Mục tiêu
Sau khi thực hành bài “Dược liệu chứa Coumarin”, sinh viên phải:
- Thực hiện được các phản ứng định tính Coumarin trong dược liệu.
- Áp dụng được phương pháp sắc lý lớp mỏng để định tính Coumarin trong dược liệu.
I. CƠ SỞ LÝ THUYẾT
Coumarin là các hợp chất thuộc nhóm phenylpropanoid (C6 – C3) với khung cơ bản là benzo- α -pyron, có một số tính chất sau:
- Thường tồn tại dưới dạng aglycon, dễ kết tinh, không màu, có mùi thơm, dễ thăng hoa.
- Dạng glycosid có thể tan trong nước, dạng aglycon thường dễ tan trong dung môi hữu cơ kém phân cực.
- Phát huỳnh quang duuwosi UV 365, cường độ huỳnh quang phụ thuộc vào nhóm oxy của phân tử coumarin cũng như pH của dung dịch, mạnh nhất đối với coumarin có nhóm OH ở C7
- Do có vòng lacton (ester nội) nên coumarin dễ bị mở vòng bởi kiềm tạo thành muối tan trong nước và sẽ đóng vòng trở lại khi acid hóa.
- Sau khi mở vòng lacton bằng dung dịch kiềm, các coumarin đơn giản sẽ tạo thành dẫn chất hydroxy cinnamic dạng cis (muối của acid coumarinic), có huỳnh quang yếu ở UV 365nm, chất này sẽ chuyển thành dạng trans (muối của acid coumaric), có huỳnh quang mạnh hơn.
II. THỰC HÀNH
1. Nguyên vật liệu thí nghiệm 1.1. Hóa chất và thuốc thử
- Cồn 96%
- Dung dịch FeCl3 1%
- Dung dịch NaOH 5%
- Thuốc thử diazonium - NaOH 1%
- HCl đậm đặc - CHCl3
S1 = benzen - ethyl acetat (10:1) S2 = benzen – aceton (10:1)
- Bản mỏng Silicagel GF254 tráng sẵn.
1.2. Dược liệu
- Ba dót (Folium Eupatorii), là lá của cây ba dót (Eupatorium triplinerve Vahl.), họ Cúc (Asteraceae).
- Bạch chỉ (Radix Angelicae dahuricae), là rễ củ của cây bạch hcir (Angelica dahurica (Fisch. Ex Hoffm) Benth. Et Hook. f.), hoặc (Angelica dahurica (Fisch ex Hoofm) Benth. et Hook. f.var.formosana (Boiss) Shan et Yuan.), họ Hoa tán (Apiaceae).
- Tiền hồ (Radix Peucedani), là rễ của cây tiền hồ (Peucedanum prearuptorum Dunn.), hoặc P. decursivum (Miq) Maxim.), họ Hoa tán (Apiaceae).
- Rễ tranh (Rhizoma Imperatae) là thân ngầm của cây Cỏ tranh (mperata cylindrica Beauv., Poaceae)
2. Nội dung thực tập 2.1. Chiết xuất coumarin
Cân khoảng 1g bột dược liệu, cho vào bình nón 100ml. Thêm 20ml cồn 96%, đun trong nồi cách thủy sôi 5 phút. Lọc qua bông. Dịch chiết thu được để làm các phản ứng định tính và sắc ký lớp mỏng.
2.2. Định tính coumarin bằng phản ứng hóa học 2.2.1. Phản ứng với dung dịch FeCl3
Cho 1 ml dịch chiết vào ống nghiệm, cho 2-3 giọt FeCl3 1%, sẽ cho màu xanh (phản ứng dương tính nếu coumarin có OH phenol tự do)
2.2.2. Phản ứng mở đóng vòng lacton
Cho vào 2 ống nghiệm mỗi ống 2 ml dịch chiết - Ống 1: thêm 4 ml nước cất, dung dịch trở nên đục - Ống 2: thêm 4 ml dung dịch NaOH 10%
Ðun cách thủy 2 ống trong 2-3 phút. Ðể nguội, thêm vào mỗi ống 2 ml nước cất.
Thấy ống 2 trong hơn ống 1. Acid hoá ống 2 bằng vài giọt HCl đặc sẽ thấy 2 ống đục như nhau.
2.2.3. Phản ứng diazo hoá
Cho vào ống nghiệm 2 ml dịch chiết. Thêm vào đó 1 ml dung dịch NaOH 5%.
Ðun cách thuỷ đến sôi rồi để nguội. Cho vài giọt thuốc thử Diazo sẽ có màu đỏ hoặc đỏ cam.
2.2.4. Sự tăng huỳnh quang trong môi trường kiềm dưới tác dụng của tia UV Quan sát huỳnh quang của các vết coumarin dưới ánh sáng tử ngoại khi tác dụng với dung dịch kiềm (Phản ứng chuyển từ đồng phân cis sang đồng phân trans dưới tác dụng của tia tử ngoại)
Nhỏ 1 giọt dịch chiết (ở mục 2.1) lên giấy lọc., chờ khô dung môi và lặp lại như trên 4 lần nữa. Nhỏ tiếp 1 giọt dung dịch NaOH 5%. Sấy khô. Che nửa vết dịch chiết bằng một miếng kim loại (chìa khoá, đồng xu v.v...) rồi đem soi UV 365 nm trong 1-2 phút.
Bỏ miếng kim loại ra, quan sát tiếp dưới đèn tử ngoại sẽ thấy: phần không bị che có huỳnh quang sáng hơn phần bị che. Nếu tiếp tục chiếu tia tử ngoại, phần bị che sẽ sáng dần lên, sau vài phút cả hai phần đều phát quang như nhau.
2.2.5. Thử nghiệm vi thăng hoa
- Cho một ít bột dược liệu vào 1 chén nung nhỏ, trải đều dược liệu thành một lớp mỏng dưới đáy chén. Đặt chén nung lên bếp điện hoặc nồi cách cát. Đảo đều dược liệu đến khi không còn hơi nước bốc lên. Đặt 1 phiến kính lên miệng chén. Trên phiến kính đặt 1 miếng bông thấm nước lạnh, liên tục thay miếng bông này. Sau khoảng 10 – 15 phút, lấy phiến kính đem soi dưới kính hiển vi sẽ thấy có các tinh thế hình kim không màu.
2.3. Định tính coumarin bằng sắc ký lớp mỏng - Bản mỏng Silicagel GF254 tráng sẵn.
- Dịch chấm sắc ký: Dịch chiết cồn của dược liệu được bốc hơi trên cách thủy đến cắn. Hòa tan cắn với CHCl3, dùng dịch này chấm sắc ký, chấm 5 lần, sau mỗi lần chấm để khô 15 giây rồi mới chấm tiếp.
- Dung môi khai triển: S1 hoặc S2 (xem phần 1.1).
- Phát hiện: Sau khi triển khai, bản mỏng được để bay hết dung môi, quan sát bản mỏng dưới đèn UV 254, 365nm.
- Vẽ sắc ký đồ và tính giá trị Rf của các vết coumarin.
III. GỢI Ý THẢO LUẬN
1. Điều kiện thực hiện phản ứng diazo khi định tính coumarin. Nếu không mở vòng lacton, phản ứng có xảy ra không ?
2. Giải thích thử nghiệm đóng mở vòng lacton của coumarin
Giải thích sự tăng huỳnh quang của coumarin trong môi trường kiềm khi chiếu tia UV 365 nm, các yếu tố ảnh hưởng tới thử nghiệm này