, 1996)

2.10.2 Vector hai nguồn (binary vector)

Vector này nhỏ hơn vector đồng nhập, ưu điểm của nó là cho phép plasmid

tồn tại lâu hơn trong tế bào E.coli lẫn Agrobacterium Hệ thống này có các vùng

khởi đầu sao chép (origin of replication) có khả năng tự sao chép trong

Agrobacterium và E.coli

- Đầu tiên là một Ti-plasmid hoang dại có mang gen vir nhưng không có vùng T-DNA còn gọi là helper plasmid

- Plasmid thứ 2 có các gen auxA, auxB và cyt trong vùng T-DNA của

plasmid hoang dại đã được lấy ra khỏi vùng T-DNA sau đó chèn thêm vùng để gắn gen mục tiêu (MCS-multi cloning site) với nhiều vị trí cắt giới hạn Các gen chọn lọc thực vật chuyển gen như gen kháng kanamycin, hygromycin cũng được đưa vào vùng T-DNA Những gen kháng này có nguồn gốc từ vi khuẩn nhưng nó được biến thành các gen kháng thực vật bằng cách gắn thêm đoạn gen tín hiệu của thực vật như các promoter hay những đoạn được polyadenine hoá để các gen này được biểu hiện Vector này còn được chèn thêm những gen cần thiết cho mục tiêu của thí nghiệm biến nạp trong đoạn T-DNA như các gen chỉ thị: GFP, GUS v.v Các gen

nằm trong vùng T-DNA được sắp xếp theo cách hợp lí nhất để tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình chuyển và biểu hiện trong cây Gen mục tiêu thường nằm ở bờ phải, ngược lại các gen đánh dấu (marker) lại được xếp gần bờ trái Vùng trung tâm của T-DNA là một promoter kép được tạo dòng theo hướng ngược nhau giúp làm giảm ảnh hưởng của các DNA xung quanh trong bộ gen thực vật lên sự biểu hiện của gen mục tiêu (Benad và John, 1993)

2.11 Các phương pháp chuyển nạp gen phổ biến

Các phương pháp đã sử dụng thành công: súng bắn gen, chuyển gián tiếp qua

vi khuẩn Agrobacterium Hiệu quả của phương pháp tùy thuộc vào loài được chuyển, ví dụ chuyển bằng phương pháp vi khuẩn Agrobacterium thì hầu như được

áp dụng ở cây hai lá mầm Quy trình chuyển gen đã được phát triển cho các loại cây trồng lấy dầu chính bao gồm: cây cải dầu (Khan và ctv, 2003), đậu nành (Ko và ctv, 2004), hướng dương (Hewezi và ctv, 2002), bông vải (Leelavathi và ctv, 2004 ) và đậu phộng (Egning và ctv, 1998)

Chuyển gen bằng phương pháp gián tiếp qua vi khuẩn Agrobacterium có một

số thuận lợi hơn so với các phương pháp chuyển gen trực tiếp Ở các phương pháp chuyển gen trực tiếp, số lượng bản copy chuyển vào thấp dẫn đến một số vấn đề như sự im lặng và không ổn định của gen chuyển vào Thêm vào đó, những tế bào đơn được hình thành và cây trồng được tái sinh, giới hạn khả năng hình thành thực vật bi khảm thường gặp khi sử dụng phương pháp chuyển gen trực tiếp (Enri'quez-Obrego'n và ctv, 1998)

Ngoài ra có rất nhiều dòng Agrobacterium khác nhau để lựa chọn, từ đó có

rất nhiều khả năng cho việc chuyển gen vào cây trồng Mức độ độc của

Agrobacterium tuỳ thuộc vào nhiễm sắc thể của vi khuẩn (chromosomal

background) và Ti-plasmid mà vi khuẩn đó mang (Hellens và ctv, 2000) Những dòng vi khuẩn với nhiễm sắc thể nền là C58: GV2260 (octopine), GV3101(nopaline), EHA 101 (nopaline) và EHA105 (succinamopine) có tính độc cao so với các dòng khác

Một hạn chế chính của việc áp dụng phương pháp Agrobacterium là tái sinh

cây từ nuôi cấy mô Điều này rất khó cho một số cây trồng trong đó có mè Vì vậy,

phương pháp chuyển gen bằng Agrobacterium không nên áp dụng với những cây

trồng không có khả năng tái sinh từ nuôi cấy mô

Những cây trồng khó tái sinh có thể chuyển gen bằng các phương pháp in

planta vì các phương pháp này không cần bước nuôi cấy mô Các phương pháp in planta như: ủ hạt với Agrobacterium (Feldmann và marks, 1987), sự thấm chân

không cây con hoặc cây đang nở hoa (Trieu và ctv, 2000), nhúng hoa (Clough và Bent, 1998), gần đây thì áp dụng phương pháp đưa DNA vào vòi nhuỵ của những hoa đã thụ phấn (Shou và ctv, 2002) Trong tất cả các phương pháp này thì phương pháp thấm hoa là thành công nhất và hứa hẹn sẽ được ứng dụng rộng rãi cho nhiều loài cây trồng khác nhau

Nhìn chung mỗi phương pháp chuyển gen đều có các ưu nhược điểm riêng

Ví dụ phương pháp chuyển gen PEG có thể chuyển trực tiếp gen mục tiêu vào tế

bào trần (protoplast) hay chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens qua

mẫu lá thực vật còn có những hạn chế vì tế bào phải trải qua quá trình tái sinh thông qua kỹ thuật nuôi cấy mô Trong thực tế, có nhiều loài thực vật rất khó tái sinh hoặc các tế bào nuôi trong môi trường tái sinh thường phát sinh các biến dị sôma và biến

dị nhiễm sắc thể không mong muốn Phương pháp sử dụng súng bắn gen thường được áp dụng đối với những thực vật không phải là đối tượng xâm nhiễm của

Agrobacterium tumefaciens hay những đối tượng khó tái sinh Phương pháp này có

thể áp dụng trên cây trưởng thành, trên tế bào mầm (germ line cells) ở phát hoa Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp này là đòi hỏi những máy móc đắt tiền và quy trình bắn gen phải được thiết lập rất nghiêm ngặt

2.11.1 Chuyển nạp gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens (A tumefaciens) và Agrobacterium rhizogenes

là hai vi khuẩn gây bệnh bướu cho thực vật đã được biết và nghiên cứu từ lâu Tuy nhiên người ta lại chú nghiên cứu và khai thác khả năng sử dụng chúng ở khía cạnh

khác đó là sử dụng như một vector mang các gen ngoại lai để chuyển vào tế bào

thực vật A tumefaciens được sử dụng phổ biến hơn cả

* Cơ chế

A tumefaciens có mang một plasmid sao chép độc lập với bộ gen vi khuẩn

đó là Ti-plasmid có kích thước khoảng 200 kb, trên plasmid hoang dại này có các vùng:

- Vùng T-DNA: vùng này được giới hạn bằng các trình tự lặp lại và bảo tồn

ở hai đầu gọi là bờ phải và trái, vùng này chứa các gen mã hoá cho auxin, cytokinin

và opine Đây là vùng được chuyển và gắn vào bộ gen của tế bào thực vật khi vi khuẩn xâm nhiễm, trong đó bờ phải là nơi cần thiết cho quá trình chuyển T-DNA vào genome thực vật

- Gen vir: Vùng DNA này phụ trách khả năng lây nhiễm của vi khuẩn như

tạo ra các protein đặc biệt Vùng này có các gen vir E 2 , vir D, vir D 2 v.v

- Vùng ori giúp cho sự khởi đầu sao chép của plasmid

- Vùng gen điều khiển tổng hợp opine

Hình 2.3 : Ti-plasmid của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

(Nguồn: http://en.wikipedia.org/wiki/Ti_plasmid)

Khi sử dụng A tumefaciens làm công cụ cho biến nạp gen vào thực vật,

Ti -plasmid này cũng được cải tiến nhiều mặt cho phù hợp với nhu cầu (Nguyễn Văn Uyển, 1996)

Gen virA và gen virB được biểu hiện trong suốt thời kỳ phát triển bên ngoài của Agrobacterium nhưng một số gen vir khác sẽ được các hợp chất phenolic của vết thương kích thích Sản phẩm của gen virA có mặt ở màng trong của tế bào vi

khuẩn và Acetosyringone tạo ra các quá trình phosphoryl hoá protein này Sản

phẩm đã phosphoryl hoá của gen virA làm phosphoryl hoá sản phẩm của virC giúp chúng trở nên hoạt động, từ đó kích thích sự phiên mã của tất cả các gen vir khác

Tiếp theo là giai đoạn chuyển đoạn T-DNA vào trong tế bào thực vật Gen

virD với 4 khung đọc mã hoá cho các endonuclease Phức hợp protein của gen virD1, virD2, virD3 bám lên vùng lặp lại của bờ phải vùng T-DNA, trong đó

protein của gen virD2 tạo liên kết cộng hoá trị với đầu 5' của đoạn DNA sợi đơn, từ

đó tổng hợp để trả lại đoạn T-DNA mạch đôi Protein của gen virE2 gắn với đoạn

T-DNA sợi đơn đang tách ra khỏi sợi đôi nhờ đó đoạn DNA tách ra này được bảo

vệ trong suốt quá trình chuyển vào trong tế bào thực vật

Cùng lúc đó, sản phẩm của gen virB tạo ra một kênh protein (export apparatus) trên màng tế bào vi khuẩn giúp cho đoạn T-DNA được đưa ra ngoài để xâm nhiễm vào tế bào và gắn vào bộ gen của thực vật (John và Sutton, 1997)

Ngoài ra còn có một số gen khác cũng tham gia vào quá trình xâm nhiễm của

Agrobacterium đó là gen chvA và chvB, các gen này không có trên Ti-plasmid

nhưng có trên chromosome của vi khuẩn, chúng cần để vi khuẩn đi qua được vách của tế bào thực vật Gen chvB mã hóa cho vòng β-1,2 glucan trong khi chvA giúp vận chuyển sản phẩm này vào trong tế bào chất Tuy nhiên vai trò của các hợp chất này cũng chưa thực sự được biết rõ (Nguyễn Đức Lượng, 2002)

* Các chủng vi khuẩn

Agrobacterium là vi khuẩn gây ra bệnh bướu trên thực vật 2 lá mầm Năm

1970 khi ngành sinh học phát triển mạnh thì người ta đã khám phá ra một đặc tính

khác là A tumefaciens có khả năng đưa một đoạn gen của mình vào trong tế bào

thực vật

Hiện nay chuyển gen gián tiếp bằng Agrobacterium được sử dụng rộng rãi

và hiệu quả khá cao

Agrobacterium gồm có 4 loài: A radiobacter, A rhizogenes, A.rubi và

A tumefaciens Mỗi loài được chia thành 4 biovar dựa vào nguồn carbonhydrate

mà chúng sử dụng và các test về sinh lí, sinh hoá Những biovar còn khác nhau về các gen nằm trên nhiễm sắc thể vòng sợi đơn (Kevan và Michael, 1995)

A tumefaciens là một vi khuẩn đất, hình que, gram âm, không tạo bào tử, di

động Chúng thường có mặt trên bề mặt rễ cây và sử dụng các chất dinh dưỡng thoát ra từ đây Khả năng gây bệnh bướu trên cây không nằm trong bộ gen vi khuẩn

mà nằm trong một plasmid đặc biệt gọi là Ti-plasmid

Các dòng A tumefaciens khác nhau sẽ chứa những Ti-plasmid tạo ra các loại

opine khác nhau, phổ biến nhất là A tumefaciens C58 có Ti-plasmid mã hoá cho

sản phẩm nopaline và agrocinopine A Một số dòng plasmid khác lại mã hoá cho octopine và agropine

Các dòng Agrobacterium sử dụng phổ biến trong chuyển gen: GV2260,

EHA105, LBA4404, GV3101, MP90, AGL-1 ( Kevan và Michael, 1995)

Phương pháp chuyển gen bằng Agrobacterium tumefaciens không làm ảnh

hưởng đến các bộ phận được chuyển gen và các bộ phận này vẫn có thể sống và phát triển bình thường sau quá trình đồng nuôi cấy với vi khuẩn Quá trình chuyển nạp được xem là thành công khi có sự biểu hiện của các gen thông báo và chỉ thị chọn lọc trong các mô thực vật Tần số chuyển nạp từ vi khuẩn vào tế bào thường phụ thuộc rất lớn vào loài thực vật, các điều kiện sinh trưởng, giai đoạn sinh trưởng của thực vật Tần số này còn phụ thuộc vào môi trường nuôi vi khuẩn và mật độ vi khuẩn trong môi trường xâm nhiễm (infiltration medium) Cuối cùng tiến hành chọn lọc tế bào mang gen chuyển nạp thông qua biểu hiện của gen thông báo, chỉ thị chọn lọc và gen mục tiêu, sau đó cho vào môi trường tái sinh ta sẽ thu được các cây chuyển gen

2.11.2 Chuyển nạp gen bằng phương pháp PEG (polyethylene glycol)

Phương pháp PEG được sử dụng để chuyển nạp gen trên cả động vật lẫn thực vật Phương pháp này chuyển nạp gen vào tế bào trần dưới dạng plasmid DNA dựa trên nguyên tắc PEG làm kích hoạt sự dung hợp tế bào trần từ đó tạo khả năng du nhập gen lạ vào tế bào Cao và ctv (1991) đã sử dụng nguồn tế bào trần từ ba giống lúa Pi 4, Taipei 309 và Nipponbare trong thí nghiệm chuyển gen bằng phương pháp PEG, kết quả là đã thu được những tế bào trần mang các gen chuyển nạp (trích dẫn bởi Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004)

2.11.3 Chuyển nạp gen bằng phương pháp xung điện (electroporation)

Nguyên tắc của phương pháp này là sử dụng xung điện với thời gian cực ngắn trong một điện trường cực mạnh để làm tăng khả năng xâm nhập của DNA cần chuyển vào tế bào trần (Nagara, 1989) (trích dẫn bởi Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004) Phương pháp này được sử dụng trong chuyển nạp gen trên cả động vật, thực vật và vi sinh vật Phương pháp này hiện nay ít được quan tâm vì còn nhiều khó khăn chưa giải quyết được Tuy nhiên, người ta cũng đã ghi nhận những trường hợp chuyển gen thành công trên cây lúa (Toriyama và ctv, 1988; Zhang và ctv, 1988; Shimamoto và ctv, 1989), trên cây bắp (Rhodes và ctv, 1988) và trên cây

Brassica napus (Guerche và ctv, 1987) (trích dẫn bởi Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị

Lang, 2004)

2.11.4 Chuyển nạp gen bằng phương pháp bắn gen (biolistic)

Đây là phương pháp chuyển nạp gen trực tiếp vào cây trồng Phương pháp này được John Stanford ở Đại học Cornell phát minh (Klein và ctv, 1987) (trích dẫn bởi Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004)

Theo Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang (2004) trong quy trình bắn gen trước tiên bột vàng hoặc tungsten sẽ được phủ lớp DNA mục tiêu trên bề mặt và được gắn lên viên đạn plastic Khi bắn, viên đạn phóng xuống tấm chắn tạo ra một lực phóng các hạt vàng (hay tungsten) túa ra trên rây lưới kim loại với một vận tốc lớn xuyên

vào tế bào Mô được bắn xong sẽ được chuyển vào môi trường tái sinh có bổ sung các chất chọn lọc thích hợp Mô nhận gen sẽ xuất hiện mô sẹo sau 5 – 7 ngày nuôi cấy còn các mô không nhận gen sẽ chết trong môi trường chọn lọc

2.12 Tình hình nghiên cứu cây trồng chuyển gen ở Việt Nam và trên Thế giới 2.12.1 Tình hình nghiên cứu cây trồng chuyển gen ở Việt Nam

Ở Việt Nam các nghiên cứu về chuyển gen trên thực vật còn nhiều hạn chế, các công trình nghiên cứu công bố chưa nhiều

Lê Tấn Đức và ctv (2003) – Viện Sinh học Nhiệt đới đã chuyển gen crylA

kháng sâu xanh Heliothis armigera vào cây hông (Paulownia fortunei) Dòng vi

khuẩn được sử dụng là EHA105 chứa plasmid pITB, trên plasmid còn mang 1 gen bar kháng thuốc trừ cỏ Basta, gen chỉ thị gusA

Trần Thị Dung và ctv (2006) đã thực hiện thành công quy trình chuyển gen

trên giống thuốc lá K326 bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens dòng EHA 105 Plasmid được sử dụng mang tên pITB2 mang gen cryIA(c) (gen Bt) kháng sâu thuộc

bộ cánh vảy Lepidoptera, gen bar kháng hoạt chất trừ cỏ phosphinothricin (PPT) và gen gus được dùng làm gen chỉ thị

Một số kết quả nghiên cứu của Viện Công nghệ Sinh học từ năm 1993-2008 (Công trình khoa học -http://www.ibt.ac.vn)

Xây dựng và hoàn thiện các qui trình chuyển gen cho các đối tương thực vật và tạo

cây trồng chuyển gen

- Đã xây dựng được quy trình chuyển gen vào một số cây trồng như lúa, thuốc lá, bông, đu đủ, khoai lang, cà chua, cây xoan, đậu tương, cây cam sành, quýt đường canh

- Đã tạo được nhiều dòng cây chuyển gen làm nguyên liệu để tạo giống cây chuyển gen khác nhau như: các dòng lúa giống C71 chuyển gen CryIA(c) đã được kiểm nghiệm trên ruộng thí nghiệm và chứng tỏ khả năng kháng sâu đục thân rất