K thut PCR VA RT PCR 1 1 e d b 1 e c 7

Ba bước này hợp thành một chu kỳ và sản phẩm mới vừa được tổng hợp lại có thể trở thành khuôn mẫu nên số lượng bản sao ADN đích gần như tăng gấp đôi sau mỗi chu kỳ, các chu kỳ nhắc lại s

Kỹ thuật PCR VÀ RT-PCR

1 Giới thiệu chung

1.1 Bản chất PCR và RT-PCR

Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) được Kary Mullis tìm ra năm 1983 và được trao giải Nobel Hóa học 10 năm sau đó vì những ứng dụng to lớn của nó Nhờ có PCR mà

□ một lượng ADN không đủ nhiều □ không còn là một trở ngại trong chẩn đoán và nghiên cứu sinh học phân tử dựa trên cơ sở ADN

PCR là phương pháp in vitro để tổng hợp một trình tự xác định ADN nhờ enzyme Phản ứng sử dụng 2 đoạn mồi oligonucleotide gắn đặc hiệu với chuỗi bổ trợ và kéo dài chuỗi theo trình tự ADN đích cần khuếch đại nhờ enzyme Taq ADN polymerase PCR là một quá trình nhắc lại của 3 phản ứng liên tục: biến tính ADN sợi kép thành ADN sợi

đơn; gắn mồi đặc hiệu vào chuỗi ADN sợi đơn tại đầu 5’- 3’; và kéo dài chuỗi nhờ hoạt

tính enzyme từ đầu 3’ theo hướng 3’ – 5’ để tổng hợp chuỗi ADN bổ trợ mới Ba bước này hợp thành một chu kỳ và sản phẩm mới vừa được tổng hợp lại có thể trở thành khuôn mẫu nên số lượng bản sao ADN đích gần như tăng gấp đôi sau mỗi chu kỳ, các chu kỳ nhắc lại sẽ làm tăng theo cấp số mũ số bản sao ADN đặc hiệu, tuy nhiên, không phải hiệu quả khuếch đại của mọi phản ứng đều đạt 100% như lý thuyết Chiều dài của sản phẩm là tổng chiều dài của 2 đoạn mồi và chiều dài khoảng cách giữa 2 đoạn mồi của khuôn mẫu

Hình 1 Nguyên lý của PCR và RT-PCR

Vì acid ribonucleic (ARN) không thể đóng vai trò làm khuôn mẫu trực tiếp cho PCR nên cần kết hợp bước phiên mã ngược (reverse transcription – RT) với PCR để ARN được chuyển thành ADN bổ trợ (cADN) và trở thành khuôn mẫu thích hợp cho PCR Khi hai kỹ thuật này được kết hợp với nhau, ngôn ngữ chuyên ngành và giao tiếp hàng ngày gọi đó

là phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược (PCR) Trước đây, 3 giai đoạn của RT-PCR được thực hiện riêng biệt nhưng hiện tại 3 bước này thưòng được kết hợp trong 1 lần làm thử nghiệm và gọi là RT-PCR một bước (one-step RT-PCR) Áp dụng RT-PCR để phát hiện ARN trong nghiên cứu và chẩn đoán cho ta một phương pháp nhanh, hiệu quả, nhạy và đặc hiệu

1.2 Những yếu tố có thể ảnh hưởng đến PCR và RT-PCR: Có thể điều chỉnh mỗi

thành phần lý học hay hóa học trong PCR để tăng hiệu quả khuếch đại, độ đặc hiệu và

độ nhạy của phản ứng Các yếu tố này không độc lập với nhau

1.2.1 Máy chu kỳ nhiệt tự động (máy PCR)

Vì phản ứng khuếch đại gồm nhiều chu kỳ và mỗi chu kỳ lại gồm nhiều bước ủ nhiệt nên cần có máy chu kỳ nhiệt tự động (máy PCR) Một máy PCR tốt tối thiểu phải có khả năng duy trì chính xác và ổn định 3 giai đoạn ủ nhiệt, thay đổi khung nhiệt độ trong một

khoảng thời gian xác định (ramp), đạt chính xác, không cao hơn và không thấp hơn nhiệt độ đích

1.2.1 Loại tube phản ứng

Tube tác động đến tỷ lệ truyền nhiệt từ máy sang hỗn dịch phản ứng nên cần sử dụng tube chuyên dụng cho PCR và vừa với khung giá đỡ tube

1.2.3 Chu kỳ nhiệt và số chu kỳ nhiệt

 Bước biến tính của chu kỳ đầu tiên:

Biến tính hoàn toàn khuôn mẫu ADN là bước vô cùng quan trọng để mồi có thể gắn khi phức hợp phản ứng được làm nguội Nếu khuôn mẫu ADN không được biến tính hoàn toàn thì 2 chuỗi bổ trợ có xu hướng bắt cặp trở lại rất nhanh, làm giảm hiệu quả gắn mồi

và kéo dài chuỗi, hoặc dẫn đến hiện tượng tự mồi (selfpriming) gây dương tính giả Bước tăng nhiệt độ đầu tiên cho phản ứng lên 94 – 95°c trong vài phút là đủ để làm biến tính hoàn toàn ADN

 Gắn mồi:

Nhìn chung, nhiệt độ gắn được xác định theo kinh nghiệm, lựa chọn nhiệt độ gắn là yếu

tố quan trọng nhất trong thiết kế một chu trình nhiệt cho PCR đạt độ đặc hiệu cao Nếu nhiệt độ quá cao thì mồi không thể gắn, ngược lại, nhiệt độ quá thấp gây hiện tượng gắn không đặc hiệu, hoặc chỉ gắn được một phần Hiện tượng tự mồi xảy ra khi các đoạn mồi có một hoặc một vài cặp base bổ trợ làm hiện tượng bắt cặp xảy ra giữa hai đầu 3’

 Kéo dài chuỗi sau khi gắn mồi (tổng hợp chuỗi):

Thông thường hiện tượng kéo dài chuỗi xảy ra ở 72°c – là nhiệt độ hoạt động tối ưu của Taq ADN polymerase Với đa số sản phẩm dưới 500 bp, khoảng thời gian kéo dài 20 giây

là đủ, và chỉ cần 40 giây cho sản phẩm dài khoảng 1200bp (Taq ADN polymerase có thể tổng hợp được 60 base/giây ở nhiệt độ 72°C), tuy nhiên, khoảng thời gian này trên thực

tế có thể khác nhau

 Bước biến tính của những chu kỳ tiếp theo: Nhiệt độ và thời gian biến tính của những chu kỳ tiếp theo thường là 94 – 95°c trong 20 – 30 giây, tuy nhiên, cần điều chỉnh 2 thông số này phù hợp với loại tube phản ứng và máy PCR

 Số chu kỳ khuếch đại:

Vói lượng khuôn mẫu dưới 10 bản sao, trong điều kiện tối ưu, sau chưa đến 40 chu kỳ khuếch đại cũng cho một lượng sản phẩm nhiều đến mức có thể nhìn được bằng mắt thường khi điện di trên thạch agarose và nhuộm bằng muối ethidium bromide, chính vì

vậy số chu kỳ của PCR thường từ 25 – 35, đôi khi lên đến 40, nhưng cần thận trọng khi

số chu kỳ quá nhiều vì các sản phẩm không đặc hiệu cũng có thể tích tụ lại

 Bước kéo dài cuối cùng (hoàn thiện):

Phản ứng thường được giữ ở 72°c khoảng 5-15 phút sau chu kỳ cuối cùng để hoàn thiện toàn bộ quá trình kéo dài chuỗi cho các sản phẩm đang được tổng hợp dở dang và giúp các chuỗi đơn bắt cặp vói nhau Sau khi phản ứng hoàn thành, sản phẩm thường được giữ ở 4 – 10°c

1.2.4 Loại enzyme và nồng độ enzyme

Nồng độ tối ưu của enzyme thường dao động từ 0,5 đến 2,5 đơn vị, nếu quá cao thì độ đặc hiệu của phản ứng có thể giảm Sau đây là một số loại enzyme thường dùng trong PCR:

1.2.4.1 Taq ADN polymerase:

 Đặc điểm chung: Taq ADN polymerase có nguồn gốc từ loài vi khuẩn chịu nhiệt Thermus aquaticus BM, có hoạt tính tổng hợp ADN chiều 5’ – 3’ nhưng không có hoạt tính exonudease (phá hủy acid nucleic bằng loại bỏ lần lượt từng nucleotide) chiều 3’ – 5’ Enzyme đạt hoạt độ tối đa ở nhiệt độ khoảng 75°c và pH ® 9 (20°C) Taq ADN polymerase nhận dUTP là cơ chất, do vậy có thể sử dụng UNG để tránh nhiễm

 Đặc điểm nổi bật: Taq ADN polymerase nhận nucleotide biến đổi như một cơ chất nên có thể sử dụng enzyme này trong trưòng hợp muốn đánh dấu các đoạn ADN bằng các nucleotide gắn phóng xạ hay digoxigenin (dig), biotin, và chất huỳnh quang Đây cũng là enzyme phù hợp cho kỹ thuật giải trình tự ADN

 Tth ADN polymerase:

 Đặc điểm chung: Tth ADN polymerase có nguồn gốc từ loài vi khuẩn chịu nhiệt Thermus thermophilus HB8, có hoạt tính tổng hợp chiều 5’ – 3’ rất cao, nhưng không có hoạt tính exonuclease chiều 3 ’ – 5 ’ Enzyme đạt hoạt độ tối đa ở nhiệt

độ khoảng 75°c và pH ~ 9 (20°C)

 Đặc điểm nổi bật: Tth ADN polymerase cũng nhận nucleotide biến đổi như một cơ chất, có hoạt tính phiên mã ngược rất hiệu quả, cao hơn so với ADN polymerase I của Taq polymerase, không liên quan tới hoạt tính RNase H, và sau phiên mã cDNA

có thể tiếp tục được khuếch đại bởi cùng một enzyme nên có thể được dùng trong RT-PCR

 Pwo ADN polymerase:

 Đặc điểm chung: Pwo ADN polymerase có nguồn gốc từ loài vi khuẩn siêu chịu nhiệt Pyrococcus woesei, có hoạt tính tổng hợp ADN chiều 5’ – 3’ và hoạt tính exonuclease chiều 3’ – 5’ nhưng không có hoạt tính exonuclease chiều 5’ – 3’; enzyme này hầu như không nhận dUTP là cơ chất do vậy không được khuyến cáo

sử dụng với UNG để tránh nhiễm

 Đặc điểm nổi bật: Do Pwo ADN polymerase có khả năng tổng hợp ADN chính xác hơn Taq polymerase tới 10 lần Sản phẩm PCR được tổng hợp bằng Pwo ADN polymerase có thể sử dụng trực tiếp ngay cho phản ứng nối ghép Hoạt tính exonuclease 3’ – 5’ của Pwo ADN polymerase có tác dụng trên ADN chuỗi đơn (ví

dụ mồi), mặc dù không ảnh hưởng đến quá trình thực hiện PCR, nhưng để tránh quá trình phân hủy mồi từ từ bởi enzyme thì các đoạn mồi cần được tổng hợp bằng các dNTP trơ với nucleaseế Pwo ADN polymerase nhận dƯTP đã gắn dig, biotin, hay chất huỳnh quang như cơ chất, đây là cơ sở để xây dựng hệ thống phát hiện sản phẩm PCR bằng kỹ thuật ELISA

 Nồng độ MgCL2

Nồng độ MgCL2 có thể dao động từ 0,5 mM đến 5 mM, ion này ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme Nồng độ Mg2+ tự do phụ thuộc vào nồng độ các hợp chất gắn với ion này như nồng độ các dNTP, pyrophosphate tự do (PPi) và ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Một số trường hợp cá biệt, MgCL2 có thể được thay bằng MnCL2

1 2.6 Nồng độ dNTP

Nồng độ các dNTP (4 loại nucleotide A, T, G, C) không cân bằng làm giảm tính chính xác trong hoạt động của Taq

1.2.7 Trình tự mồi

Trong hầu hết các trường hợp, chính trình tự và nồng độ mồi là hai yếu tố cơ bản quyết định đến sự thành công của phản ứng Nhìn chung, trình tự mồi cần đảm bảo không chứa cấu trúc bậc hai, các khu vực giàu G/C và A/T được phân bố đồng đều, và không có các trình tự bổ trợ giữa hai đầu 3’ để tránh hiện tượng tự mồi Khi thiết kế, có thể thêm vào đầu 5’ của mồi một số base không gắn với khuôn mẫu, kỹ thuật này rất tiện ích trong nghiên cứu khi muốn đưa vào sản phẩm khuếch đại một khu vực giói hạn đặc hiệu như cài vào sản phẩm khuếch đại một trình tự kích thích hoạt hóa phiên mã trong kỹ thuật phiên mã in vitro trực tiếp từ sản phẩm PCR

Nồng độ mồi tối ưu cho mỗi phản ứng dao động trong khoảng 0,1 – 0,5 uM Nồng độ mồi quá cao có thể gây hiện tượng gắn mồi không đặc hiệu, nồng độ quá thấp làm giảm hiệu giá phản ứng do thiếu mồi cho những chu kỳ cuối cùng

1.2.8 Chất phủ phản ứng

Có thể phủ một lớp dầu khoáng lên trên hỗn hợp PCR trước khi chạy máy để chống hiện tượng bay hơi Nếu dùng sáp paraffin thay dầu khoáng thì ngoài tác dụng chống bay hơi, chất này còn tách rời các thành phần của PCR cho đến khi phức hợp phản ứng đạt nhiệt độ cao vì paraffin vẫn tồn tại dưới dạng thể rắn ở nhiệt độ dưới 55°c (còn gọi là PCR hot start) nên hạn chế hiện tượng gắn mồi không đặc hiệu ở giai đoạn biến tính ở chu kỳ khuếch đại đầu tiên Hiện nay, nhiều tác giả không dùng chất phủ nhưng luôn giữ phức hợp phản ứng trong điều kiện lạnh

1.2.9 Khuôn mẫu

Tỷ lệ (mồi): (khuôn mẫu) ảnh hưởng rất lớn đến độ đặc hiệu của phản ứng và được xây dựng chủ yếu theo kinh nghiệm Nếu quá ít khuôn mẫu thì mồi có thể không tìm được trình tự gắn đặc hiệu, nếu quá nhiều thì có thể xảy ra hiện tượng bắt cặp nhầm Độ tinh sạch của khuôn mẫu cũng ảnh hưởng đến kết quả phản ứng

 Các chiến lược phòng nhiễm

PCR có khả năng khuếch đại từ một phân tử thành một lượng sản phẩm khổng lồ sau một số chu kỳ nhất định, nên nếu nhiễm một lượng vết ADN thì với khả năng khuếch đại tuyệt vời này, chính ADN nhiễm có thể trở thành khuôn mẫu cho PCR và kết quả là một sản phẩm đích không mong muốn được khuếch đại (dương tính giả) Các nguồn có thể gây nhiễm ADN là khu vực bàn làm việc, trang thiết bị máy móc, các loại pipette nhiễm ADN từ những lần làm thử nghiệm trước, nhiễm sản phẩm của lần khuếch đại trước hay nhiễm chéo ADN giữa các mẫu Để tránh nhiễm và làm giảm tỷ lệ dương tính giả, cần tuân thủ các nguyên tắc phòng thí nghiệm như sau:

 Trang thiết bị phòng thí nghiệm

 ít nhất phải tách biệt được các khu vực làm việc trước PCR, PCR, và sau PCR, các khu vực này được bố trí theo luồng một chiều;

 Nếu có thể, nên làm PCR trong hốt sinh học phân tử có trang bị đèn tím, máy ly tâm nhẹ (máy spin down) và găng tay dùng một lần đặc chủng cho sinh học phân

tử Không nên sử dụng bộ pipette cho sinh học phân tử chung với các loại thử nghiệm khác, pipette cho chứng dương phải riêng biệt, và luôn dùng các loại đầu côn lọc vô trùng

 Xử lý mẫu và kỹ thuật thao tác

 Luôn tuân thủ các kỹ thuật vô trùng, đi găng tay mới khi làm việc ở khu vực PCR

và tuyệt đối tránh tạo bọt khí;

 Khi chuẩn bị sinh phẩm, hóa chất, luôn sử dụng dụng cụ thủy tinh hay nhựa mới và/hoặc vô trùng, và trước đây chưa bao giờ được sử dụng để tách chiết AND Sấy ướt mọi sinh phẩm và dung dịch không ảnh hưởng đến phản ứng, trừ mồi, các dNTP, và Taq Sinh phẩm và dung dịch dùng cho PCR cần được xẻ thành một lượng nhỏ và bảo quản riêng biệt, không dùng chung với các loại kỹ thuật khác;

 Mỗi phản ứng luôn kèm các chứng gồm chứng âm (có đầy đủ các thành phần của phản ứng nhưng không có mặt khuôn mẫu), các chứng dương (lý tưởng nên có chứng dương tính vừa và dương tính yếu để kiểm soát hiệu quả khuếch đại của phản ứng) Khi cần xác định sự có mặt của chất ức chế trong mẫu bệnh phẩm thì cho vào chứng dương tính yếu một lượng dư mẫu bệnh phẩm hoặc dùng kỹ thuật đồng khuếch đại chứng dương bằng cách thay thế một khu vực nào đó trong sản phẩm PCR gốc bằng một trình tự đã biết và thêm sản phẩm biến đổi này vào các tube bệnh phẩm cần xét nghiệm, sau đó dùng đầu dò đặc hiệu với trình tự đã biết

để phát hiện sản phẩm biến đổi và nếu trong mẫu bệnh phẩm không có mặt các chất ức chế thì phản ứng sẽ có kết quả dương tính

 Loại nhiễm bằng UNG:

Một trong số các nguồn dễ gây nhiễm nhất cho PCR là sản phẩm PCR của chính những lần khuếch đại trước nên có thể sử dụng enzyme Uracil ADN Glycosylase (UNG) để phá hủy các sản phẩm này bằng cơ chế enzyme và hóa học nhưng không phá hủy ADN tự nhiên (khuôn mẫu hay đoạn mồi) UNG xúc tác quá trình loại bỏ uracil khỏi ADN sợi đơn hoặc kép được tổng hợp từ dUTP – một trong 3 loại nucleotide của PCR Dưới tác dụng của UNG, các vị trí kiềm được hình thành và trong điều kiện nhiệt độ cao, pH kiềm, các

vị trí kiềm này sẽ bị phân cắt

1.4 Lưu ý với RT-PCR: giống với PCR và cần chú ý thêm

 Loại enzyme phiên mã ngược

Enzyme phiên mã ngược là ADN polymerase phụ thuộc ARN, xúc tác quá trình tổng họp

từ ARN thành sợi đơn ADN bổ trợ đầu tiên và sau đó là tổng hợp chuỗi ADN đầu tiên

Trên thị trường thường lưu hành 3 loại enzyme có hoạt tính phiên mã ngược là AMV, M-MuLV, và Tth Các loại enzyme này có hoạt tính tối ưu ở các độ pH,

nồng độ muối, và nhiệt độ ủ khác nhau nên cần tối ưu hóa các điều kiện phản ứng cho từng loại AMV và M-MuLV có khả năng tổng hợp ADN bổ trợ dài tới lOkb, còn khả năng tổng hợp của Tth là 1 – 2 kb

l.4.2 Một sô đặc điểm của từng loại enzyme phiên mã ngược

 Hoạt tính RNase H:

Hoạt tính RNase H cho phép phá hủy đặc hiệu ARN trong phức hợp (ARN) – (ADN bổ trợ), hiện tượng này không có lợi cho PCR nếu quá trình phá hủy khuôn mẫu ARN cạnh tranh với quá trình tổng hợp ADN khi tạo sợi ADN bổ trợ đầu tiên Không giống với Tth, AMV và M-MuLV có hoạt tính RNase H trong đó hoạt tính của M-MuLV thấp hơn AMV Hiện tại đã

có một số enzyme được gây đột biến để giảm hoạt tính này

 Nhiệt độ hoạt động tối ưu:

Nhiệt độ hoạt động tối ưu của M-MuLV là 37°c, AMV là 42°c, Tth là 60 – 70°c, do đó nếu ARN khuôn mẫu có chứa nhiều cấu trúc bậc 2 thì không nên dùng M-MuLV

 Nhu cầu ion hóa trị 2:

Một trong số những nhược điểm của Tth là enzyme này cần ion kim loại hóa trị hai

Mn2+ chứ không phải Mg2+ mà Mn2+ có ảnh hưởng đến độ chính xác của phản ứng

 Khả năng khuếch đại:

Ưu điểm duy nhất của Tth là vừa có vai trò enzyme phiên mã ngược, vừa là enzyme trong PCR nên sử dụng enzyme này trong RT-PCR một bước vừa làm giảm nguy cơ nhiễm, vừa đơn giản các bưóc thực hiện

2 Các loại PCR

Không có một thường quy chung để khuếch đại mọi ADN hay ARN mặc dù các bộ sinh phẩm thương mại hóa thường thuận tiện và có thể áp dụng với nhiều đoạn mồi cũng như nhiều phương pháp tách chiết acid nucleic, vì vậy, cần hiểu rõ tác nhân và gien đích đang được khuếch đại để đạt được điều kiện phản ứng tối ưu

2.1 PCR tại chỗ (In situ PCR)

PCR tại chỗ kết hợp được ưu điểm về độ nhạy và khả năng lai tại chỗ để định vị các trình

tự đích do acid nucleic được khuếch đại ngay trong tế bào nên được ứng dụng trong nghiên cứu bệnh học, nhiễm thể ẩn, tế bào học, huyết học, chẩn đoán căn nguyên gây biến đổi hình thái bên trong tổ chức và tế bào v.v Phương pháp này có hạn chê chính là

độ nhạy không cao như các kỹ thuật PCR khác nên khó có thể phát hiện những bệnh phẩm có lượng khuôn mẫu quá ít trừ trường hợp cá biệt như phát hiện human papillomavi rỳt (HPV) thì độ nhạy của phương pháp này có thể đạt 1 bản sao

 PCR in situ gián tiếp

Nhỏ phức hợp PCR (đệm, mồi, dNTP, enzyme khuếch đại) lên tiêu bản tế bào hoặc lát cắt tổ chức mô đã cố định trên lam kính, phủ dầu khoáng và chạy máy Sản phẩm PCR trong tế bào được phát hiện bằng phương pháp lai tại chỗ cổ điển sử dụng đầu dò không đánh dấu phóng xạ Cũng có thể lấy cẩn thận sản phẩm phản ứng và chạy điện di trên

thạch agarose hoặc làm kỹ thuật southern blot để xác định kích thước sản phẩm Quá trình khuếch đại có thể xảy ra bên ngoài tế bào nếu có hiện tượng dò gỉ

 PCR in situ trực tiếp

Trong phức hợp PCR, nồng độ của một loại dNTP bị giảm xuống và được thay bằng một loại dNTP khác gắn biotin hay dig, sau đó nhỏ phức họp này lên tiêu bản tế bào hoặc lát cắt tổ chức mô đã cố định trên lam kính rồi chạy PCR như mô tả ở trên Sản phẩm PCR trong tế bào được phát hiện bằng đầu dò đánh dấu Một trong số các nhược điểm của kỹ thuật trực tiếp là độ đặc hiệu thấp kể cả khi đã áp dụng PCR hot start

2.2 Các loại PCR khác

2.2.1 PCR làm tổ (PCR 2 vòng/nested PCR)

Đặc điểm của phương pháp này là khoảng 15-30 chu kỳ khuếch đại vòng hai được thực hiện trên cơ sở sản phẩm vòng một và cặp mồi mới có trình tự nằm phía trong sản phẩm của vòng một Lần khuếch đại thứ hai cho một sản phẩm ADN ngắn hơn vòng một nhưng hiệu giá khuếch đại cao hơn Phương pháp này làm tăng độ nhạy của phản ứng nhiều lần, nhất là khi trong mẫu bệnh phẩm có nhiều chất ức chế, ngoài ra còn có tác dụng giúp khẳng định sản phẩm vòng một Mồi có mặt trong phản ứng vòng một có thể gây nhiễm, làm giảm hiệu quả khuếch đại phản ứng vòng hai và tạo ra nhiều dải ADN nên cần pha loãng 10 – 100 lần hoặc làm tinh sạch sản phẩm vòng một bằng ly tâm qua lọc phân tử Centricon 30 trước khi khuếch đại vòng hai Cần cân nhắc khi quyết định sử dụng kỹ thuật này để chẩn đoán thường xuyên vì nguy cơ nhiễm ADN gây dương tính giả của kỹ thuật này rất cao

2.2.2 PCR không đối xứng

Có thể sử dụng kỹ thuật PCR không đối xứng để tạo ra một sản phẩm ADN cho các mục đích khác nhau như giải trình tự gien hoặc sản xuất đầu dò ADN Đây là kỹ thuật PCR chuẩn thức nhưng nồng độ mồi không bằng nhau (không đối xứng) nên hiệu quả phản ứng thấp hơn Trong chu kỳ đầu tiên, hầu hết các sản phẩm được tạo ra đều là ADN chuỗi kép, khi một mồi đã cạn kiệt mà các chu kỳ khuếch đại vẫn được thực hiện thì phản ứng chỉ tổng hợp được một loạt các chuỗi bổ trợ

 PCR đa mồi (multiplex PCR)

PCR đa mồi là phương pháp sử dụng nhiều cặp mồi để khuếch đại cùng lúc nhiều khu vực trên ADN đích, có thể sử dụng kỹ thuật này để định nhóm hoặc phân loại vi rỳt bằng các trình tự acid nucleic Nhiệt độ gắn của các mồi phải khá tương đồng (khác biệt dưới 10°C) để đảm bảo được tính cân đối trong quá trình khuếch đại các sản phẩm khác nhau tránh hiện tượng không thể phát hiện được một sản phẩm khuếch đại nào đó

Tương tự như vậy, kích thước các sản phẩm đích cũng phải tương tự nhau vì những sản phẩm ngắn hơn được khuếch đại tốt hơn Hiện tại RT-PCR đa mồi cũng đã được áp dụng rất phổ biến ở nhiều phòng thí nghiệm, phục vụ công tác chẩn đoán và nghiên cứu sàng lọc

2.2.4 Thoái hóa mồi cho PCR

Khi không biết hoặc không thể xác định được chính xác trình tự một đoạn ADN từ trình

tự acid amin thì có thể thực hiện kỹ thuật thoái hóa mồi để mọi khả năng kết hợp mã di truyền bộ ba có thể xảy ra với một trình tự acid amin đã biết nhưng cần tránh thoái hóa

từ đầu 3’ Có thể tạo ra sự thoái hóa bằng cách khuếch đại khi có mặt một phức hợp mồi

có mọi mã bộ ba hoặc sử dụng các mồi có chứa deoxyinosine, là chất tạo sự linh hoạt trong quá trình bắt cặp base

 Đánh dấu mồi cho PCR

Có thể gắn một số trình tự chức năng hoặc chất đánh dấu vào đầu 5’ của một hoặc cả hai mồi để chèn vào sản phẩm PCR trong quá trình khuếch đại như biotin hay dig, chất huỳnh quang, enzyme, vị trí enzyme giới hạn, các trình tự hoạt hóa ARN polymerase v.v….để phục vụ cho bước tóm bắt, phát hiện sản phẩm PCR, và các mục đích khác

Hình 2: Sơ đồ chung cho PCR và RT-PCR

2.3 Real-time PCR

Trong sinh học phân tử, real-time PCR, hay còn gọi là PCR định lượng trực tiếp, hay còn gọi là PCR động học, là một dạng biến đổi của PCR chuẩn thức để khuếch đại và nếu kèm gam chuẩn thì đồng thời định lượng một trình tự đích đặc hiệu khi chúng tích tụ lại

ở một thời điểm nhất định sau mỗi chu kỳ phản ứng Hệ thống “real-time” tuân thủ thường quy chung của PCR nhưng cho một đường cong khuếch đại tương tự đường cong