Nghiên cứu xây dựng quy trình chuyển gen vào cây hoa lily sorbone nhờ vi khuẩn agrobacterium tumefaciens

Sau một quá trình thực hiện ñề tài tốt nghiệp tại Viện Sinh học Nông nghiệp, Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội, ñược sự giúp ñỡ tận tình của các thầy cô giáo, các cán bộ của Viện cùng với sự nỗ lực và cố gắng của bản thân, ñến nay tôi ñã hoàn thành xong ñề tài tốt nghiệp của mình. - Trước tiên tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thị Lý Anh - Viện trưởng Viện Sinh học Nông nghiệp, Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội, người ñã trực tiếp hướng dẫn và giúp ñỡ tôi rất nhiều trong suốt thời gian tôi thực hiện ñề tài tốt nghiệp, cũng như thời gian tôi hoàn thành bản luận văn này.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-


     -

HOÀNG TÙNG

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHUYỂN GEN VÀO

CÂY HOA LILY SORBONE BẰNG VI KHUẨN

Agrobacterium tumefaciens

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

Chuyên ngành: TRỒNG TRỌT

Mã số : 60.62.01 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS NGUYỄN THỊ LÝ ANH

HÀ NỘI - 2009

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……… i

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan rằng số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này

là hoàn toàn trung thực và chưa ñược sử dụng ñể bảo vệ một học vị nào Mọi

sự giúp ñỡ cho việc hoàn thành luận văn này ñều ñã ñược cảm ơn Các thông tin, tài liệu trong luận văn này ñã ñược ghi rõ nguồn gốc

Tác giả

Hoàng Tùng

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệpẦẦẦ ii

LỜI CẢM ƠN

Sau một quá trình thực hiện ựề tài tốt nghiệp tại Viện Sinh học Nông nghiệp, Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội, ựược sự giúp ựỡ tận tình của các thầy cô giáo, các cán bộ của Viện cùng với sự nỗ lực và cố gắng của bản thân, ựến nay tôi ựã hoàn thành xong ựề tài tốt nghiệp của mình

- Trước tiên tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thị Lý Anh - Viện trưởng Viện Sinh học Nông nghiệp, Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội, người ựã trực tiếp hướng dẫn và giúp ựỡ tôi rất nhiều trong suốt thời gian tôi thực hiện ựề tài tốt nghiệp, cũng như thời gian tôi hoàn thành bản luận văn này

- Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong bộ môn CNSH Thực vật - SHPT và CN Vi sinh ựã ựóng góp nhiều ý kiến giúp tôi thực hiện ựề tài

- Tôi xin chân thành cảm ơn Ks Nguyễn Thị Thanh Phương, Ks Hồ Thị Thu Thanh và toàn thể các cán bộ của Viện Sinh học Nông nghiệp Ờ Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội ựã luôn giúp ựỡ tôi khi tôi thực hiện ựề tài tại Viện Nhân ựây tôi xin trân trọng cảm ơn ban chủ nhiệm khoa Nông học, Viện đào tạo Sau ựại học cùng tất cả các thầy cô giáo, gia ựình và bạn bè ựã giúp tôi hoàn thành ựề tài này

Hà Nội, tháng 10 năm 2009

Tác giả

Hoàng Tùng

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……… iii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……… iv

MỤC LỤC 1 MỞ ðẦU 1 1.1 ðặt vấn ñề 1

1.2 Mục ñích- yêu cầu 2

1.2.1 Mục ñích: 2

1.2.2 Yêu cầu 2

1.3 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn 2

1.3.1 Ý nghĩa khoa học 2

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn 2

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1 Kỹ thuật chuyển gen vào thực vật 3

2.1.1 Khái niệm về Kỹ thuật chuyển gen 3

2.1.2 Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 4

2.1.2.1 Cơ sở khoa học về khả năngchuyển gen ở thực vật 4

Một số nguyên tắc sinh học 4

2.1.2.2 Phản ứng của tế bào với quá trình chuyển gen 5

2.1.2.3 Các bước cơ bản của chuyển gen 6

2.1.2.4 Các phương pháp xác ñịnh cây chuyển gen 8

2.1.3 Khả năng chuyển nạp gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 10

2.1.3.1 Ti-plasmid 12

2.1.3.2 Chức năng của T-DNA 12

2.1.3.3 Chức năng của gen Vir 14

2.1.3.4 Cơ chế lây nhiễm 17

2.1.3 Tiềm năng ñóng góp của cây trồng biến ñổi gen 21

2.1.4 Giá trị cây trồng biến ñổi gen trên toàn cầu 22

2.1.5 Tình hình chung về phát triển cây trồng biến ñổi gen tại Việt Nam 23

2.1.5.1 Những chính sách và kế hoạch phát triển cây trồng biến ñổi gen ở Việt Nam 23

2.1.5.2.Nghiên cứu tạo cây trồng biến ñổi gen ở Việt Nam 23

2.2 Chuyển gen trên cây hoa lily 25

2.2.1 Giới thiệu về cây hoa lily 25

2.2.1.1 Nguồn gốc và phân loại 25

2.2.1.2 ðặc tính sinh vật học cây hoa lily 25

2.2.1.3 Giá trị sử dụng và giá trị kinh tế 26

2.2.2 Nghiên cứu tái sinh và chuyển gen ở cây hoa lily 27

2.2.2.1 Các nghiên cứu về cây hoa lily trên thế giới 27

2.2.2.2 Các nghiên cứu ở Việt Nam 29

3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 3.1 ðối tượng, vật liệu, ñịa ñiểm và thời gian nghiên cứu 30

3.1.1 ðối tượng 30

3.1.2 Vật liệu 31

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……… v

3.1.3 ðịa ñiểm, thời gian 32

3.2 Nội dung nghiên cứu và phương pháp nghiên cứu 32

3.2.1 Các phương pháp nghiên cứu sử dụng: 32

3.2.2 Các chỉ tiêu theo dõi 34

3.2.3 Thí nghiệm 1: Thí nghiệm về xác ñịnh ngưỡng PPT chọn lọc 36 3.2.4 Thí nghiệm 2: Thí nghiệm về xác ñịnh nồng ñộ cefotacime diệt khuẩn 36

4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 39 4.1 Ảnh hưởng của chất chọn lọc PPT 39 4.2 Ảnh hưởng của kháng sinh Cefotacime ñến tỷ lệ sống và khả năng tái sinh callus 41

4.3 Ảnh hưởng của nguồn mẫu cấy ñến khả năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumefasciens 42

4.4 Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm mẫu ñến khả năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumefasciens 43

4.5 Ảnh hưởng của phương thức lây nhiễm ñến khả năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumefasciens 46

4.6 Ảnh hưởng của thời gian tiền nuôi cấy ñến khả năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumefasciens 47

4.7 Ảnh hưởng của thời gian ñồng nuôi cấy ñến khả năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumefasciens 49

4.8 Ảnh hưởng của những véc tơ mang gen chuyển nạp 51

4.9 Kiểm tra sự có mặt của gen chuyển vào bằng phương pháp PCR 54

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……… vi

Bảng 4.2. Ảnh hưởng của kháng sinh Cefotacime ñến tỷ lệ

sống và khả năng tái sinh năng tái sinh callus lily

“Sorbone”

40

Bảng 4.3. Ảnh hưởng của nguồn mẫu cấy ñến khả năng

chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium

tumefasciens

42

Bảng 4.4. Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm mẫu ñến khả

năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium

tumefasciens

43

Bảng 4.5. Ảnh hưởng của thời gian tiền nuôi cấy ñến khả

năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium

tumefasciens

45

Bảng 4.6. Ảnh hưởng của thời gian ñồng nuôi cấy ñến khả

năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium

tumefasciens

47

Bảng 4.7. Ảnh hưởng của phương thức lây nhiễm ñến khả

năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium

tumefasciens

49

Bảng 4.8. Ảnh hưởng của các véc tơ chuyển gen nhiễm ñến

khả năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium

tumefasciens

50

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……… vii

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Một số khối u do vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens tạo

ra A: một khối u rất lớn hình thành trên thân cây hoa

Hồng, B: một dãy khối u nằm trên nhánh của cây Nho

10

Hình 2.2 Một khối u do vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens tạo ra 11 Hình 2.3 Quá trình tạo phức hợp sợi ñơn T-DNA 17 Hình 2.4 Quá trình kết nạp T-DNA vào bộ gen của tế bào cây 19 Hình 2.5 Mô hình chuyển nạp T-DNA từ tế bào vi khuẩn vào tế bào

cây

20

Hình 3.1 Sơ ñồ cấu trúc plasmid ITB2c 40 31 Hình 4.1 Ảnh hưởng Lily chết ở nồng ñộ PPT ñạt 5 mg/l 39 Hình 4.2 Biểu ñồ biểu diễn sự ảnh hưởng của nồng ñộ PPT ñến khả

năng tái sinh mô c lus Liy Sorbone y

39

Hình 4.3 Biểu ñồ biểu diễn sự ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm

mẫu ñến tỷ lệ sống sau lây nhiễm, sau chọn lọc và tỷ lệ mẫu

tái sinh

44

Hình 4.4 Ảnh hưởng của thời gian tiền nuôi cấy ñến khả năng

chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumefasciens

48

Hình 4.5 Mẫu chuyển gen tái sinh chồi trên môi trường chọn lọc 51

Hình 4.7 Kết quả ñiện di sản phẩm PCR của các dòng Lily Sorbone

Hình 4.8 Sơ ñồ thể hiện quy trình chuyển gen cho hoa Lily Sorbone 55

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……… 1

1 MỞ ðẦU

1.1 ðặt vấn ñề

Trong nhiều năm qua, hoa lily luôn ñược ñánh giá là một loại hoa cao cấp, có giá trị kinh tế cũng như giá trị xuất khẩu cao Nhu cầu về loại hoa này trên thị trường hoa trong nước và trên thế giới là rất lớn Vì thế, loại hoa này hiện ñang rất ñược quan tâm và chú trọng phát triển

Tuy nhiên ñiều kiện khí hậu nóng ẩm, mưa nhiều của nước ta tạo ñiều kiện cho rất nhiều các loại sâu bệnh hại phát triển và ñây là một trong những yếu tố hạn chế chủ yếu ñến sản xuất nông nghiệp, trong ñó có cây hoa Cùng với việc mở rộng diện tích và tăng cường về thành phần các giống hoa mới là

sự kéo theo của hàng loạt các loại sâu bệnh hại làm giảm năng suất, phẩm chất, giá trị thẩm mỹ và thương phẩm của cây hoa ðặc biệt, môi trường của các vùng trồng hoa bị ô nhiễm nghiêm trọng do người sản xuất sử dụng thái quá các thuốc bảo vệ thực vật hóa học Chính vì thế, việc chọn tạo ra các giống cây hoa có khả năng kháng sâu bệnh là một nhu cầu cấp thiết của thực tiễn Ngày nay, công nghệ chuyển gen cho phép nhà tạo giống cùng lúc ñưa vào một loài cây trồng những gen mong muốn có nguồn gốc từ những cơ thể sống khác nhau, không chỉ giữa các loài có họ gần nhau mà còn ở những loài rất xa nhau, từ ñó chuyển ñược các gen mong muốn tạo ra các ñặc tính mới lạ (mầu sắc, cấu trúc hoa, hơng thơm, tuổi thọ của hoa cắm, các ñặc tính kháng sâu và bệnh hại, chống chịu với ñiều kiện bất thuận…)

Chính vì vậy chúng tôi thực hiện ñề tài:“Nghiên cứu xây dựng quy trình

chuyển gen vào cây hoa lily Sorbonne nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens” nhằm góp phần ñẩy mạnh hướng nghiên cứu về tạo giống cây

trồng bằng kỹ thuật gen ở nước ta

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệpẦẦẦ 2

1.2 Mục ựắch- yêu cầu

1.2.1 Mục ựắch:

- Xác ựịnh các thông số kĩ thuật cho các bước trong qui trình chuyển

gen mục tiêu nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens, làm cơ sở cho việc

tạo cây chuyển gen mang các ựặc tắnh mong muốn

- đánh giá sự biểu hiện của các gen sau chuyển nạp

1.3 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn

1.3.1 Ý nghĩa khoa học

Kết quả nghiên cứu của ựề tài cho thấy khả năng có thể chuyển ựược gen vào cây hoa lily Sorbonne, một loại cây thuộc nhóm một lá mầm bằng vi

khuẩn Agrobacterium tumefaciens đồng thời, các thông số kĩ thuật ựã xác

ựịnh ựược sẽ làm cơ sở cho việc tiếp tục chuyển các gen mong muốn khác vào cây hoa lily Sorbonne nói riêng và các cây hoa lily nói chung

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả nghiên cứu của ựề tài làm tiền ựề và thúc ựẩy việc ứng dụng một phương pháp mới là tạo giống cây trồng chuyển gen mang ựặc tắnh mong muốn trong công tác chọn tạo giống cây trồng nói chung và cây hoa lily Sorbonne riêng ở Việt Nam

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……… 3

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Kỹ thuật chuyển gen vào thực vật

2.1.1 Khái niệm về Kỹ thuật chuyển gen

Kỹ thuật chuyển gen là kỹ thuật ñưa một hay nhiều gen lạ ñã ñược thiết

kế ở dạng ADN tái tổ hợp vào tế bào chủ của cây trồng nói riêng và của các sinh vật nói chung (vi sinh vật, ñộng vật…) làm cho gen lạ có thể tồn tại ở dạng plasmid tái tổ hợp hoặc gắn vào bộ gen tế bào chủ Trong tế bào chủ, các gen này hoạt ñộng tổng hợp nên các protein ñặc trng dẫn tới việc xuất hiện các ñặc tính mới của cơ thể chuyển gen

Chuyển gen ở thực vật có ý nghĩa lớn về mặt khoa học, nó khẳng ñịnh tính khách quan tự nhiên của vật chất di truyền như: khả năng mã hoá cho các tính trạng nhất ñịnh, khả năng phiên mã, dịch mã và khả năng di truyền Thông qua chuyển gen, các nhà sinh lý, hoá sinh và di truyền có thể nghiên cứu các quá trình ñiều khiển, thể hiện và ảnh hởng của các yếu tố di truyền và ngoại cảnh lên hoạt ñộng của gen

Trong kỹ thuật chuyển gen vào cơ thể thực vật, thì nguồn vật liệu thường ñược sử dụng ñể chuyển gen là: mô lá, mô thân, mẩu callus, phôi, những tế bào tách rời… Những vật liệu này sau khi ñã ñược biến nạp thành công, các tế bào ñã dung nạp những gen ngoại lai, ta phải tìm cách làm cho những tế bào này tái sinh ñược thành một cơ thể hoàn chỉnh bằng cách ñặt nó vào một môi trường tái sinh thích hợp Nếu như, sự tái sinh thành cây hoàn chỉnh không thành công thì tất cả những vật liệu ñã ñược biến nạp ñó sẽ trở nên vô nghĩa Chính vì vậy, sự thành công của kỹ thuật chuyển gen phụ thuộc vào sự tái sinh của tế bào Do vậy, việc lựa chọn và ñiều chỉnh môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật ñóng vai trò hết sức quan trọng, mang tính quyết ñịnh tới thành công hay thất bại của thí nghiệm biến nạp, bên cạnh ñó, vấn ñề sử dụng mô hay tế bào thích hợp ñể biến nạp cũng là mục tiêu nghiên

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……… 4

cứu không kém phần quan trọng (Potrykus, 1991).[17]

James F Hutchinson, Daniel Isenegger, Savitri Nadesan, Neil Smith and Peter Waterhouse, (2000)[18] nhận thấy: ñể có thể tạo ñược giống mới nhờ cải biến di truyền một cách hiệu quả thì phải ñảm bảo 04 yêu cầu sau:

5 Hệ thống tái sinh thích hợp ñể tái sinh ñược cây ñã chuyển gen;

5 Hệ thống vectơ thích hợp ñể có thể ñưa các gen lạ vào bộ DNA;

5 Có các gen thích hợp ñã ñược nhân dòng và ñã xác ñịnh ñược các ñặc tính;

5 Các phương pháp ñể ñánh giá các cây chuyển gen trong phòng thí nghiệm, nhà kính và ñồng ruộng

2.1.2 Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

2.1.2.1 Cơ sở khoa học về khả năngchuyển gen ở thực vật

Một số nguyên tắc sinh học

Khi ñặt ra mục ñích và thực hiện thí nghiệm chuyển gen cần chú ý một

số vấn ñề sinh học ảnh hưởng ñến quá trình chuyển gen như sau:

- Không phải toàn bộ tế bào ñều thể hiện tính toàn năng (totipotency)

- Các cây khác nhau có phản ứng không giống nhau với sự xâm nhập của một gen ngoại lai

- Cây biến nạp chỉ có thể tái sinh từ các tế bào có khả năng tái sinh và khả năng thu nhận gen biến nạp vào genome

- Mô thực vật là hỗn hợp các quần thể tế bào có khả năng khác nhau Cần xem xét một số vấn ñề như: chỉ có một số ít tế bào có khả năng biến nạp

và tái sinh cây Ở các tế bào khác có hai trường hợp có thể xảy ra: một số tế bào nếu ñược tạo ñiều kiện phù hợp thì trở nên có khả năng, một số khác hoàn toàn không có khả năng biến nạp và tái sinh cây

- Thành phần của các quần thể tế bào ñược xác ñịnh bởi loài, kiểu gen, từng cơ quan, từng giai ñoạn phát triển của mô và cơ quan

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……… 5

- Thành tế bào ngăn cản sự xâm nhập của DNA ngoại lai Vì thế, cho ñến nay chỉ có thể chuyển gen vào tế bào có thành cellulose thông qua

Agrobacterium, virus và bắn gen hoặc phải phá bỏ thành tế bào ñể chuyển gen bằng phương pháp xung ñiện, siêu âm và vi tiêm

- Khả năng xâm nhập ổn ñịnh của gen vào genome không tỷ lệ với sự biểu hiện tạm thời của gen

- Các DNA (trừ virus) khi xâm nhập vào genome của tế bào vật chủ chưa ñảm bảo là ñã liên kết ổn ñịnh với genome

- Các DNA (trừ virus) không chuyển từ tế bào này sang tế bào kia, nó chỉ ở nơi mà nó ñược ñưa vào

- Trong khi ñó, DNA của virus khi xâm nhập vào genom cây chủ lại không liên kết với genome mà chuyển từ tế bào này sang tế bào khác ngoại trừ mô phân sinh (meristem)

2.1.2.2 Phản ứng của tế bào với quá trình chuyển gen

Mục ñích chính của chuyển gen là ñưa một ñoạn DNA ngoại lai vào genome của tế bào vật chủ có khả năng tái sinh cây và biểu hiện ổn ñịnh tính trạng mới Nếu quá trình biến nạp xảy ra mà tế bào không tái sinh ñược thành cây, hoặc sự tái sinh diễn ra mà không kèm theo sự biến nạp thì thí nghiệm biến nạp chưa thành công

Ở rất nhiều loài thực vật, ñiều khó khăn là phải xác ñịnh cho ñược kiểu

tế bào nào trong cây có khả năng tiếp nhận sự biến nạp Hạt phấn hay tế bào noãn sau khi ñược biến nạp có thể ñược dùng ñể tạo ra cây biến nạp hoàn toàn, thông qua quá trình thụ tinh bình thường Hạt phấn thường ñược coi là nguyên liệu lý tưởng ñể gây biến nạp Trong khi ñó, việc biến nạp gen vào

hợp tử in vivo hay in vitro lại gặp nhiều khó khăn Trong trường hợp này,

người ta thường phải kết hợp với kỹ thuật cứu phôi Việc biến nạp gen ñối với

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……… 6

các tế bào ñơn của các mô phức tạp như phôi hay mô phân sinh thường cho ra những cây khảm

Từ nhiều thập kỷ qua người ta ñã biết rằng, tính toàn thể của tế bào thực

vật ñã tạo ñiều kiện cho sự tái sinh cây hoàn chỉnh in vitro qua quá trình phát

sinh cơ quan (hình thành chồi) hay phát sinh phôi Các chồi bất ñịnh hay phôi ñược hình thành từ các tế bào ñơn ñược hoạt hóa là những bộ phận dễ dàng tiếp nhận sự biến nạp và có khả năng cho những cây biến nạp hoàn chỉnh (không có tính khảm)

2.1.2.3 Các bước cơ bản của chuyển gen

Từ khi người ta khám phá ra rằng các thí nghiệm chuyển gen có thể thực

hiện nhờ một loại vi khuẩn ñất Agrobacterium tumefaciens, thì các nhà khoa học tin rằng Agrobacterium có thể chuyển gen vào tất cả các cây trồng Nhưng sau ñó kết quả thực tế cho thấy chuyển gen bằng Agrobacterium

không thể thực hiện ñược trên cây ngũ cốc (một lá mầm) vì thế hàng loạt kỹ thuật chuyển gen khác ñã ñược phát triển ñó là các kỹ thuật chuyển gen trực tiếp như bắn gen bằng vi ñạn (bombardement/gene gun), vi tiêm (microinjection), xung ñiện (electroporation), silicon carbide, ñiện di (electrophoresis), siêu âm (ultrasonic), chuyển gen qua ống phấn (pollen tube) ðến nay, nhờ cải tiến các vector chuyển gen nên kỹ thuật chuyển

bằng A tumefaciens ñã thành công cả ở cây ngũ cốc ñặc biệt là lúa Kỹ thuật

này trở nên một kỹ thuật ñầy triển vọng ñối với cây chuyển gen ở thực vật Quá trình chuyển gen ñược thực hiện qua các bước sau :

- Xác ñịnh gen liên quan ñến tính trạng cần quan tâm

- Phân lập gen (PCR hoặc sàng lọc từ thư viện cDNA hoặc từ thư viện genomic DNA)

- Gắn gen vào vector biểu hiện (expression vector) ñể biến nạp

- Biến nạp vào E coli

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……… 7

- Tách chiết DNA plasmid

- Biến nạp vào mô hoặc tế bào thực vật bằng một trong các phương pháp khác nhau ñã kể trên

- Chọn lọc các thể biến nạp trên môi trường chọn lọc

- Tái sinh cây biến nạp

- Phân tích ñể xác nhận cá thể chuyển gen (PCR hoặc Southern blot) và ñánh giá mức ñộ biểu hiện của chúng (Northern blot, Western blot, ELISA

hoặc các thử nghiệm in vivo khác )

Nguyên liệu ñể thực hiện sự biến nạp là các tế bào thực vật riêng lẽ, các

mô hoặc cây hoàn chỉnh

Cản trở lớn nhất của sự tiếp nhận DNA ở phần lớn sinh vật là thành tế bào Muốn làm mất thành tế bào thực vật người ta thường sử dụng enzyme và dưới những ñiều kiện thích hợp người ta có thể tạo ra tế bào trần, tế bào trần tiếp nhận DNA nói chung dễ dàng Chẳng hạn sử dụng phương pháp xung ñiện, ở ñây tế bào ñược ñặt ở trong một xung ñiện ngắn, xung ñiện này có thể làm xuất hiện những lỗ tạm thời ở trên màng tế bào, những phân tử DNA có thể ñi vào bên trong tế bào Sau khi biến nạp người ta tách những enzyme phân giải và ñể cho tế bào phát triển, thành tế bào mới ñược tạo nên Các tế bào biến nạp này ñược nuôi cấy trên các môi trường nhân tạo thích hợp cùng với các chất kích thích sinh trưởng ñể tạo nên cây hoàn chỉnh Sau ñó bằng các phương pháp phân tích genome như PCR, Southern blot, Northern blot ñược thực hiện ñể tìm ra chính xác những cây biến ñổi gen

Bên cạnh các phương pháp biến nạp Agrobacterium hoặc xung ñiện,

hiện nay có hai phương pháp khác cũng thường ñược sử dụng ñể ñưa DNA vào trong tế bào Phương pháp thứ nhất là vi tiêm: với một cái pipet rất nhỏ người ta có thể ñưa các phân tử DNA trực tiếp vào nhân tế bào mà người ta muốn biến nạp Phương pháp này ñầu tiên chỉ ñược sử dụng ở tế bào ñộng vật, nhưng sau này người ta ñã sử dụng cho tế bào thực vật Phương pháp thứ

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……… 8

hai là bắn vào tế bào các vi ñạn (microprojectile), thường bằng vàng hoặc wolfram, ñược bao bọc bởi DNA Phương pháp này ñược gọi là phi sinh học

và ñược sử dụng thành công ở nhiều loại tế bào khác nhau

Ở ñộng-thực vật chuyển gen, sản phẩm cuối cùng thường không phải là

tế bào biến nạp, mà là một cơ thể biến nạp hoàn toàn Phần lớn thực vật ñược tái sinh dễ dàng bằng nuôi cấy mô tế bào Tuy nhiên, tái sinh cây một lá mầm như ngũ cốc và các loại cỏ khác cũng gặp một vài khó khăn Từ một tế bào biến nạp duy nhất người ta có thể tạo ra một cây chuyển gen, trong ñó mỗi tế bào mang DNA ngoại lai và tiếp tục chuyển cho thế hệ sau sau khi nở hoa và tạo hạt

2.1.2.4 Các phương pháp xác ñịnh cây chuyển gen

Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)

Kỹ thuật PCR còn gọi là phản ứng chuỗi trùng hợp hay kỹ thuât nhân ADN ñặc hiệu, ñược sử dụng cho mục ñích nhân nhanh một số lượng không hạn chế nguyên bản của một ñoạn ADN nhất ñịnh PCR là một phương pháp

sử dụng khá phổ biến hiện nay ñể kiểm tra ñánh kết quả chuyển gen ở mức ñộ phân tử Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, sử dụng ADN khuôn

và các hóa chất như Taq – polymerase, và các nucleotit, các cặp primer ñặc

hiệu Ưu ñiểm của kỹ thuật này là nhanh nhạy và ñặc biệt là không cần dùng ñồng vị phóng xạ Tuy nhiên, kỹ thuật này còn bộc lộ một số hạn chế ñáng kể như: mức ñộ ngoại nhiễm cao, giới hạn kích thước của trình tự cần khuyếch ñại, sai sót trong quá trình tổng hợp Taq –polymerase Vì vậy, ñây ñược xem

là bước ñầu tiên trong ñánh giá sự có mặt của gen chuyển vào cây ở mức ñộ phân tử

Kỹ thuật lai Southern blotting

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……… 9

Kỹ thuật lai phân tử (molecular hybriddization) nói chung và lai Southern blotting nói riêng dựa trên nguyên lý là lai phân tử giữa mẫu dò ADN (ARN) với các phân tử ADN (ARN, protein) ñược lưu giữ trên giá thể

ñể dò tìm các phân tử sinh học ñặc trưng Kỹ thuật này có hiệu quả trong nghiên cứu phát hiện các ñại phân tử sinh học có cấu trúc phân tử tử phức tạp

Nó có thể áp dụng cho mọi loại ñại phân tử sinh học có khả năng gắn kết vào giá thể lưu trữ như màng notrocelluose, màng nilon, màng giấy cellulose nhưng vẫn duy trì ñược khả năng gắn kết với các nhóm chất hiển thị khác

Kỹ thuật lai Northern (Northern blotting)

Lai Northern là phương pháp xác ñịnh kích thước và số lượng các phân

tử mARN trong ARN tổng số hoặc poly(A)+ARN ðể làm việc này, trước hết ARN tách ñoạn bằng ñiện di trên gel agarose biến tính sau ñó ñược thấm truyền lên màng cellulose, nitro-cellulose, lên kính hay lên màng nilon Về nguyên tắc, lai Northern cũng tương tự như lai Sounthern ðiều khác biệt là trong lai Northern, ARN ñược thấm truyền và sau ñó ñược lai với ADN hoặc ARN ñánh dấu còn ở lai SountherADN ñược thấ truyền sau ñó ñược lai với ADN ñánh dấu Kỹ thuật này nhằm ñánh giá hoạt ñộng sao chép của gen chuyển khi ñược gắn vào genome của cây chủ

Kỹ thuật lai Western (Western blotting)

Kỹ thuật lai Western là kỹ thuật lai protein-protein Protein mẫu sau khi ñược phân tách bằng ñiện di trên gel acrylamide sẽ ñược chuyển sang cố ñịnh trên một chất giá thể cũng bằng ñiện di Chất giá thể thường sử dụng là các loại màng khác nhau như màng nitrocellulose, diazophenylythio (DPT), diazobenzyloxymethyl (DBM), nilon Protein ñã cố ñịnh trên màng sẽ ñược phát hiện bằng phản ứng miễn dịch kép Kỹ thuật lai Western là bước quan trọng nhằm ñánh giá mức ñộ biểu hiện của gen chuyển khi ñược ñưa vào cây

ở mức ñộ protein và thể hiện tính trạng

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……… 10

2.1.3 Khả năng chuyển nạp gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

Chuyển nạp gen thành công trên cây trồng ñã ñược ghi nhận bằng cách sử

dụng vectơ Ti-plasmid, thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens ñể ñưa

gen mong muốn vào trong bộ gen cây trồng

Chi Agrobacterium ñược chia làm một số loài dựa vào triệu chứng gây bệnh và kí chủ Một số loài thuộc chi Agrobacterium như: A radiobacter (loài này không gây bệnh cho cây), A tumefaciens và A rhizogens gây bệnh khối u (crown gall) và bệnh rễ tơ (hairy root disease), A rubi gây bệnh khối u trên cây mía, A vitis gây bệnh khối u trên cây nho và một số loài cây khác (Otten

và ctv, 1984)

Hình 2.1 Một số khối u do vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens tạo ra A:

một khối u rất lớn hình thành trên thân cây hoa Hồng, B: một dãy khối u

nằm trên nhánh của cây Nho

Agrobacterium tumefaciens là loài vi khuẩn ñược sử dụng phổ biến

nhất trong chuyển nạp gen Agrobacterium tumefaciens thuộc vi khuẩn ñất,

gram âm, hình que, có khả năng di ñộng (có 5-11 lông roi), không sinh bào tử

và cùng họ với vi khuẩn cố ñịnh ñạm Rhizobium (Deacon và ctv, 2005) Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens là vi khuẩn hiếu khí, phát triển tối ưu ở

nhiệt ñộ 290C Agrobacterium tumefaciens là tác nhân gây bệnh cho cây do nó

có khả năng chuyển T-DNA vào tế bào cây chủ (Hansen và Chilton, 1999,

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……… 11

Gelvin, 2000), sau ñó T-DNA này hợp nhất vào bộ gen của tế bào cây chủ dẫn ñến hình thành khối u Khối u ñược hình thành trên rễ (phần nằm trên mặt ñất)

và ñỉnh của nhiều loài cây hai lá mầm, một số loài cây ăn quả như táo, lê, ñào, nho và những cây cảnh như hoa hồng Khi tế bào cây bị tổn thương, tế bào vi khuẩn sẽ di chuyển ñến vị trí vết thương và xâm nhập vào cây qua vết thương

ñó Vi khuẩn ñộc mang một hoặc nhiều plasmid, một trong số ñó có mang gen tạo khối u và ñược biết với tên gọi là Ti-plasmid Ti-plasmid cũng mang các gen ñể xác ñịnh kí chủ và triệu chứng khi nhiễm vào cây Những vi khuẩn không mang Ti-plasmid ñược xem như là vi khuẩn không ñộc và không có khả năng gây bệnh khối u cho cây Khối u ñầu tiên xuất hiện nhỏ mầu trắng, sau lớn dần và xuất hiện các vết lốm ñốm nâu ñen do các tế bào ngoại biên chết ñi (hình II.1 và II.2) Các khối u có thể mềm và xốp, có thể bị vỡ vụn khi chạm vào, nhưng cũng có thể cứng và xuất hiện các u nhỏ hoặc nhiều mấu Các khối

u có ñường kính ñến 30 cm nhưng phổ biến là 5-10 cm Cây bị nhiễm vi khuẩn

sẽ trở nên còi cọc, lá úa vàng và rất nhạy cảm với các ñiều kiện môi trường Khi xâm nhiễm vào cây, một phần gen trên Ti-plasmid sẽ gắn vào nhiễm sắc thể của cây làm cho các tế bào phát triển mạnh và sản xuất ra một chất ñặc biệt gọi là Opine Vi khuẩn sẽ sử dụng chất này làm nguồn cacbon cho các hoạt ñộng biến dưỡng (Zhu và ctv, 2000).[23]

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……… 12

Hình 2.2 Một khối u do vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens tạo ra

Bộ nhiễm sắc thể vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens có kiến trúc

vòng, kích thước 2,6 Mb Ngoài ra vi khuẩn còn mang plasmid lớn có kích thước 200-800 kbp (Gelvin, 2003)[19], phần lớn những gen có liên quan ñến

sự hình thành khối u ở thực vật ñều nằm trong plasmid này nên ñược gọi là Ti-plasmid

2.1.3.1 Ti-plasmid

Ti-plasmid là một phân tử DNA sợi ñôi mạch vòng nằm tách biệt với nhiễm sắc thể và có khả năng nhân lên một cách ñộc lập trong tế bào vi khuẩn Việc xác ñịnh Ti-plasmid như một nguyên lý tạo bướu TIP (tumor inducing principle) ñã ñánh dấu bước khởi ñộng của một giai ñoạn mới trong nghiên

cứu về Agrobacterium tumefaciens ðiều này ñã mở ra khả năng nghiên cứu

cấu trúc và chức năng của plasmid bằng kỹ thuật di truyền phân tử (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999)[2]

Cấu trúc chung của một Ti-plasmid gồm: vùng T-DNA - trình tự mã

hoá ñược chuyển vào trong cây, vùng mang các gen vir - vùng trực tiếp tham gia tạo T-DNA sợi ñơn và chuyển T-DNA này vào tế bào cây, vùng rep - cần cho sự tái bản của Ti-plasmid, vị trí tra và trb - tham gia vào quá trình chuyển

tiếp hợp của Ti-plasmid, các gen cần cho việc hấp thu và chuyển hoá các

opine (Zhu và ctv, 2000) Hai yếu tố quan trọng trong cấu trúc của Ti-plasmid

cần cho sự chuyển gen vào cây là ñoạn T- DNA bao gồm cả trình tự 25 bp ở

hai bờ của ñoạn T- DNA và gen vir (Gelvin, 2003)[19]

2.1.3.2 Chức năng của T-DNA

T-DNA là một ñoạn DNA có kích thước 10-30 kbp (Gelvin, 2003), có

mang các gen mã hoá cho việc tổng hợp auxins, cytokinins, opines và các

gen gây khối u Trong Ti-plasmid, vị trí của T-DNA ñược giới hạn bởi các trình tự lập lại có chiều dài khoảng 25 bp nằm ở 2 ñầu gọi là bờ phải và bờ trái Tuy nhiên, bờ trái của T-DNA bị mất không ảnh hưởng ñến tính ñộc

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……… 13

nhiều, trong khi ñó bờ phải lại cần thiết và ñược ñề nghị rằng tiến trình chuyển nạp diễn ra với bờ phải trước rồi tiến dần về phía trái Việc ñảo ngược

bờ phải sẽ làm yếu ñi khả năng tạo khối u (Gelvin, 2003)[19]

T-DNA mã hóa một vài protein, protein này biểu hiện trong tế bào cây ñược chuyển gen sẽ làm thay ñổi hình thái của cây Theo Binns và Costantino (1998), T-DNA mã hóa cho 13 protein và những vùng không sao mã của các gen ñược chuyển mang nhiều ñặc ñiểm của các gen trong nhân của thực vật, thí dụ như kiểu hộp TATA (TATA box) và hộp CAAT (CAAT box) Một nhóm các gen của T-DNA ñiều khiển tổng hợp các hormon sinh trưởng của cây, những hormon này làm các tế bào tăng sinh và làm thay ñổi hình dạng

bên ngoài Sản phẩm của gen iaaM và gen iaaH ñiều khiển sự chuyển hoá

tryptophan thông qua indolacetamin thành indolacetic axit (auxin) Sản phẩm

của gen ipt giúp gắn kết isopentenyl pyrophosphat với AMP (Binns và

Costantino, 1998)[10] và các enzyme trong cây ñược cho là chuyển hoá isopentenyl-AMP thành cytokinin zeatin bằng cách loại bỏ nhóm phosphoribosyl và loại bỏ phân tử hydro của một nhóm methyl của isopentenyl Hai gen trên T-DNA khác ñược cho là có chức năng trong tạo

khối u là 5 và tml (cũng còn gọi là 6b) Sản phẩm của gen 5 ñiều khiển sinh

tổng hợp indole-3-lactate, ñó là một chất ñồng ñẳng với auxin Trong khi ñó

gen tml (cũng còn gọi là 6b) làm tăng mức ñộ nhạy cảm của các tế bào cây với phytohormon bằng một cơ chế chưa ñược giải thích Gen tml có thể kích

thích tạo các khối u ngay cả khi vắng mặt các gen gây khối u khác

Một nhóm gen ñược chuyển thứ hai ñiều khiển sản xuất nguồn dinh

dưỡng cho vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens phát triển, ñó là các opines

ðây là một dạng kết hợp giữa một amino axit với một ceto (keto) axit hoặc

với một ñường (Dessaux và ctv, 1998)[11] Các tế bào chuyển gen tổng hợp

và tiết ra một số lượng lớn các opines Các opines này hấp dẫn vi khuẩn mang kiểu gen tiêu biểu (bên ngoài vùng T-DNA và thường trên plasmid ñộc) cần

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……… 14

cho việc phân giải các opines ñược tổng hợp từ khối u (Ziemienowicz, 2001)[24] Dựa trên các kiểu opines ñược hình thành từ các khối u mà phân

chia nhóm vi khuẩn Agrobacterium thành các chủng như là: octopine,

nopaline, succinamopine và agropine Hiện có ít nhất là 20 loại opine khác nhau, mỗi chủng tạo ra và phân giải một nhóm opine chuyên biệt Chẳng hạn như, các Ti-plasmid kiểu octopine ñiều khiển tổng hợp ít nhất 8 opine Gen

ocs mã hóa cho octopine synthase, enzym này gắn pyruvate với arginine, lysine, histidine hoặc ornithine ñể tạo ra octopine, lysopine, histopine hoặc octopinic axit và tất cả những opine này ñều ñược tìm thấy trong các khối u

(Dessaux và ctv, 1998)[11] Sản phẩm của gen mas2’ ñược cho là làm kết nối

glutamine hoặc glutamic axit với glucoz (mặc dù ñiều này chưa ñược chứng

minh bằng thực nghiệm), trong khi ñó sản phẩm của mas1’ lại làm giảm bớt các dạng trung gian mannopine và mannopinic axit Sản phẩm của gen ags sẽ

làm lacto hóa mannopine thành agropine Mannopine và agropine cũng có thể

lactate hóa thành agropinic axit (Dessaux và ctv, 1998)[11] Bởi vậy, các khối

u ñược tạo ra bởi Ti-plasmid kiểu octopine có thể tạo 4 loại octopine và 4 kiểu thuộc nhóm mannityl opine

2.1.3.3 Chức năng của gen Vir

Quá trình chuyển T-DNA từ vi khuẩn A tumefaciens sang tế bào cây chủ ñược thực hiện bởi hoạt ñộng của các gen vir Có ít nhất 25 gen ñược nhận biết trong 7 ñơn vị phiên mã là: virA, virB, virC, virD, virE, virG, virF

và vùng này có kích thước khoảng 30- 40 kbp (de la Riva và ctv, 1998) Theo Stachel và ctv (1987) vùng này có 20 gen nằm trên 6 operon, các gen ñó là:

virA, virB, virC, virD, virE và virG Những gen vir này có vai trò trong việc

tạo sợi ñơn T-DNA trong vi khuẩn và chuyển nó vào tế bào cây chủ rồi gắn vào nhiễm sắc thể cây chủ

Các gen vir có vai trò trong việc nhận diện ra vết thương của cây thông

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……… 15

qua tín hiệu hoá học (Acetosyringone) tiết từ vết thương Các tín hiệu hoá học

từ vết thương ở tế bào cây chủ tạo ra ñược nhận biết trước tiên bởi protein

virA , rồi ñến protein virG ñể làm kích hoạt các gen ñộc khác ở vùng vir, tạo

ra các protein cần thiết Sự cảm ứng gen vir phụ thuộc vào nhiệt ñộ thấp và

ñiều kiện pH axit Hệ thống ñiều hoà gen vir hoạt ñộng thông qua hai gen ñộc: virA và virG Biểu hiện cơ bản của gen virA tổng hợp nên protein nằm

trong màng tế bào Protein virA ñáp ứng với sự trao ñổi chất của vết thương

của cây và có thể ñáp ứng nhạy cảm với sự thay ñổi của môi trường Với một

nồng ñộ AS thích hợp virA có thể ñược kích thích bởi ñường, các opine khối

u hoặc amino axit (Ziemienowicz, 2001)[25] Protein virA sẽ tự phosphoryl hoá, sự tự phosphoryl hoá này sẽ làm protein nội bào virG ñược phosphoryl hoá bởi aspartic axit còn lại sau khi virA tự phosphoryl hoá và kích hoạt sao

mã cho tất cả các gen vir Các promoter của gen vir có kích thước khoảng 12

bp trong trình tự “vir box” (Winans và ctv, 1987) Sự phosphoryl hoá làm cho protein virG gắn kết vào “vir boxes” và kích hoạt sự sao mã của các gen

virBCDEFGH (Ziemienowicz, 2001)[24]

Các gen vir có vai trò trong việc tạo sợi ñơn T-DNA trong vi khuẩn

(hình II.3) và ñưa sợi ñơn T-DNA vào trong tế bào cây Các protein ñược mã

hoá bởi gen virD và virE thực hiện chức năng tạo ra phức hợp T-DNA

Protein virD2 là một endonucleaz, protein này có chức năng xúc tác cắt sợi DNA ở vị trí 5’của bờ phải sau ñó virD1 cắt rời sợi T-DNA tại vị trí ñầu 3’

T-của bờ trái tạo thành một sợi ñơn Ngoài chức năng cắt sợi T-DNA virD2 còn

có chức năng khác như bám dính vào ñầu 5’ ñể tránh sự tác ñộng của enzim

nucleaz và chuyển sợi ñơn T-DNA vào nhân tế bào thực vật vì trong virD2

còn chứa một tín hiệu gọi là tín hiệu ñịnh vị trong nhân (nuclear locolization

signal) Hai giả thuyết về chức năng của protein VirD2 trong sự kết nạp DNA ñã ñược ñề nghị: virD2 vừa làm nhiệm vụ của một enzim integraz vừa

T-làm nhiệm vụ của một enzim ligaz (Ziemienowicz, 2001)[24]

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……… 16

VirE2 là một protein nối kết vào sợi ñơn T-DNA, nó sẽ bảo vệ T-DNA khỏi sự phân giải của các enzim nucleaz trong tế bào cây (Deng và ctv, 1998)

giống như virD2, virE2 cũng có chứa một tín hiệu ñịnh vị trong nhân VirB có

chức năng hình thành một cái kênh xuyên qua vách tế bào thực vật, giúp chuyển sợi ñơn T-DNA vượt xuyên qua tế bào vi khuẩn ñến vách, màng tế bào thực vật và sau ñó vượt qua các lỗ nhân ñể vào nhân tế bào Hai sản phẩm

của gen vir cũng ñược cho là có chức năng trong việc tạo T-DNA sợi ñơn là:

virC1 và virC2 virC1 ñã ñược thấy gắn kết vào vùng “overdrive”, vùng này nằm gần bờ phải, và bởi vậy giúp tăng cường sự cắt T-DNA ở vị trí bờ vai

của virD1/virD2 endonucleaz (Gelvin, 2003)[19] Một số tác giả khác cho rằng virC1 và virC2 không cần cho tạo T-DNA sợi ñơn Nhưng khi vắng mặt

hai protein này thì hiệu quả chuyển nạp T-DNA vào cây khá thấp Do ñó ñề nghị rằng chúng có chức năng trong việc tăng cường sản xuất sợi ñơn T-DNA

(Zhu và ctv, 2000)[23] Cùng với protein virD4, mười một protein virB, virE2

và virF tham gia ñưa T-DNA vào nhân Hệ thống chuyển nạp T-DNA ñược

mã hóa bởi operon virB, operon này mang 11 gen Sự chuyển phức hợp DNA dựa trên chiên mao (pili) do operon virB mã hoá và ñột biến ở bất kì

T-gen nào trong số 11 T-gen của operon này ñều làm mất khả năng tạo pili và tạo

khối u Các protein virB ñiều khiển tạo chiên mao này (chiên mao này tương

tự như chiên mao tiếp hợp) và virB2 là tiểu phần chính của chiên mao này Hai protein virB là virB4 và virB11 có hoạt tính ATPaz và ñược cho là cung

cấp năng lượng cho việc xuất các tiểu phần protein khác, cho vận chuyển

T-DNA, hoặc cả hai Hệ thống virB ñưa T-DNA tới tế bào chất của tế bào cây,

nơi ñây các bước cần cho chuyển T-DNA vào nhân và kết nạp với DNA của

cây ñược thực hiện (Zhu và ctv, 2000)[23] Cầu nối virB có thể gắn kết với phức hợp T-DNA bởi protein virD4, protein này nằm trong màng và rất cần cho việc chuyển nạp Hệ thống virB/virD4 ñưa phức hợp T-DNA–virD2 và protein virE2 vào tế bào chất của tế bào cây, phức hợp T-DNA cuối cùng

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……… 17

ñược tạo ra bằng cách phủ T-DNA với protein virE2 (Ziemienowicz, 2001)

2.1.3.4 Cơ chế lây nhiễm

Vi khuẩn A tumefaciens ñược tìm thấy ở trên và xung quanh bề mặt rễ

Nhưng vi khuẩn chỉ xâm nhiễm ñược vào cây khi cây bị tổn thương do nhiều nguyên nhân ðiều này có thể dễ dàng ñược chứng minh bằng các thí nghiệm Trong ñiều kiện tự nhiên, các tế bào vi khuẩn ñược dẫn dụ ñến vết thương nhờ các tín hiệu hoá học Tuy nhiên, chủng vi khuẩn có mang Ti-plasmid sẽ ñáp ứng mạnh hơn bởi vì chúng nhận diện ñược các hợp chất phenolic tiết ra

từ vết thương như acetosyringone (AS)

Chất này có tác dụng rất mạnh dù ở nồng ñộ thấp (10-7 M) Bởi vậy, một trong những chức năng của Ti-plasmid là mã hoá cho các thụ thể (receptor) nhận biết các hợp chất hoá học Những thụ thể này nằm trên màng

tế bào vi khuẩn và có thể giúp cho vi khuẩn nhận biết ra các vùng bị tổn thương Acetosyringone ñóng vai trò quan trọng trong tiến trình xâm nhiễm ở nồng ñộ cao (10-5 – 10-4 M) hơn nó sẽ kích hoạt các gen vir trên Ti-plasmid (Deacon và ctv, 2005) Các gen vir ñược kích hoạt tốt nhất ở nhiệt ñộ 25-

270C Tuy nhiên, hầu hết các chủng Agrobacterium hoạt ñộng ổn ñịnh ở nhiệt

ñộ 18-200C (Gelvin, 2003)

Hình 2.3: Quá trình tạo phức hợp sợi ñơn T-DNA

Sau khi ñược kích hoạt, các gen vir sẽ ñiều khiển quá trình tạo T-DNA

sợi ñơn trong tế bào vi khuẩn (hình II.3) Quá trình tạo T-DNA sợi ñơn ñược

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……… 18

thực hiện trong tế bào vi khuẩn và do các protein virD1 và virD2 thực hiện Sau ñó protein virD2 gắn vào sợi ñơn T-DNA ñể tạo thành phức hợp T- DNA Ngoài virD1, virD2 người ta còn cho rằng virC1 và virC2 cũng tham gia vào quá trình tạo T-DNA sợi ñơn Phức hợp T-DNA-virD2 cùng với protein virE2 ñược chuyển vào trong tế bào cây thông qua hệ thống chuyển nạp ñược mã hoá bởi các gen virB Cùng với một số thành phần trong tế bào

chất của tế bào cây, các protein của vi khuẩn sẽ tiếp tục ñưa phức hợp T-DNA vào trong nhân tế bào (Ziemienowicz, 2001)

Trong nhân tế bào cây, T-DNA ñược kết nạp vào bộ gen của cây (hình II.4) không theo một quy luật tái tổ hợp nào cả Mô hình cơ sở cho sự kết nạp T-DNA vào bộ gen của cây ñã ñược ñề nghị Theo mô hình này, ñầu tiên ñầu 3’ của T-DNA nhận diện các ñoạn tương ñồng với DNA của cây và gắn vào

Cả việc tách sợi DNA của cây và overhang ñầu 3’ của T-DNA ñều ñược

enzyme nucleaz thực hiện Cuối cùng nucleotide gắn với virD2 tìm các ñoạn

vi tương ñồng (microhomology) trên DNA của cây và gắn vào Sự gắn kết này mang cầu nối phosphotyrosine có ái lực ñiện tử của ñầu 5’ ñến gần ñầu 3’ nucleophilic của DNA cây mà bị tách ra Cuối cùng sự gắn kết trên sợi DNA của cây ñược hoàn thành và cây chuẩn bị một cơ chế sinh tổng hợp ñoạn T-DNA dẫn ñến sự kết nạp của T-DNA hoàn thành

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……… 19

Cuối cùng, sau khi sự kết nạp hoàn thành các gen trên T-DNA hoạt ñộng tổng hợp nên các sản phẩm cần thiết cho vi khuẩn (Ziemienowicz,

2001)[24] Các opines ñược tạo ra từ các khối u do vi khuẩn Agrobacterium

nhiễm vào ñược vi khuẩn biến dưỡng nhờ vào các gen ở vùng phân giải opine trên Ti-plasmid Tùy theo kiểu opine mà ñược chuyển hóa bởi các gen khác nhau (Ziemienowicz, 2001)[24]

Hình 2.4: Quá trình kết nạp T-DNA vào bộ gen của tế bào cây

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……… 20

Khả năng chuyển nạp ñoạn DNA của Agrobacterium vào trong tế bào

cây cung cấp một công cụ mạnh cho công nghệ sinh học thực vật, chuyển

nạp gen thông qua trung gian vi khuẩn Agrobacterium ngày càng ñược ứng

dụng rộng rãi ñể chuyển một hay nhiều gen vào cây trồng do có nhiều ưu ñiểm so với các phương pháp chuyển nạp gen khác: gen ñược chuyển nạp gắn vào hệ gen cây một cách ñơn giản, hiện tượng tái sắp xếp lại của các gen

ít xảy ra, có ít bản bản sao của gen ñược biến nạp tạo thuận lợi trong việc phân tích cũng như biểu hiện gen mới trong cây chuyển gen (Zhang và ctv, 1988), các gen chuyển nạp duy trì bền vững qua các thế hệ sau Trước ñây, phương pháp này bị hạn chế chỉ thực hiện trên cây hai lá mầm do tin rằng

Agrobacterium chỉ có thể nhiễm vào cây hai lá mầm Sau này, người ta tìm

ra rằng mặc dù Agrobacterium chỉ tạo khối u trên cây hai lá mầm nhưng nó

Hình 2.5: Mô hình chuyển nạp T-DNA từ tế bào vi khuẩn vào

tế bào cây (nguồn Zhu và ctv, 2000)[23]

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……… 21

có thể nhiễm vào cây một lá mầm (Ziemienowicz, 2001) Trước ñây ñối với cây 1 lá mầm như lúa, phương pháp chuyển nạp gen nhờ vào vi khuẩn

Agrobacterium rất khó thành công Tuy nhiên gần ñây công trình nghiên cứu của Hiei và Komari (1996) ñã minh chứng ñược hiệu quả chuyển nạp gen

bằng vi khuẩn Agrobacterium vào cây 1 lá mầm (lúa) cũng cao như ñối với

cây 2 lá mầm

2.1.3 Tiềm năng ñóng góp của cây trồng biến ñổi gen

Lý do thuyết phục nhất ñối với công nghệ sinh học mà cụ thể là cây trồng biến ñổi gen ñó là khả năng ñóng góp của chúng trong các lĩnh vực sau:

- Nâng cao sản lượng cây trồng và do vậy góp phần ñảm bảo an ninh lương thực, thức ăn gia súc và chất xơ trên toàn cầu

- Bảo toàn sự ña dạng sinh học do ñây là một công nghệ ít tiêu tốn ñất có khả năng ñem lại sản lượng cao hơn

- Sử dụng một cách có hiệu quả hơn các yếu tố ñầu vào ñáp ứng yêu cầu phát triển bền vững nông nghiệp và môi trường

- Tăng khả năng ổn ñịnh sản xuất làm giảm những thiệt hại phải gánh chịu trong các ñiều kiện khó khăn

- Cải thiện các lợi ích kinh tế và xã hội và loại bỏ tình trạng ñói nghèo ở các nước ñang phát triển

Kinh nghiệm trong 13 năm ñầu tiên từ 1996-2008, trong ñó tổng diện tích trên 800 triệu ha cây trồng biến ñổi gen ñã ñược trồng tại 25 nước trên toàn cầu, ñã ñáp ứng sự mong mỏi của hàng triệu hộ nông dân lớn và nhỏ ở cả các nước công nghiệp và ñang phát triển Năm 2008, ñã có bằng chứng cho thấy cây trồng CNSH ñược trồng thương mại hóa tiếp tục ñem lại các lợi ích ñáng kể về mặt kinh tế, môi trường và xã hội cho các hộ nông dân lớn và nhỏ

ở các nước ñang phát triển, diện tích trồng cây biến ñổi gen trên toàn cầu tiếp tục tăng trên 10%, mức tăng hàng năm là hai con số Số hộ nông dân thu lợi

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệpẦẦẦ 22

từ cây trồng CNSH ngày càng nhiều và ựạt 13,3 triệu người năm 2008, tăng

so với 7 triệu của năm 2003 đáng chú ý là trong năm 2008, trên 90% hay 12,3 triệu người trồng này thu lợi từ cây trồng CNSH là các nông dân nghèo trồng bông Bt, chủ yếu ở 9 tỉnh của Trung Quốc và nông dân nghèo ở Makhathini Flats, thuộc tỉnh KwaZulu Natal của Nam Phi

2.1.4 Giá trị cây trồng biến ựổi gen trên toàn cầu

Trong tổng số lợi ắch về mặt kinh tế trị giá 44 tỷ USD thu ựược trong suốt quãng thời gian 1996 Ờ 2007, 44% là do gia tăng năng suất ựem lại và 56% là do việc giảm chi phắ sản xuất ựem lại (bao gồm 359.000 tấn thuốc trừ sâu tiết kiệm ựược); sản lượng tăng thêm 141 triệu tấn, sẽ phải cần ựưa thêm vào sử dụng 43 triệu hecta trồng cây thông thường và do vậy ựây là một công nghệ tiết kiệm ựất

Ở các nước ựang phát triển ựang chuyển ựổi và dựa vào nông nghiệp, cây trồng sinh học là ựộng lực của tăng trưởng kinh tế nông thôn, ựồng thời góp phần ựáng kể vào sự tăng trưởng kinh tế quốc gia

Hơn một nửa (55%) dân số thế giới sống tại 25 quốc gia, nơi trồng 125 triệu hecta cây trồng sinh học năm 2008, tương ựương 8% của 1,5 tỷ hecta ựất trồng trọt trên toàn thế giới Trong năm 2007, cây trồng sinh học ựã tiết kiệm 14,2 tỷ kg khắ CO2, tương ựương mức tiết kiệm sử dụng của 6,3 triệu xe ôtô

Nhu cầu cấp thiết hiện nay là các hệ thống quảng lý nhanh chóng/ chi phắ hiệu quả cho cây trồng sinh học, hệ thống có trách nhiệm, không gây phiền hà và chi phắ không quá tốn kém ựối với các nước ựang phát triển

25 nước ựã cho phép trồng cây công nghệ sinh học và 30 quốc gia khác ựã cho phép nhập khẩu các sản phẩm công nghệ sinh học sử dụng làm thực phẩm

và thức ăn chăn nuôi, ựưa tổng số nước phê chuẩn cây trồng công nghệ sinh học lên 55 nước

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệpẦẦẦ 23

Trị giá toàn cầu của thị trường cây trồng sinh học trong năm 2008 là 7,5 tỷ USD với tổng giá trị tắch luỹ ựạt 50 tỷ USD từ năm 1996 ựến 2008

2.1.5 Tình hình chung về phát triển cây trồng biến ựổi gen tại Việt Nam

2.1.5.1 Những chắnh sách và kế hoạch phát triển cây trồng biến ựổi gen ở Việt Nam

- Quyết ựịnh 18/CP, 1994 về công nghệ sinh học, xếp CNSH vào hàng

ưu tiên cho nghiên cứu triển khai chỉ sau công nghệ thông tin

- Chỉ thị 50 TW, 2005 của ban bắ thư Trung ương đảng

- Kế hoạch hành ựộng quốc gia về CNSH năm 2005

- Các chương trình CNSH trong nông nghiệp, y tế, công nghiệp, thuỷ sản

- Chương trình phát triển hệ thống quy chế quản lý an toàn sinh học sinh vật biến ựổi gen

- Giai ựoạn 2006-2010 Ờ Thử nghiệm một số giống cây trồng biến ựổi gen trên ựồng ruộng

- Giai ựoạn 2011-2015 Ờ ựưa một số giống cây trồng biến ựổi gen vào sản xuất

- đến 2020 diện tắch một số cây trồng biến ựổi gen (bông, ngô, ựậu

tương) ựạt 30-50%

2.1.5.2.Nghiên cứu tạo cây trồng biến ựổi gen ở Việt Nam

đứng trước những cơ hội và thách thức trước khi hội nhập kinh tế khu vực, các nhà khoa học nước ta ựã bắt kịp trào lưu cũng như kỹ thuật thao tác, xác lập ựược công nghệ mũi nhọn trong tạo giống cây trồng bằng biến ựổi

tắnh di truyền theo hướng có lợi

Qua nhiều năm nghiên cứu, các nhà khoa học của Việt Nam ựã thực hiện biến ựổi gen thành công cho một số giống cây trồng đó là chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ và hoàn thiện hệ thống tái sinh giống khoai mì K140-2 có hàm lượng tinh bột cao, giàu protein, kháng sâu bệnh, kháng thuốc trừ cỏ (Bùi

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……… 24

Lan Anh và cs 2008)[1] Việc chuyển nạp gen và tạo dòng ñậu tương biến ñổi gen kháng sâu ñược TS Trần Thị Cúc Hòa tiến hành bằng phương pháp nốt lá mầm lây nhiễm với vi khuẩn thực hiện trên 4 giống ñậu tương trong ñó có 2 giống ñang trồng ở Việt Nam Kết quả, trong 91 giống ñã xác ñịnh ñược các giống có tiềm năng sử dụng ñược trong chuyển nạp gen ñậu tương (gồm 5 giống ñậu tương ñang trồng ở Việt Nam và 3 giống nhập nội)

Cũng theo TS Trần Thị Cúc Hòa, ba giống lúa IR64, MTL250 (indica)

và Taipei 309 (japonica) ñược chuyển nạp với các vectơ pCaCar và pFun3 mang gen psy và crtI ñiều khiển lộ trình tổng hợp isoprenoid ñể tạo ra một số

vi chất dinh dưỡng, bằng phương pháp sử dụng Agrobacterium và hệ thống chọn lọc mannose Kết quả ñã tạo ra các dòng lúa biến ñổi gen chứa carotenoid, trong ñó hợp phần chủ yếu là (- carotene (tiền vitamin A) có hàm lượng cao, trong khi giống ñối chứng không biến ñổi gen hoàn toàn khộng có carotenoid ðiều ñặc biệt là các dòng biến ñổi gen với véctơ pCaCar, hạt gạo biểu hiện cả (-carotene và các hợp chất vitamin E (tocopherols) vì ở nội nhũ của hạt gạo non có sự hiện diện của geranyl geranyl diphosphate (GGPP) một tiền chất quan trọng trong tiến trình sinh tổng hợp (-carotene cũng như các hợp chất vitamin E Ngoài ra trong một số dòng lúa biến ñổi gen còn thấy chất (-oryzanol, là chất chống oxyt hóa có vai trò còn quan trọng hơn cả vitamin E gia tăng ñáng kể Phương pháp chuyển gen ñược áp dụng ở nghiên cứu này còn cho phép tuyển chọn các dòng biến ñổi gen sạch, khắc phục mối

lo ngại về an toàn sinh học ñối với cây biến ñổi gen

Chuyển gen Bt kháng sâu vào cây ngô bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens ñể tạo ra các dòng ngô có khả năng kháng sâu cao Quy tụ thành công ba gen kháng nấm ñạo ôn và ñưa gen kháng ruồi ñục thân GM2, GM4t, GM7 vào các giống lúa có tiềm năng năng suất cao Chuyển gen Bt kháng sâu

và gen liên quan ñến tính chống chịu mặn vào cây thuốc lá

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……… 25

Từ năm 2010 trở ñi, việc ứng dụng cây trồng chuyển gen vào sản xuất trên ñồng ruộng là cần thiết Bởi lúc ñó, công nghệ sinh học sẽ là công nghệ nền, giải quyết vấn ñề năng suất, chất lượng cây trồng, nhằm bảo ñảm an ninh lương thực quốc gia và hội nhập kinh tế khu vực Vì vậy, các nhà khoa học kiến nghị Nhà nước sớm ban hành Luật An toàn sinh học Tiếp tục ñầu tư dứt ñiểm và hoàn thiện quy chế hoạt ñộng của các phòng thí nghiệm trọng ñiểm quốc gia Nâng cao chất lượng quy hoạch và ñào tạo cán bộ khoa học Tăng cường hợp tác quốc tế trong lĩnh vực mới mẻ nhưng ñem lại hiệu quả kinh tế cao này

2.2 Chuyển gen trên cây hoa lily

2.2.1 Giới thiệu về cây hoa lily

2.2.1.1 Nguồn gốc và phân loại

Cây hoa lily có nguồn gốc từ Trung Quốc, Nhật Bản, Nam Triều Tiên, Mỹ

và một số nước khác Hoa lily ñã ñược nghiên cứu và thuần hóa gần 100 năm nay

từ các loài hoang dại phân bố ở hầu hết các châu lục từ 100 ñến 600 vĩ bắc, ñặc biệt là những vùng có khí hậu ôn ñới và lạnh, hoặc ở những vùng núi cao từ 1200m trở lên của các vùng nhiệt ñới như Trung Quốc, ấn ðộ, Indonexia, Việt Nam

Trong hệ thống phân loại thực vật, cây hoa lily ñược xếp vào nhóm cây một lá

mầm (Monocotyledones), phân lớp hành (Liliidae), bộ hành (Liliales), họ hành (Liliaceae), chi Lilium (Dương ðức Tiến, Võ Văn Chi, 1978)[7]

2.2.1.2 ðặc tính sinh vật học cây hoa lily

Lily là cây thân thảo lâu năm, thân cao từ 50-200cm, thân dạng hành

có vảy, phần dưới mặt ñất gồm thân vẩy, rễ và phần trên mặt ñất gồm lá, thân:

* Thân vẩy là phần phình to của các vẩy củ tạo thành, trên ñĩa thân vẩy

có vài chục vẩy hợp lại, phía ngoài không có màng bao bọc nên gọi là thân vẩy trần Màu sắc, kích thước của thân vẩy tùy thuộc vào loài, giống khác

Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nơng nghiệp……… 26

nhau ðây là phần thương phẩm cĩ thể dùng để nhân giống

* Rễ gồm hai phần rễ thân và rễ gốc Rễ thân do phần thân mọc dưới mặt

đất sinh ra, cĩ nhiệm vụ nâng đỡ thân, hút nước và dinh dưỡng, rễ gốc sinh ởng khỏe, là cơ quan chủ yếu hút nước và dinh dưỡng của lily ða số giống sản xuất những thân vảy(củ) mọc ra từ rễ này làm thực liệu để nhân giống

trư-*Lá thường mọc chéo nhau, hình dài, hình trứng…khơng cĩ cuống

hoặc cuống rất ngắn và mọc xung quanh thân Một số ít giống ở nách cĩ lá mầm, cĩ thể dùng để nhân giống

*Hoa mọc đơn lẻ hay thành cụm gồm nhiều hoa Hoa to mọc riêng rẽ

mọc thành chùm hoặc thành cụm trên đỉnh ngọn thân, mỗi củ chỉ cĩ một cành hoa, mầm thân của lily bị rụng đi, hoặc sau khi ngắt ngọn khơng thể mọc ra thân mới, cũng khơng thể hình thành cành hoa khác Nếu muốn cắt hoa thì khơng được bấm ngọn, hoa cĩ hình lily Sorbonne, hình phễu, hình sao, hình cái chén nơng Màu sắc hoa rất phong phú, đẹp cĩ màu trắng, màu vàng lục, màu phấn hồng, màu cam, màu đỏ, màu tím và nhiều màu Màu cánh thường

là đơn sắc, hoặc cĩ đốm màu nâu, màu tím một số ít cĩ hương thơm

2.2.1.3 Giá trị sử dụng và giá trị kinh tế

Hoa lily tượng trưng cho sự tốt lành, đồn kết, mỹ mãn nên rất được người Trung Quốc ưa chuộng và trở thành loại hoa phát triển mạnh, sản lượng

và giá trị ngày càng cao Với màu sắc tươi sáng, phong phú, hoa to, cứng nên rất lý tưởng để bĩ hoa, lẵng hoa và cắm hoa nghệ thuật rất được ưa chuộng Ngồi ra, lily cũng cĩ thể trồng trong chậu, để chơi cả chậu hoa trong suốt

một thời gian dài, đặt trong phịng làm việc, phịng khách rất phù hợp

Bên cạnh giá trị phong phú về tinh thần thì hoa lily cịn được sử dụng

để tách chiết và tinh chế dầu thơm phục vụ cho một số ngành cơng nghiệp,

mỹ phẩm, bánh kẹo Hoa lily rất được thế giới ưa thích, cĩ lượng lưu thơng

lớn trên thị trường thế giới, sản lượng đứng hàng thứ 4, thứ 5 của hoa cắt Với

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……… 27

giá trị như vậy hoa lily hứa hẹn mang lại một nguồn doanh thu lớn cho ngành sản xuất, kinh doanh mặt hàng này Hiện nay, trên thị trường Việt Nam, các loại hoa lily Sorbonne ñang ñược bán phổ biến từ 10.000 ñến 50.000 ñồng/cành Như vậy, ñầu tư vốn vào phát triển kinh doanh mặt hàng này sẽ ñem lại lợi nhuận kinh tế rất cao

2.2.2 Nghiên cứu tái sinh và chuyển gen ở cây hoa lily

2.2.2.1 Các nghiên cứu về cây hoa lily trên thế giới

Các tác giả Byung Jooon Ahn, Yuong Hee Juong, Kathryn K.Kamo,

2004 ñó nghiên cứu chuyển gen bằng sung bắn gen cho huyền phù tế bào của

hoa Easter lily, Lilium longiflorum và ñưa ra kết luận: Sử dụng hạt vàng cho

sự biểu hiện của gen uidA cao hơn so với hạt bằng tungsten Tiền xử lý dung dịch huyền phù tế bào trước 3 giờ bằng osmoticum (0,125M) cho hiệu quả biểu hiện của uidA tăng 1,5 lần Sử dụng áp lực 1550psi, khoảng cách 6cm có kết quả tốt nhất so với các áp lực 1100, 1200, 1800psi Sự biểu hiện tạm thời của uidA xuất hiện ở 493 tế bào/ñĩa Petri ðể chuyển gen bền vững, huyền

phù tế bào của Limium longiflorum ñược bắn với plasmid bao gồm cucumber

mosaic virus ( CMV) replicase ñược ñiều khiển bởi Act 1 promoter và gen bar ñó ñược ñiều khiển bởi CaMV promoter 10 cây tái sinh ñó ñược phân tích bởi PCR, 2 trong 10 cây ñó ñược khẳng ñịnh chuyển gen nhờ lai Southern 2 cây chuyển gen ñược chuyển ñộc lập trong ñó có 1 cây mang gen bar, 1 cây mang cả hai gen bao gồm CMV replicase và bar gen Các cây này

ñó ñược xác ñịnh là có khả năng kháng PPT ở nồng ñộ 1000mg/l ở giai ñoạn

nở hoa chứng tỏ gen bar ñó ñược biểu hiện ở toàn bộ là khi ñược ñiều khiển bởi CaMV 35S promoter

Các tác giả Y Hoshi, M.Kondo, S.Mori, Y.Adachi, M.Nakano, H.Kobayashi, 2004 ñã nghiên cứu hệ thống tạo cây chuyển gen nhờ vi khuẩn

Agrobacterium cho cây Oriental hybrid lily Lilium và ñã thu ñược 6 dòng lily

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……… 28

kháng Hyg từ hơn 200 callus bằng cách làm tổn thương callus với giấy giáp trước khi ñồng nuôi cấy callus ñược ñồng nuôi cấy trên môi trường MS không

có NH4NO3 sử dụng Hyg trong môi trường chọn lọc Các dòng tái sinh kháng Hyg tạo chồi sau ñó phát triển thành cây khi chuyển sang môi trường MS không bổ sung chất ñiều tiết sinh trưởng Tất cả các cây ñược kết luận chuyển gen nhờ GUS histochemical assay và phân tích inverse PCR

Sakae SUZUKI và Masaru NAKANO, 2002 cũng công bố kết quả

nghiên cứu chuyển gen nhờ vi khuẩn A.tumefaciens cho 3 giống cây thuộc họ

Liliace , Lilium formosanum, Agapanthus praecox ssp Orientalis và Muscarri

armeniacum Kết quả nghiên cứu ñã không thu ñược mô chuyển gen trên

giống Lilium formosanum mặc dù có sự biểu hiện tạm thời của gen gus trong

callus trong quá trình ñồng nuôi cấy Tuy nhiên, ñó thu ñược một số cụm tế

bào có kháng hygromycin của giống Agapanthus praecox ssp Orientalis và

Muscarri armeniacum trên môi trường có bổ sung hygromycin Callus kháng hygromycin ñã tái sinh tạo cây hoàn chỉnh qua phôi soma, hầu hết trong số chúng ñược xác ñịnh là cây chuyển gen dựa trên phép thử GUS histochemical assay và phân tích PCR Bằng lai Southern ñó phát hiện ñược 1- 5 copy của gen trong bộ gen của cây chuyển gen của 2 giống trong ñó hầu hết là có 1

hoặc 2 copy Hệ thống chuyển gen vào Muscarri armeniacum và Agapanthus

praecox ssp Orientalis có thể là một công cụ ñể phát triển trong nghiên cứu

về sinh học phân tử

Công trình nghiên cứu của các tác giả A.Mercuri, L.de Benedetti, S Bruna, R Begliano, C.Bianchini, G.Foglia,T.Schiva cho thấy có thể chuyển

gen cho Limium longiflorum Thunb giống “ Snow Queen” Callus phát sinh

phôi xuất phát từ vũi nhụy và cuống ñó ñược cấy và ñồng nuôi cấy trong 7

ngày với huyền phù của vi khuẩn Agrobacterium LBA4404 mang binary

vecto pBin19 bao gồm nptII gen ñược ñiều khiển bởi nos promoter và các ñoạn giới hạn T-DNA EcoRI 15, bao gồm Os 11 và 12 tương ứng với rol A,

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệpẦẦẦ 29

B và C ựược cắt từ Agrobacterium rhizogenes pRi 1855 Các chồi chuyển gen

ựó ựược tái sinh trên môi trường chọn lọc và dễ dàng nhân nhanh, ra rễ và chuyển ra ựất Có sự ựa dạng về kiểu hỡnh của cỏc dũng chuyển gen A Lipsky, A.Cohen, R.Barg, S Shabtai, Y Salts, V Gaba, K.Kamo, A.Gera và

A.Watad cũng ựó tạo ựược cây chuyển gen bền vững cho Lilium longiflorum

Thunb Callus xuất phát từ vảy củ có ựộ ựồng ựều thấp sau 6 tháng cấy chuyển Nghiên cứu chuyển gen ựó ựược thực hiện bằng sử dụng thiết bị bắn gen Finer-type bombardment trên callus có 3 hoặc 10 tháng ựược duy trì trong mụi trường lỏng ở ựiều kiện bong tối Các hạt vàng ựược bọc với plasmid pUBQ3genGUS bao gồm gen uidA ựược ựiều khiển bởi UBQ3 promoter Callus nuôi cấy trên môi trường lỏng cho phép thu ựược cây chuyển gen bền vững cao hơn từ 50-70 lần so với môi trường ựặc đó thu ựược 10 cây chuyển gen bền vững của Lilium longiflorum Thunb Cv Snow

Queen Gần ựây nhất, các tác giả ựó sản xuất ựược hang trăm cây chuyển gen khác nhau sử dụng pCAMBIA2301 bao gồm gen rol B dưới sự ựiều khiển của Lat 52 promoter ựể chống lại sự phát triển của phấn hoa Gen gus ựó ựược biểu hiện rất mạnh trong các cây chuyển gen Các phân tắch về gen của những cây này ựang ựược tiến hành

2.2.2.2 Các nghiên cứu ở Việt Nam

Ở Việt Nam, cũng ựã có những nghiên cứu về hoa lily Sorbonne và ựạt ựược những thành công nhất ựịnh trong nhân nhanh, tái sinh và bước ựầu trong nghiên cứu chuyển gen cho cây hoa lily Sorbonne

Nghiên cứu chuyển gen cho cây hoa lily Sorbonne mới chỉ ựược thực hiện tại Viện Sinh học Nông nghiệp - Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội,

nghiên cứu chuyển ựược gen GFP, gen Gus, gen Bar cho hoa lily Sorbonne

đề tài: ỘNghiên cứu xây dựng quy trình chuyển gen vào cây hoa lily

Sorbonne bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciensỢgóp phần xây dựng ựược