THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
3.2. Nghiên cứu vê thành phần hoá học của nấm Linh chi trồng ở Việt Nam
Kết quả định tính sơ bộ các nhóm chất được trình bày ở bảng 3.
Bảng 3: Kết quả định tính sơ bộ các nhóm chất trong nấm Lỉnh chi
STT Tên nhóm chất Phản ứng Kết quả Kết luận
1. Alcaloid Tạo tủa với thuốc thử chung:
T.T Mayer +
T.T Dragendoff + Có
T.T Buchardat +
2. Saponin Quan sát hiện tượng tạo bọt +
Phản ứng Sankowski + Có
Phản ứng Rozentalơ +
3. Flavonoid Phản ứng Cyanidin +
Phản ứng với kiềm + Có
Phản ứng với FeCl3 5% +
4. Anthraglycosid Phản ứng Bortraeger - Không
Vi thăng hoa -
5. Acid amin Phản ứng Ninhydril + Có
6. Glycosid tim Phản ứng Legal -
Phản ứng Keder - Không
Phản ứng Baljet -
' 7. Coumarin Phản ứng đóng mở vòng lacton -
Phản ứng Diazo hoá - Không
Vi thăng hoa -
8. Sterol Phản ứng Liberman + Có
Phản ứng Roseheim +
9. Polysaccharid Phản ứng với Iod + Có
* Nhân xét: Kết quả ở bảng 3 cho thấy trong thành phần của nấm Linh chi có một số nhóm chất chính: Saponin, Flavonoid, Sterol, Alcaloid, Polysaccharid, Acid amin.
3.2.2. Sơ đồ chiết xuất các hợp chất trong nấm Linh chi
Từ kết quả định tính ở phần 3.2.1, chúng tôi xây dựng sơ đồ quy trình chiết xuất một số nhóm chất trong nấm Linh chi như sau:
* Tiến hành:
Bột dược liệu khô (100 gam) được chiết trong Shoxhlet bằng dung môi ether dầu hoả trong 16 giờ thu được dịch chiết ether dầu.
Bã dược liệu sau khi đã chiết bằng ether dầu được làm khô, tiếp tục chiết trong Shoxhlet bằng dung môi methanol cho đến khi hết phản ứng của Flavonoid (thử bằng hơi amoniac) được dịch chiết methanol. Cất thu hổi dung môi dưới áp suất giảm được cắn, hoà tan cắn bằng một lượng tối thiểu cồn 96°
(đun nóng). Dịch cồn thu được cho từ từ vào Aceton để tạo tủa. Gạn lấy tủa rồi hoà tủa vào nước cất nóng, lọc. Dịch lọc được lắc vói n-Butanol (3 lần). Gạn lấy lớp n-Butanol, cất thu hồi dung môi trong bình cất quay dưới áp suất giảm ta được cắn B.
Dịch gạn Ethanol và Aceton ở trên được bốc hơi trên nồi cách thuỷ đến cắn. Hoà tan cắn trong nước cất nóng, lọc. Dịch lọc được lắc với Ethylacetat, gạn lấy phần dịch Ethyacetat, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm ta được cắn A.
3.2.3. Sơ bộ xác định s ố các chất trong cắn A (cắn từ dịch chiết ethylacetat) bằng sắc ký lớp mỏng'.
- Hoà tan một ít cắn A vào methanol để chấm sắc ký.
- Bản mỏng tráng sẵn Silicagen G đã được hoạt hoá ở 110°C/30\
- Hệ dung môi khai triển:
+ Hệ [1] Toluen: Ethylacetat: Acid formic [5:6: 1,5].
+ Hệ [2] Ethylacetat: Acid íormic: H90 [19: 1:1].
+ Hệ [3] CHC13: MeOH [9:1].
Sau khi khai triển, quan sát dưới đèn tử ngoại bước sóng Ằ, = 366 nm và hiện màu bằng hơi iod, kết quả cho thấy bản sắc ký đồ với hệ dung môi thứ
[3] tách tốt nhất cho 12 vết (Ký hiệu từ A| đến A 12) có Rf X 100 lần lượt tương ứng là: 84; 77; 73; 70; 62; 58; 51; 45; 31; 11; 9; 1.
- Mặt khác tiến hành sắc ký hai chiều trên bản mỏng với 2 hệ dung môi [1] và [3]. Kết quả sắc ký đồ khi soi dưới đèn tử ngoại bước sóng Ằ, = 366 nm được thể hiện ở hình 2.
H ình 2: sắc ký đồ 2 chiều của cắn A với hệ dung môi [11 và [3 ì
+ Chiều 1: CHC13: MeOH [9: 1].
+ Chiều 2: Toluen : Ethylacetat: Acid formic [5 : 6 :l,5ị.
* Nhân xét: Kết qúả khảo sát sơ bộ trên sắc ký lớp mỏng 1 chiều và 2 chiều cho thấy trong dịch chiết ethylacetat (cắn A) có ít nhất 16 vết chất.
3.2.4 Phân lập các chất trong cắn A bằng sắc ký cột
* Chuẩn bị cột theo phương pháp nhồi cột ướt:
Cột (đường kính (p = 2 cm, dài 50 cm) được lắp cố định vào giá, đáy cột có lót một lớp bông. Chất hấp phụ là Silicagen cỡ hạt 60 - 200 |j.m (đã được hoạt hoá ở 110°c/ giờ) được trộn đều vói cloroíorm thành một hỗn dịch. Mỏ' khoá ở cột, rót hỗn dịch trên vào cột, cho dung môi chảy để chất hấp phụ lắng tự nhiên xuống đáy cột. Tiếp tục dùng dung môi hứng được rót lên cột và cho chảy liên tục một thời gian đến khi cột chất hấp phụ hoàn toàn ổn định (Chú ý trong suốt quá trình thực hiện không được để dung môi khô ở cột).Tỷ lệ Silicagen và chất cần tách là khảng [50:1].
* Chuẩn bị hỗn hợp chất cần tách: Hoà tan cắ n A trong một lượng tối thiểu Methanol, rồi trộn với một lượng Silicagen thành bột tơi khô (Bột A- S).
*Đưa chất lên cột: Cột sau khi đã được ổn định, đưa phần bột (A- S) đã chuẩn bị ở trên vào cột, dàn đều thành một lớp mỏng. Phủ lên bề mặt một lớp mỏng Silicagen.
* Khai triển cột và rửa giải cột: Dùng hệ dung môi Cloroíòrm: Methanol với tỷ lệ thay đổi dần từ [100: 0], [98: 2] đến [82: 18]. Ta hứng được 117 ống.
Kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi: Toluen: Ethylacetat: Acid formic [5: 6 : 1,5], theo dõi từ đó gộp được các ống có số vết với Rf tương tự nhau, được 6 phân đoạn.
+ Các phân đoạn 1, 2, 4, 5, 6 có nhiểu vết.
+ Phân đoạn 3 (từ ống 54 đến 72) có 3 vết trong đó có một vết rất đậm.
Do đó ta lấy phân đoạn này để phân lập tiếp.
* Phân đoạn 3 lại tiếp tục chạy sắc ký cột lần 2 với cách tiến hành như lần 1. Qua kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng gộp được 3 phân đoạn
+ Phân đoạn 1,: ố n g 1 - 17 có 2 vết.
+ Phân đoạn 2,: ố n g 18 - 24 có một vết (vết đậm cần tách).
+ Phân đoạn 3,: ố n g 25 - 50 có 2 vết.
Lấy phân đoạn 2|, để dung môi bay hơi tự nhiên thấy kết tinh được chất tinh thế hình kim màu vàng nhạt. Đặt tên chất này là LC1.
* Nhận dạng chất LC1:
- Tính chất: Tinh thể hình kim màu vàng nhạt tan trong methanol, ethanol và ethylacetat. (ảnh 6)
* Kiểm tra độ tinh khiết của chất LC2 bằng sắc ký lớp mỏng - Các hệ dung môi khai triển:
+ Hệ 1: Toluen: Ethylacetat: Acid íormic [5: 6 : 1,5]
+ Hệ 2: Ethylacetat: Acid íormic: Cloroíorm [8 :1 :1 ] (ảnh 7) + Hệ 3: Ethylacetat: Acid íormic: Nước [19: 1:1].
Kết quả được thể hiện ở bảng 4
Bảng 4. Kết quả sắc kỷ lớp mỏng của chất LC1
Hệ Rf X 100 AST >1 = 366 nm
X = 254 nm