THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
3.3. Nghiên cứu tác dụng chống oxy hoá của dịch chiết nấm Linh chi
* Chuẩn bị dịch chiết: Cân chính xác khoảng 5g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 50ml, thêm nước, đun sôi, chiết trong 3 giờ chia làm 3 lần (lần thứ nhất 1,5 giờ, lần thứ hai 1,0 giờ, lần thứ ba 0,5 giờ) mỗi lần 30ml nước. Gộp các dịch chiết, cô thành cao - nước [1:1], lấy 1,5 ml dịch cao pha thành 100 ml ta được dịch chiết cần thử nồng độ 1,5 %.
* Tiến hành: Trong những lọ màu nâu cùng loại, cho hỗn hợp phản ứng gồm:
- 2 ml Tween 80 1%.
- 0,2 ml dung dịch muối sắt II (FeS04) 10' 3 M.
- 0,2 ml dung dịch acid ascorbic 10’2 M
- 0,6 ml dịch chiết thuốc (mẫu đối chứng thay bằng 0,6 ml nước cất) Đậy nút kín, lắc kỹ, ủ ở nhiệt độ 40°c trong 48 giờ. Lấy 2ml hỗn hợp sau khi ủ, thêm vào đó 1 ml dung dịch acid tricloracetic 30%, để yên trong 1 giờ, sau đó đem ly tâm 5 phút với tốc độ 4200 vòng/phút. Lấy 2ml dịch trong sau ly tâm, thêm 2ml dung dịch acid thiobarbituric 0,25%, đun cách thủy trong 15 phút, rồi để nguội đến nhiệt độ trong phòng. Đo màu của phức tạo thành ở bước sóng Ả = 532 nm. Tính lượng MDA với hệ số tắt 8 = 0,156 nm or'cm 'i
Nếu trong mẫu thử có chất chống oxy hoá thì lượng MDA tạo thành phải ít hơn mẫu đối chứng (tức mật độ quang của mẫu thử phải thấp hơn mẫu đối chứng).
Kết quả thực nghiệm được thể hiện ở bảng 9:
B ảng 9 . Kết quả hoạt độ chống oxy hoá theo phương pháp Blagodorop
TT M ẫu M ật độ quang (E) MDA (nmol/1) H T C O (%)
1 Mẫu chứng 0,121 4,659 0
2 Mẫu thử 1 0,050 1,925 58,68
3 Mẫu thử 2 0,049 1,887 59,50
4 Mẫu thử 3 0,053 2,041 56,19
5 Mẫu thử 4 0,051 1,964 57,85
6 Mẫu thử 5 0,047 1,810 61,15
Trung bình 58,67 ± 2,29
Với lượng MDA được tính theo công thức:
F 4 3
x = 3 = 3%5 . E 0,156. 2
Trong đó: X: Lượng MDA (đơn vị nmol/1)
E: Mật độ quang của mẫu đo
4: Thể tích mẫu khi đo quang (ml) 3: Thể tích toàn phần của mẫu phân tích (ml) 2: Thể tích dịch trong để xác định MDA (ml) 0,156: Hệ số tắt mol (nmol ' 1. cm '];i)
Hoạt độ chống oxy hoá được tính theo công thức:
HCTO = Xc - X t X 100 Xc
Trong đó: HTCO: Hoạt độ chống oxy hoá
x c. Lượng MDA của mẫu chứng
x t : Lượng MDA của mẫu thử
Trong thí nghiệm này nồng độ chất thử được dùng là:
(0,6ml X 0,015 g/ml) : 3 ml = 0,003 g/ml = 3 mg/ml
Nhán xét: Nấm Linh chi trồng ở Việt Nam với hàm lượng 3 mg dược liệu trong ỉ ml hỗn hợp phân tích có khả năng ức chế quá trình peroxyd hoá acid béo chưa no (Tween 80) với hoạt tính chống oxy hoá là 58,67 ± 2,29 % (so với mẫu đối chứng).
3.3.2. Nghiên cứu tác dụng chông oxy hoá bảo vệ tê bào gan theo phương pháp của Jawiga Robak và Misno Tanaka.
* Chuẩn bị dịch chiết cần thử:
Từ cao - nước [1:1] như ở phần [3.3.1] ta pha dung dịch cần thử với nồng độ 3g dược liệu trong 100 ml nước cất (3%).
* Chuẩn bị thuốc thử:
- Dung dịch acid Thiobabituric: 160 mg/20ml - Dung dịch Tricloacetic: 40 mg/lOOml
- Dung dịch muối sắt II (FeS04): 0,0165 g/1
* Chuẩn bị dung dịch đồng thể gan chuột:
- Chuột nhắt trắng khoẻ mạnh, mổ lấy gan. Nghiền lạnh với dung dịch KC1 trong máy nghiền đồng thể theo tỷ lệ 400 mg gan/ 9,6 ml KC1, thu được dung dịch đồng thể gan chuột.
* Cách tiến hành:
- Chuẩn bị giá ống nghiệm 5 ml, đánh số thứ tự và cho vào mỗi ống các dung dịch theo thứ tự ở bảng 10:
- Dung dịch KC1: U2g/\
- Dung dịch acid ascobic: 0,4325 g/1
B ảng 10: Trình tự cho các dung dịch vào ống nghiệm Ống
Mẫu
Ống thử 1
Ống thử 2
Ống thử 3
Ống thử4
Ống thử 5
Dịch đồng thể (ml) 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0
Dung dịch thử (ml) 0,0 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50
Muối sắt II F eS04(ml) 0,40 0,40 0,40 0,40 0,40 0,40
Acid ascobic (ml) 0,40 0,40 0,40 0,40 0,40 0,40
Dung dịch KC1 (ml) 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 0,0
- Sau đó buộc kín ống nghiệm, ủ ở nhiệt độ 37° c trong 30 phút, lấy ra, thêm vào mỗi ống 1 ml dung dịch acid tricloacetic 40%. Để yên 1 giờ, tiếp đó đem ly tâm 5 phút với tốc độ 3000 vòng/ phút. Lấy 2 ml dịch trong sau ly tâm thêm vào ỉ ml dung dịch acid thiobabituric 0.80 %, đun cách thuỷ trong 20 phút rồi để nguội đến nhiệt độ trong phòng. Đo màu của phức tạo thành ở bước sóng X = 532 nm. Tính ra lượng MDA thông qua mật độ quang với hệ số tắt 8 = 0,156 nmol' 1 cnv'l.
Kết quả thực nghiệm được thể hiện ở bảng 11:
Bảng 11: Kết quả hoạt độ chống oxy hoá bảo vệ tế bào gan (invitro)
TT Mẫu Thể tích
(mi)
Nồng độ (mg/ml)
Mật độ quang (E)
MDA (nmol/1)
HTCO (%)
1 Mẫu chứng 0,00 0,0 0,353 11,9 0,0
2 Mẫu thử 1 0,10 0,91 0,309 9,79 12,51
3 Mẫu thử 2 0,20 1,82 0,224 7,10 36,55
4 Mẫu thử 3 0,30 2,73 0,195 6,18 44,77
5 Mẫu thử 4 0,40 3,64 0,129 4.09 63,45
6 Mẫu thử 5 0,50 4,55 0,095 3,10 73,10
Lượng MDA tạo thành được tính dựa vào mật độ quang theo công thức:
X : Lượng MDA (đơn vị nmol/1) E : Mật độ quang của mẫu đo 3 : Thể tích mẫu khi đo quang (ml)
3,3: Thể tích toàn phần của mẫu phân tích (ml) 2 : Thể tích dịch trong để xác định MDA (ml) 0,156: Hệ số tắt mol (n m o l'1. cm '1^)
Hoạt độ chống oxy hoá (HTCO) được tính theo công thức như ở phần
Lượng MDA tạo thành và hoạt độ chống oxy hoá của dịch chiết nấm Linh chi được thể hiện trên biểu đồ 1 và biểu đồ 2.
Biểu đồ 1: Lượng MDA tạo thành Biểu đồ 2 :Hoạt độ chống oxy hoá Trong đó
[3.3.1].
Lượng MDA tạo thành Hoạt độ’ ằ chống oxy hoỏ MDA
15
HTCO
10
0
5
11.19 9.79
Mẫ.u thử MO MI M2 M3 M4 M5
MO MI M2 M3 M 4 M5
Nhân xét: Từ kết quả ở bảng và biểu đồ trên cho thấy lượng MDA của mẫu thử giảm đi rõ rệt khi nồng độ chất trong mẫu thử tăng. Điều này cho thấy dịch chiết nấm Linh chi trồng ở Việt Nam có chứa chất chống oxy hoá
với hoạt tính chống oxy hoá khá cao (73,10 % với nồng độ4,55mg dược liệu trong 1 m í hỗn hợp nghiên cứu).
Phần IV