Sau khi thực hành bài “Dược liệu chứa Anthranoid”, sinh viên phải:
- Thực hiện được các phương pháp định tính Anthranoid: phản ứng Borntrager, thử nghiệm vi thăng hoa, sắc ký lớp mỏng.
I. CƠ SỞ LÝ THUYẾT
- Anthranoid là những chất hữu cơ có khung căn bản là 9,10-diceton anthracen, khung này có thể ở dạng khử (anthron, anthranol, dihydroanthranol) hoặc dạng oxy hoá (anthraquinon). Trong dược liệu Anthranoid có thể ở dạng kết hợp (glycosid, anthraglycosid) hoặc dạng tự do (aglycon, anthraquinon).
- Dạng glycosid tan được trong các dung môi phân cực. Dạng aglycon tan được trong các dung môi kém phân cực (benzen, toluen, cloroform, dicloromethan, ether ethylic) - Dựa vào tính tan này, có thể chiết dạng glycosid hay dạng aglycon ra khỏi dược liệu bằng các dung môi thích hợp.
- Để định tính Anthranoid dạng oxy hóa, người ta dùng phản ứng Borntrager (các hợp chất Anthranoid phản ứng với kiềm tạo các phenolat có màu đỏ, đỏ tím… tan trong nước).
- Người ta cũng ứng dụng phản ứng này để định lượng Anthranoid bằng phương pháp quang (so màu, đo quang). Ngoài ra, Anthranoid dạng aglycon có thể thăng hoa nên còn định tính bằng thử nghiệm vi thăng hoa.
II. THỰC NGHIỆM
1. Nguyên vật liệu thí nghiệm 1.1. Hóa chất và thuốc thử
- Dicloromethan (DCM) hay cloroform - NaOH 10%
- H2SO4 25%
- NH4OH 10%
- Hệ dung môi sắc ký lớp mỏng
S1 = benzen - ethyl acetat - acid formic (75:24:1) S2 = benzen - ethyl acetat (9:1)
- Bản mỏng Silicagel GF254 tráng sẵn.
1.2. Dược liệu
- Muồng trâu (Folium Cassiae alatae), là lá của cây muồng trâu (Cassia alata L.), họ Đậu (Fabaceae).
- Thảo quyết minh (Semen Cassiae torae), là hạt của cây thảo quyết minh (Cassia tora L.), họ Đậu (Fabaceae).
- Đại hoàng (Rhizoma Rhei), là thân rễ của cây đại hoàng (Rheum palmatum L.), họ Rau răm (Polygonaceae)
- Nhàu (Radix Morindae citrifoliae), là rễ của cây nhàu (Morinda citrifolia L.), họ Cà phê (Rubiaceae).
2. Nội dung thực tập
2.1. Định tính Anthranoid bằng phản ứng Borntrager
2.1.1. Định tính Anthranoid tự do dạng oxy hóa (aglycon, anthraquinon)
- Lấy 1 g bột dược liệu cho vào 1 erlen 50ml, thêm dicloromethan (DCM) hay ether hoặc chloroform cho thấm đều và ngập mặt dược liệu 1 cm, lắc kỹ. Lọc dịch chiết qua bông vào 1 erlen 50ml. Giữ lại bã dược liệu.
Thêm 3 ml dung dịch NaOH 10%, lắc kỹ. Lớp kiềm sẽ có màu đỏ. Rút bỏ lớp DCM.
Giữ lại lớp kiềm.
2.1.2. Định tính Anthranoid dạng kết hợp (glycosid, anthraglycosid)
- Cho vào bã dược liệu đã để khô dung môi một lượng acid sulfuric 25% đủ để thấm đều và ngập mặt dược liệu 1 cm. Đặt erlen trên cách thủy trong 10 phút để thủy phân.
Để nguội, thêm 10 ml DCM, lắc kỹ. Lọc qua bông vào 1 becher 50ml. Tách lấy lớp DCM cho vào bình lắng gạn có chứa sẵn 3 ml dung dịch NaOH 10%, lắc kỹ. Lớp kiềm sẽ có màu đỏ. Rút bỏ lớp DCM . Cho lớp kiềm ở 2.1.2 vào bình lắng gạn.
2.1.3. Định tính acid chrysophanic
Cho vào bình lắng gạn dung dịch H2SO4 25% đến khi có màu vàng. Thêm 20 ml DCM, lắc kỹ. Rút bỏ lớp H2SO4 trong bình lắng gạn. Rút 3 ml DCM vào 1 bercher 50 ml để dành chấm sắc ký. Cho 10 ml NH4OH 10% vào lắc rồi gạn bỏ. Chiết đến khi lớp NH4OH không màu thì ngưng. Lớp DCM được lắc tiếp với dung dịch NaOH 10%.
Nếu lớp NaOH có màu hồng tới đỏ thì hỗn hợp có chứa acid chrysophanic.
2.2. Thử nghiệm vi thăng hoa
- Cho một ít bột dược liệu (Đại hoàng) vào 1 chén nung nhỏ, trải đều dược liệu thành một lớp mỏng dưới đáy chén. Đặt chén nung lên bếp điện hoặc nồi cách cát. Đảo đều dược liệu đến khi không còn hơi nước bốc lên. Đặt 1 phiến kính lên miệng chén. Trên
phiến kính đặt 1 miếng bông thấm nước lạnh, liên tục thay miếng bông này. Sau khoảng 10 – 15 phút, dẫn chất anthraquinon sẽ thăng hoa và bám vào mặt nước dưới của phiến kính
- Đem soi dưới kính hiển vi sẽ thấy có các tinh thế hình kim màu vàng. Sau đó nhỏ vào phiến kính 1 giọt NaOH 10% thì tinh thể sẽ tan ra và chuyển thành dung dịch có màu hồng.
2.3. Ðịnh tính các hợp chất anthranoid bằng sắc ký lớp mỏng - Bản mỏng Silicagel GF254 tráng sẵn.
- Dịch chấm sắc ký: lấy 0,5 ml dịch DCM ở phần 2.1.3, chấm 5 lần, sau mỗi lần chấm để khô 15 giây rồi mới chấm tiếp.
- Dung môi khai triển: S1 hoặc S2 (xem phần 1.1).
- Phát hiện: Sau khi triển khai, bản mỏng được để bay hết dung môi, quan sát bản mỏng dưới đèn UV 254, 366nm.
- Vẽ sắc ký đồ và tính giá trị Rf của các vết anthraquinon.
III. GỢI Ý THẢO LUẬN
1. Giải thích nguyên tắc định tính acid chrysophanic trong dược liệu
2. Nhận xét gì về sắc ký đồ (Rf, màu sắc vết...) của mẫu dược liệu khi triển khai với hệ dung môi S1 và S2