BÁO CÁO HẾT MÔN THỰC TẬP DƯỢC LIỆU 1

- Sơ đồ định tính của Dược liệu Hoa Hòe: Dịch chiết Hoa Hòe + NaOH 1% + AlCl 3 1 % trong MeOH + FeCl 3 1 % + Chì acetat trung tính + Diazonium + Mg + HCl đđ Dung dịch có màu đậm h

BÁO CÁO HẾT MÔN THỰC TẬP DƯỢC LIỆU 1

I FLAVONOID

1 Phương pháp tiến hành

1.1 Chiết xuất:

- Nguyên liệu: 1g dược liệu Bột Hoa Hòe

- Sơ đồ chiết xuất:

1g bột Hoa Hòe vào bình nón 100ml

Thêm 25ml cồn 96%

Đậy nút bông và đun trên bếp cách thủy 5 phút, thỉnh thoảng lắc nhẹ

Lọc nóng qua bông thu được dịch chiết

- Sơ đồ định tính của Dược liệu Hoa Hòe:

Dịch chiết Hoa Hòe

+ NaOH 1% + AlCl 3 1 %

trong MeOH

+ FeCl 3 1 % + Chì acetat

trung tính + Diazonium

+ Mg + HCl đđ

Dung dịch có

màu đậm hơn

dịch chiết ở

ống chứng

(màu vàng

cam)

Tạo phức vàng lắng xuống đáy ống nghiệm

Tạo phức màu xanh đen

Dung dịch có màu đậm hơn dịch chiết ở ống chứng (màu vàng đậm hơn)

Dung dịch có màu đỏ cam

Dung dịch có màu đỏ

Phản ứng của nhóm OH phenol và nhân thơm

Phản ứng của vòng  -pyron (phản ứng Cyanidin)

2 Nhận xét:

• Phản ứng của nhóm OH phenol và nhân thơm

+ NaOH 1% : Do phản ứng của nhóm OH phenol và kiềm loãng tạo muối phenolat màu vàng cam tan trong nước (phản ứng tang màu trong môi

trường kiềm)

+ AlCl3 1% trong MeOH: Là thuốc thử làm tăng màu (Thuốc thử này chỉ quan sát rõ dưới UV 365nm, dưới ánh thường không thấy rõ sự thay đổi) + FeCl3 1%: Nhóm OH phenol phản ứng với FeCl3 tạo phức màu xanh đen + Chì acetat trung tính: Tạo tủa vàng nhạt đến vàng sậm với các flavonoid

có ortho-di-OH phenol

+ Diazonium: có nhóm OH ở vị trí 7 và vị trí 6,8 (vị trí ortho còn trống) nên

có thể phản ứng với muối diazoni để tạo thành azoic có màu đỏ

Chú ý: phản ứng chỉ xảy ra khi thực hiện trong môi trường kiềm yếu, nhiệt độ thấp và vị trí ortho, para còn trống

• Phản ứng của vòng  -pyron (phản ứng Cyanidin)

Ban đầu khi cho Mg vào dịch chiết thì chưa có hiện tượng gì xảy ra, Khi cho HCl đậm đặc vào thì dung dịch sủi bọt khí, chuyển màu từ vàng sang đỏ đậm một cách nhanh chóng Do vòng  -pyron bị khí H2 (Mg +HCl) khử thành nhân pyrilium

Chú ý: ống nghiệm phải thật khô, không cho quá nhiều bột Mg, thực hiện trong tủ Hood, xử lý ống nghiệm cẩn thận sau khi làm xong

3 Kết luận:

Dược liệu Hoa Hòe có flavonoid, phần lớn là Rutin thuộc nhóm flavonol

II COUMARIN

1 Phương pháp tiến hành

1.1 Chiết xuất:

- Nguyên liệu: 2g dược liệu Tiền Hồ

- Sơ đồ chiết xuất:

2g bột dược liệu cho vào 1 bình nón 100ml

Thêm 30ml cồn 96%

Đun sôi trên bếp cách thủy 10-15p

Lọc qua bông thu được dịch chiết

1.2 Định tính:

- Sơ đồ định tính của Dược liệu Tiền Hồ:

10 ml Dịch chiết Tiền Hồ

+ 2,5ml NaOH 10%

Đun cách thủy 2p Dịch chiết mở vòng của Tiền Hồ

Phản ứng đóng

mở vòng lacton

Phản ứng huỳnh quang/UV 365 nm

Phản ứng Diazo

Dược liệu Tiền Hồ mịn

bỏ vào trong chén sứ

Phản ứng vi thăng hoa

Ống

nghiệm1

2ml dịch

chiết + 4ml

nước cất

Ống nghiệm2 2ml dịch chiết mở vòng + 4ml nước cất

Ống nghiệm3 2ml dịch chiết mở vòng + 2 giọt HCl đđ+ 4ml nước cất

Đun trên bếp cách cát

2 Nhận xét:

• Phản ứng đóng mở vòng lacton:

- Ống 1: coumarin ở dạng đóng vòng không tan trong nước

- Ống 2: coumarin ở dạng mở vòng trong môi trường kiềm tan được trong nước

- Ống 3: khi bị acid hóa coumarin ở dạng mở vòng sẽ trở về dạng không phân

ly và đóng vòng trở lại nên khi cho nước cất vào sẽ không tan

• Sự tăng huỳnh quang trong môi trường kiềm dưới tác dụng của tia UV:

- Sau khi mở vòng lacton bằng dung dịch kiềm, coumarin tạo thành coumarinat

ở dạng cis, có huỳnh quang yếu trong UV 365nm Chất này sẽ chuyển thành dạng trans là coumarat có huỳnh quang mạnh hơn

Chú ý: Sau mỗi lần chấm dịch chiết lên giấy lọc phải sấy thật khô, phải che miếng kim loại trước khi bật đèn UV, tắt đèn UV sau khi xem xong

• Phản ứng với thuốc thử diazonium:

- Khi coumarin mở vòng có vị trí ortho, para còn trống nên có thể phản ứng với muối diazoni để tạo thành azoic có màu đỏ

Chú ý: phản ứng chỉ xảy ra khi thực hiện trong môi trường kiềm yếu, nhiệt độ thấp và vị trí ortho, para còn trống

• Phản ứng vi thăng hoa:

- Coumarin thường tồn tại dưới dạng aglycon nên có thể thăng hoa Tuy nhiên coumarin của Tiền Hồ lại khó thăng hoa do có nhóm thế cồng kềnh nên khó cho ra tinh thể

3 Kết luận:

Dược liệu Tiền Hồ có chứa coumarin

III ANTHRANOID

1 Phương pháp tiến hành

1.1 Định tính anthranoid bằng phản ứng Borntrager:

0,5g bột Dược liệu Đại

Hoàng cho vào erlen 50ml

1g bột Dược liệu Đại Hoàng cho vào bình nón 100ml

Thêm dicloromethan ngập mặt dược liệu 1cm

Thêm 50ml nước đun sôi, lắc kỹ, để nguội Lọc thu dịch chiết dicloromethan Lọc thu dịch chiết vào bình nón

Thêm 2ml H2SO4 25%, đun cách thủy 95˚C trong 10p

+ NaOH 10%

lắc kỹ Lớp dịch chiết DCM ở dưới sẽ mất màu

vàng và lớp kiềm chuyển sang đỏ đậm

Cho vào bình lắng gạn + 10ml DCM, lắc kỹ

Gạn lấy lớp DCM phía dưới

+ NaOH 10%

Lớp dịch chiết DCM ở dưới sẽ mất màu vàng và lớp kiềm chuyển sang màu hồng

(+++)

(+++)

1.2 Thử nghiệm vi thăng hoa:

Cho 1 ít bột dược liệu Đại Hoàng

vào 1 chén nung nhỏ

Đun trên bếp cách cát

Phản ứng vi thăng hoa

(++)

2 Nhận xét:

• Phản ứng Borntrager:

- Anthranoid dạng tự do phản ứng với kiềm tạo phenolat có màu đỏ tan trong nước Do DCM có tỉ trọng lớn hơn 1 nên sẽ nằm ở dưới còn lớp kiềm sẽ nằm ở trên

- Anthranoid dạng kết hợp sẽ được thủy phân thành anthranoid dạng tự do nhờ acid H2SO4

• Phản ứng vi thăng hoa:

- Anthranoid dạng aglycon có thể thăng hoa Để phân biệt với phản ứng vi thăng hoa của coumarin ta dùng bông gòn đã được làm ẩm với NaOH 10% quẹt nhẹ nơi có tinh thể Nếu là anthranoid thì sẽ cho màu đỏ

3 Kết luận:

Dược liệu Đại Hoàng có anthranoid dạng tự do

IV TANNIN

1 Phương pháp tiến hành

1.1 Chiết xuất:

- Nguyên liệu: 1g dược liệu Bàng

- Sơ đồ chiết xuất:

1 g bột dược liệu cho vào bình nón 50 ml

Thêm 30 ml nước sôi Đun cách thủy 10p

Lọc nóng lấy dịch lọc trong

1.2 Định tính:

- Sơ đồ định tính của Dược liệu Bàng:

Dịch chiết Bàng

+ Gelatin muối

+ FeCl3 1%

+ Chì acetat 1%

+ Đồng acetat 1%

Dung dịch

có màu đục

hơn so với

ống chứng

Dung dịch

có tủa trắng lắng xuống đáy

Dung dịch

có màu xanh đen

Dung dịch

có tủa trắng đục

2 Nhận xét:

• Phản ứng với gelantin muối:

- Tannin có nhiều nhóm OH phenol, tạo nhiều dây nối hydro với các mạch polypeptide của protein nên tạo tủa với dung dịch protein Đây là tính chất quan trọng để định tính tannin

• Phản ứng với muối kim loại nặng:

- Do tannin trong dược lệu Bàng có nhiều OH phenol nên có khả năng tạo phức với các ion kim loại Càng nhiều nhóm OH phản ứng (ortho-di-OH) thì màu của phức càng đậm

3 Kết luận:

Dược liệu Bàng có chứa tannin

4 Định lượng:

- Nguyên liệu: Dược liệu Trà (độ ẩm là 10,02%)

CÁCH XÁC ĐỊNH Xây dựng đường tuyến tính của chuẩn acid gallic

Xác định hàm lượng polyphenol (PP) toàn phần và hàm lượng và hàm lượng

PP không phải tannin

Dịch chiết + thuốc thử Folin-Ciocalteu

POLYPHENOL TOÀN PHẦN

P1

Dịch chiết đã loại tannin + thuốc thử

Folin-Ciocalteu

PP KHÔNG LIÊN KẾT VỚI CASEIN

Dịch chiết

+ Casein

Dịch chiết đã loại tannin

Tủa (tannin + casein)

P2

TANINOID TOÀN PHẦN = P1-P2

4.1 Xây dựng đường tuyến tính của chuẩn acid gallic:

Kết quả đường tuyến tính : y= 0,0606x +0,0432 (𝑅2=0,9902)

4.2 Chuẩn bị dung dịch thử:

Pha dung dịch chuẩn acid gallic 0,05 mg/ml

Chuẩn bị các giai mẫu có nồng độ 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0 μg/ml

Đo độ hấp thụ của các dung dịch thu được ở 760 nm,

chuẩn bị song song một mẫu trắng

Xây dựng đường chuẩn với độ hấp thụ là trục tung và nồng độ

dung dịch là trục hoành

1 g bột dược liệu vào bình định mức 250 ml

Thêm 150 ml nước sôi, siêu âm trong 20 phút

Thêm nước vừa đủ, lắc đều, để lắng

Lọc, hút chính xác 20 ml dịch lọc vào bình định mức 100 ml, thêm nước vừa

đủ đến vạch, lắc đều

Dung dịch thử

4.3 Xác định hàm lượng polyphenol toàn phần:

4.4 Xác định hàm lượng polyphenol không liên kết với casein:

Hút chính xác 2 ml dung dịch thử vào bình định mức 25 ml

+ 1 ml thuốc thử F-C + 10 ml nước

Thêm Na2CO3 29 % đến vạch, lắc đều

Đo độ hấp thụ của dung dịch

Lấy chính xác 25ml dung dịch thử vào bình nón nút mài 100ml đã có 0,6g casein

Lắc đều, để yên trong 15phút Lọc Hút chính xác 2ml dịch lọc sau cho vào bình định mức 25ml

+ 1 ml thuốc thử F-C + 10 ml nước

Thêm Na2CO3 29 % đến vạch, lắc đều

Đo độ hấp thụ của dung dịch

4.5 Kết quả định lượng:

Dịch chiết + FC Dịch chiết đã loại tannin bằng

casein + FC

Hình

Abs

(760 nm)

𝑃𝑥 = x × V × k × 100

m × 106 × (1 − h) x: Nồng độ polyphenol toàn phần trong dung dịch thử tính từ phương trình hồi quy

y = ax + b; với y là độ hấp thu của dung dịch thử sau khi phản ứng với FC (μg/ml) V: Thể tích của dịch chiết mẫu thử (ml)

k: Độ pha loãng của mẫu thử

m: Khối lượng cân của mẫu thử (g)

h: độ ẩm của mẫu dược liệu

• Hàm lượng polyphenol toàn phần (P1):

𝑦1 = 0,0606𝑥1+ 0,0432 0,477 = 0,0606𝑥1+ 0,0432

𝑥1 = 7,158 𝑚𝑐𝑔/𝑚𝑙

𝑃1 = 𝑥1 × V × k × 100

m × 106 × (1 − h)

𝑃1 = 7,158 × 250 × 62,5 × 100 1,0006 × 106 × (1 − 10,02%)

𝑃1 = 12,42%

• Hàm lượng polyphenol không liên kết với casein (P2):

𝑦2 = 0,0606𝑥2 + 0,0432 0,295 = 0,0606𝑥2+ 0,0432

𝑥2 = 4,155 𝑚𝑐𝑔/𝑚𝑙

𝑃2 = 𝑥2 × V × k × 100

m × 106 × (1 − h)

𝑃2 = 4,155 × 250 × 62,5 × 100 1,0006 × 106 × (1 − 10,02%)

𝑃2 = 7,21%

• Hàm lượng tannoid tính theo acid gallic trong dược liệu

Tannoid toàn phần (P3) = P1 – P2 = 12,42 – 7,21 = 5,21%

4.6 Những chú ý khi tiến hành định lượng:

- Dung dịch chuẩn gốc 0,5mg/ml (Bộ môn pha sẵn, bảo quản tủ lạnh), không

sử dụng pipep ướt để hút mẫu nếu không sẽ bị pha loãng nồng độ làm sai kết quả định lượng

- Tránh pha loãng các dịch chiết có nồng độ chính xác (dụng cụ ướt, )

- Trước khi hút phải tráng dụng cụ thật bằng dung dịch sẽ hút

- Đảm bảo thời gian đo UV của tất cả các mẫu phải đồng nhất (tính từ khi dịch chiết phản ứng với thuốc thử Folin-Ciocalteu

- Khi cân 0,6g casein vào bình nón nút mài 100ml thì bình nón phải khô

- Trường hợp dịch chiết đậm đặc, độ hấp thu nằm ngoài khoảng tuyến tính, cần pha loãng mẫu dịch chiết

4.7 Kết luận:

Dược liệu Trà có hàm lượng tannin là 5,21%