CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH hóa SINH

mỚLCùng ỵớisự nhát triển nhạnhchong của khoa 'Ọc Kỹ Thuật, các phương pnap phân tích ngày cang phát triển hơn,hiện đại hơn và có độ chính xác cao hơn, góp phần đắc lực cho việc kiểm tra

MỤC LỤC Contents

TÀI LIỆU THAM KHẦo.L ".j.r : "” ”::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::.77

carbohydrate, chất béo (lipid), chất đạm (protein), các vitamin, khoáng chất, và nước,

mà con người hay động vật có thể ăn hay uống được, với mục đích cơ bản là thu nạpcác chất dinh dưỡng nhằm nuôi dưỡng cơ thể hay vì sở thích

Tuy nhiên, các chất trong thực phẩm dễ bị chuyển hóa bởi nhiều yếu tố khácnhau trong quá trình chế biến và bảo quản.Một trong những yếu tố đó là enzyme.Dophản ứng enzyme mà chất lượng của các nguyên liệu trong quá trình chế biến và bảoquản tăng lên, hoặc giảm sút.Các biện pháp công nghệ trong sản xuất thực phẩm hoặc

là kìm hãm hoạt độ của các enzyme hoặc là tạo điều kiện để chúng hoạt động một cáchtối đa

Tất cả các thuộc tính lý, hoá, sinh của các thành phần thực phấm đều có thế đođược, biểu diễn được dưới dạng các thông số cụ thể.Việc phân tích, đo đạc và địnhlượng các thành phần hóa học thực phấm ngày càng được chú trọng để đảm bảo chấtlượng sản phẩm ihpăc nghiên cứu và tạo sảnjphẩm mỚLCùng ỵớisự nhát triển nhạnhchong của khoa 'Ọc Kỹ Thuật, các phương pnap phân tích ngày cang phát triển hơn,hiện đại hơn và có độ chính xác cao hơn, góp phần đắc lực cho việc kiểm tra chất

Yêu cầu đặt ra là phải xác định được hàm lượng các chất có trong thực phẩm,cũng như hoạt độ xúc tác của enzyme trong sản xuất thực phẩm.Trên cơ sở biết đượchàm lượng của các nguyên liệu hay các chất có trong thực phẩm, người ta xác địnhđược giá trị dinh dưỡng của sản phẩm thực phẩm.Việc xác định được hoạt độ xúc táccủa các enzyme trong thực phẩm nhằm biết được các biến đổi diễn ra trong chế biến,

từ đó có những cách thức sản xuất cho phù hợp

, Hóa sinh thực .phẩm là môn học .quan,trọng trong ngành thực phẩm, cung cấpcho chúng ta những kiến thức cần thiết về cấu tạo cũng như sự chuyển hóa của cácchất có trong thực phẩm khi đi vào cơ thể

Ngày nay, có rất nhiều phương pháp phân tích trong hóa sinh thực phẩm.Trongbài tiểu luận này, chúng em xin trình bày một số phương pháp phân tích phổ biến tronghóa sinh thực phẩm

Chúng em xin chân thành cảm ơn cô Phan Minh Anh Thư đã giúp chúng em hoàn thiệnbài báo cáo này.Vì kiến thức chuyên môn chưa tốt nên trong quá trình tìm hiểu khôngtránh khỏi thiếu sót, rất mong sự đóng góp ý kiến cô và các bạn

Protein là polymer của các amino acid.

Protein có nhiều chức năng quan trọng

• Dinh dưỡng: phát triển, tiêu hóa, trao đổi chất (enzyme)

•

Cấu trúc vật lý: phô mát, bánh mì, các chất tạo bọt, tạo gel

Các phương pháp xác định hàm lượng protein

1 Phương pháp Kjeldahl - Xác định hàm lượng N tổng

1.1 Nguyên tắc:

Khi đốt nóng phẩm vật cần phân tích với H2SO4 đậm đặc, các hợp chấthữu cơ bị oxy hóa Carbon và hydro tham gia tạo thành CO2 và H2O Còn nitơ saukhi được giải phóng ra dưới dạng NH3 sẽ kết hợp với H2SO4 tạo thành (NH4)2 SO4 tantrong dung dịch Đuổi NH3 khỏi dung dịch bằng dung dịch NaOH, đồng thời cất và thu

NH3 bằng một lượng dư H2SO4 0.1N Định lượng H2SO4 0.1N dư bằng dung dịch NaOH0.1N chuẩn, qua đó ta tính được lượng nitơ có trong mẫu nguyên liệu cần phân tích

1.2 Quy trình thực hiện

• Vô cơ hóa mẫu

Quá trình này được tiến hành hoàn toàn trong tủ Hotte.Mẫu được cho vào bìnhKjeldahl.Tùy loại nguyên liệu nhiều hay ít chất đạm, ví dụ: mẫu rắn cân 0.2 đến 0.5g,mẫu lỏng lấy từ 2 đến 5ml (nước mắm lấy 2mL, sữa lấy 5mL) Thêm vào từ từ 10mL

H2SO4 đậm đặc (tỉ trọng 1.84).Để tăng nhanh quá trình vơ cơ hóa (đốt cháy) cần phảicho thêm chất xúc tác Có thể dùng Se kim loại (0.05g) hoặc dùng 0.5g hỗn hợpCuSO4 K2SO4 (1:3) Hỗn hợp xúc tác có tác dụng tăng nhiệt độ sôi, làm tăng vận tốcquá trình phản ứng.Có thể dùng xúc tác là acid perchloric HClO4, giải phóng oxy chophản ứng oxy hóa.Sau khi thêm các chất xúc tác, đun nhẹ hỗn hợp tránh sôi trào, và chỉđun mạnh khi hỗn hợp đã hoàn toàn chuyển sang dung dịch Lưu ý: nếu quá trình vô cơhóa được thực hiện đơn giản bằng cách đun trực tiếp bình Kjendahl trên bếp điện thìtrong quá trình đun thỉnh thoảng lắc nhẹ, tráng khéo léo sao cho không còn một vết đennào của mẫu nguyên liệu thí nghiệm chưa bị phân hủy sót lại trên thành bình Đun chotới khi dung dịch trong bình hoàn toàn trắng

Hướng dẫn sử dụng bộ vô cơ hóa mẫu

- Bật công tắc (1) và gia nhiệt trước khoảng 5 phút

- Cho dung dịch mẫu và chất oxy hóa (H2SO4) vào bình vô cơ hóa mẫu.

- Đóng chặt hệ thống bằng bộ Gaskets

- Điều chỉnh núm (2) để tăng/giảm nhiệt độ đun

Sau khi vô cơ hóa mẫu hoàn toàn, dung dịch trở nên trong suốt.Cần làm nguội trước khilắp vào hệ thống chưng cất BUCHI Distillation Unit 4

• Cất đạm

Chuẩn bỊ máy cất đạm: Cắm điện, bật máy, mở vòi nước làm lạnh, chờ đến khi mànhình hiện lên thì máy đã sẵn sàng làm việc Lấy vào erlen 10ml dung dịch H 2SO4, lắpvào máy Chú ý nhúng ngập ống vào dịch lỏng.Cài đặt chương trình cho máy (tỷ lệ sụchơi: 50%, thể tích NaOH 40%: 5 - 10mL, thời gian cất: 15 - 30 phút)

Tiến hành : Chuyển toàn bộ dung dịch mẫu sau khi đã vô cơ hóa xong ở bình Kjeldahl

vào bình định mức 100, thêm nước cho đến vạch định mức Lưu ý acid H2SO4 đậm đặcrất háo nước và tỏa nhiệt mạnh khi tiếp xúc với nước nên có thể làm bay hơi mộtphần.Vì vậy, cần làm nguội và điều chỉnh lại mức nước để tránh sai số, sau đó đổ raerlen

Lấy vào ống phản ứng 10mL dung dịch thí nghiệm từ bình định mức.Lắp vào hệ thống,chú ý không lắp lệch, khí sẽ thoát ra ngoài, mất mẫu

Tiến hành cất đạm trên máy cho đến khi NH3 được giải phóng hoàn toàn khỏi bìnhKjendahl

Thủ tục hiệu chỉnh như sau:

- Lấy 10mL H2SO4 0.1N (chuẩn) vào erlen, định phân bằng V (mL) NaOH 0.1N đã phasẵn.Thêm 3 giọt chỉ thị phenolphtalein.Từ thể tích định phân (V) suy ra được Ct và K.

N - hàm lượng Nitơ tính bằng phần trăm khối lượng

a - số mL dung dịch chuẩn H2SO4 0.1N đem hấp thụ NH3

b - số mL dung dịch NaOH 0.1N sử dụng chuẩn độ

m - khối lượng mẫu đem vô cơ hóa, g

V - tổng thể tích định mức dung dịch vô cơ hóa (100mL)

v - thể tích dung dịch vô cơ hóa dùng chưng cất (10 mL)0.0014 - lượng Nitơ (gam) ứng với 1mL H2SO4 0.1N

• Đơn giản, chi phí thấp

• Chính xác, phương pháp chuẩn để phân tích hàm lượng protein thô (AOAC945.01)

Nhược điềm của phương pháp

• Cách pha thuốc thử Biuret

Thuốc thử biuret được pha từ 3 dung dịch thuốc thử là dung dịch A, B và C Các dungdịch này được chuẩn bị như sau:

- Dung dịch A: 05g CuSƠ4 5H2O hòa tan trong 495 mL nước ( dung dịch CuS04.5H2O 1%)

- Dung dịch B: 10g NaKC4@4O6.4 H2O hòa tan trong 490 mL nước ( dung dịchNaKC4H40i.4 H2O 2%)

- Dung dịch C: 20,5g Na2CO; và 4g NaOH hòa tan và định mức thành 1 lít dung dịch(dung dịch Na2CO; 2% trong NaOH 0,1N)

Thuốc thử biuret = 1 mL dung dịch A + 1 mL dung dịch B + 98 mL dung dịch C

Hình 1: phương trình phản ứng giữa thuốc thử Biuret với NH 3

NH NH NU

NH NH

Vùng nồng độ tuyến tính là 1-5 mg/ml

Sử dụng đường chuẩn độ với BSA (bovine serum albumin)

2.2 Quy trình thực hiện

Pha 5 dung dịch protein chuẩn từ huyết thanh bò ứng với 5 nồng độ khác nhau 2, 4,

6, 8 và 10 (mg protein/ mL).Lấy 1 mL từng dung dịch protein chuẩn và 5 mL thuốc thửbiuret cho ống nghiệm.Hỗn hợp được lắc đều trong 15 phút ở nhiệt độ phòng Hỗn hợpsau đó được đem đo độ hấp thu ở bước sóng 540 nm

Vẽ đường chuẩn: trục hoành là nồng độ protein, trục tung là độ hấp thu

Hình 2: Phương trình đưởng chuẩn

pháp Lowry, uv, có ít hợp chất phi protein gây ảnh hưởng nên phản ứng Biuret,không phát hiện N từ nguồn không phải peptide hoặc protein.

• Không sử dụng hó chất độc hại

Nhược điểm

• Không nhạy bằng phương pháp Lowry

• Cần 2 - 4 mg protein cho một lần đo

• Các muối ammoni nồng độ cao có thể gây ảnh hưởng

3 Phương pháp lowry

3.1 Nguyên tắc

Cu2+ trong môi trưởng kiềm sẽ tạo phức hợp với protein.Cu2+ xúc tác oxy hóa nhómphenol trong tyrosine và tryptophan bằng thuốc thử Folin-Ciocalteau (phosphomolybdic-phosphotungstic acid) => tạo ra hỗn hợp có màu

Hình 3: sơ đồ phản ứng phân tích protein bằng phương pháp lowry

3.2 Quy trình thực hiện

Pha loãng mẫu (20 - 100 microgam protein)

Cho mẫu phản ứng với KNa tartate- Na2CƠ3 10 phút ở nhiệt độ phòng

Phản ứng với CuSƠ4- KNa tartate-NaOH 10 ở nhiệt độ phòng

Tiếp đó cho phản ứng với Folin 10 phút ở 500C

Đo độ hấp thu ở bước sóng 600 nm

• Tính chuyên biệt cao, nhanh và đơn giản (~1.5 giở).

• Rất nhạy: 20-100 ụg.- 50-100 x so với Biuret, 10-20 x so với uv 280 nm

Nhược điểm

• Rất nhạy cảm với thay đổi pH

• Màu dễ bị biến đổi bởi các loại protein khác nhau (nhiều hơn so với Biuret)

• Có nhiều hợp chất gây ảnh hưởng: sucrose, lipid, đưởng khử, hexoamine, aminosultate

• Không sử dụng hóa chất độc hại

• Có thể xác định lượng protein trong mẫu trong vòng 3 phút, có thể tiến hành mộtlúc 150 mẫu

ị- Các yếu tố ảnh hưởng đến nhuộm màu ion âm:

• Monosaccharide/đường đơn): không thể phân hủy thành dạng đường đơn giản

Hơn đi u kiện mường

• Oligosaccharide: thường 2-10 đường đơn

• Polysaccharide: polymer của đường đơn

Chức năng: Nguồn carbon và năng lượng

Một số phương pháp định lượng carbohydrate:

1 Định lượng đường khử bằng phương pháp Bertrand

1.1 Nguyên tắc

Trong môi trường kiềm các đường khử (glucoza, fructoza, mantoza ) khử oxitđồng (2) thành oxit đồng 1 (Cu+2^Cu+1).Để định lượng đường khử dùng thuốc thửFehling: dung dịch sunfat đồng (Fehling I) và dung dịch muối xecnhet: muối kali-natritartrate kép (Fehlinh II) hoặc gọi là Fehling A và Fehling B, theo tỉ lệ 1:1 Khi trộn Fehling

I và Fehling II, đầu tiên tạo thành Cu(OH)2 có màu xanh da trời

hoặc xeton dễ dàng khử Cu thành Cu ra kết tủa oxit đồng (Cu20) có màu đỏ.

Cu 2 O + Fe 2 (SO 4 ) 3 + 2H 2 SO 4 = 2 CuSO 4 + FeSO 4 + H 2 O

Tiếp đó lượng Fe+2 tạo thành được xác định bằng cách oxi hóa nó bằng dung dịchKMn04 chuẩn độ trong môi trưởng axit

1OFeSO 4 + 2 KMnO 4 + 8@ 2 SO 4 = 5Fe 2 (SO 4 ) ; + 2MnSO 4 + K 2 SO 4 + H 2 O

Dựa vào lượng KMn04 tiêu tốn ngưởi ta lập bảng tỉ lệ giữa lượng KMn04 1/30N vàlượng đưởng khử (bảng 1) để dễ sử dụng

Thuốc thử Fehling

+ Fehling II: 200g muối xecnhet + 150g Na0H/ 1 lít

• Dung dịch Fe2(S04)3 trong axit sunfuric: 50g Fe2(S04)3 + 200ml H2S04 đậm đặc(d ? 1,4)/lit Hoặc dung dịch sunfat kép sắt amoni

• 86g (NH4)2S04 Fe2(S04)3.24H20 + 200g (108,7ml) H4S04 d ? 1,84/1

• KMn04 1/30N; 1,06g KMn04/1 lít nước cất đun sôi Nồng độ KMn04 được xácđịnh bằng oxalat amoni hoặc axit oxalic một ngày sau khi pha

Bâng 1: Bàng thực nghiệm cúa Luxisun 1.2Cách tiến hành

- Xử lí mẫu

Tùy đối tượng nghiên cứu (hạt, quả ) mà cách chuẩn bị dung dịch nghiên cứu dùng

để định lượng đường có khác đôi chút, nhưng nguyên tắc chung như sau:

a Trong trưởng hợp nguyên liệu không chứa quá nhiều tinh bột hoặc inulin:

Fructose(mg)

Glucose(TTig)

Eructơse(mg)

Có thể chiết đường từ nguyên liệu bằng nưỚc.Cân và cho vào cối sứ 1g nguyên liệu hạthay các mẫu thí nghiệm thực vật khô như cây, lá hoặc quả khô đã được nghiền nhỏ(và sấy khô đến khối lượng không đổi) Nếu nguyên liệu tươi (như hoa, quả tươi) thìcân 5 - 10 g Nghiền cẩn thận với bột thủy tinh hay cát sạch và 30ml nước cất nóng 70

- 80oC Chuyển toàn bộhổn hợp vào bình định mức dung tích 1 lít Đun cách thủy 70

-80oC trong 35 - 40 phút, kết tủa protein và các tạp chất bằng dung dịch chì axetat[Pb(C2H2O2) 2.3H2O)] hoặc chì nitrat [Pb(NO;)2] 10%.Tránh dùng quá dư chì axetat(dùng 2 - 5ml chì axetat).Sau đó loại bỏ lượng chì axetat dư bằng dung dịch Na2SO4bão hòa,

để yên hỗn hợp 10 phút.Tiếp đó thêm nước cất tới vạch mức và đem lọc quagiấy lọc vào cốc hay bình khô.NưỚc lọc dùng làm dung dịch thí nghiệm

b Trong trưởng hợp nguyên liệu chứa quá nhiều tinh bột hoặc

Cần chiết đường bằng rượu 70 - 80oc, đun hỗn hợp cách thủy trong bình cách thủy có

axetan ^àĩợtèpprOtéôn sckĩýểnoào díườdPdịỉiợphôàg kírô cần kết tủa protein bằng chì

c Trưởng hợp mẫu chứa nhiều protein

Kết tủa protein và các tạp chất dùng dung dịch tricloacetic 10 %, sau đó trung hòa bằngdung dịch NaOH 5 % với chỉ thị metyl đỏ (màu đỏ chuyển sang màu vàng).Thêm nướccất tới vạch định mức, lọc qua giấy lọc.NưỚc qua lọc là dung dịch đường khử cần địnhlượng

d Trưởng hợp các nguyên liệu chứa nhiều axit hữu cơ

Cần _ chú ý trong quá trình đun khi chiết, đường saccarose có thể bị thủy phận _ một phần

Do đó cần xác định riêng đường khử và đường saccarose Trước khi đun cách thủy hỗnhợp phải trung hòa axit bằng dung dịch Na2CO3 bão hòa tới pH 6,4 - 7,0

Dung dịch mẫu sau khi đã được chuẩn bị (xem ở trên) được lấy 10 ml (0,8 - 40mgđường) cho vào bình tam giác V 100ml, thêm 5ml Fehling I và 5 ml Fehling II Đun sôihỗn hợp trong 3 phút tính từ khi xuất hiện bọt khí đầu tiên Sau khi đun sôi dung dịchvẫn giữ màu xanh biếc đặc trưng.Nếu dung dịch mất màu chứng tỏ lượng Fehling chovào không đủ.Lúc đó phải làm lại thí nghiệm hoặc cho thêm lượng Fehling hoặc giảm

lượng mẫu.Để .yên, .lọc .bằng phễu ‘lọc Xđường^(G-41 vào, bìph.Jọc, qhận khôngbehzen.Rửa Dinn và phễu lọc bằng nước cất nóng 3 - 4 lần Chu ý giữ ‘phần ĩớn lượngoxit đồng I nằm lại trong bình tam giác và lớp oxit đồng trong bình và trên phễu luôn

1.3Tính kết quả

được phủ một lớp nước nóng để Cu2O khỏi bị oxi hóa bởi O2 của không khí Hòa tankết tủa của oxit đồng I vào bình bunzen khác bằng cách cho những lượng nhỏ (5ml)dung dịch sunfat sắt 3 trong môi trường H2SO4 vào bình có chứa kết tủa Cu2O vàchuyển sang phễu lọc.Tráng cẩn thận bình và phễu lọc 3-4 lần bằng nước cất nóng.Nước tráng cũng thu vào bình Định phận dung dịch bằng KMnO4 1/30N cho đến khixuất hiện màu hồng nhạt không mất đi trong 20-30 giậy.Biết lượng định phận, tra bảngsuy ra lượng đường trong dung dịch thí nghiệm Làm thí nghiệm kiểm chứng song songthay dung dịch đường bằng nước cất.

1.3Tính kết quả

17

Hàm lượng đưởng khửtính theo phần trăm (%):

1000: hệ số chuyển đổi sang mg

2 Định lượng đường khử theo phương pháp vi lượng của Rodzevich

2.1 Nguyên tắc

Phương pháp dựa trên cơ sở trong môi trưởng kiềm của đưởng khử (glucose,tructose, mantose ) có thể khử dễ dàng đồng (II) thành oxit đồng (I) (Cu+2 ^Cu+1) dướidạng kết tủa màu đỏ và qua lượng CuSƠ4 dư (không tham gia phản ứng) tính đượclượng đưởng khử.Cơ chế của quá trình xảy ra theo các giai đoạn sau:

chúK'‘tĩt/êo1 Hl^igdainíoạnc' Aehling I và Fehling II với nhau thì xảy ra phản ứng giữa

Đầu tiên tạo thành kết tủa đông hidroxit màu xanh da trởi:

CuSO 4 +2NaOH ? Cu(OH) 2 + Na 2 SO 4

Sau đó Cu(OH)2 tác dụng với muối Seignett tạo thành muối hòa tan có dung dịchmàu xanh thẫm:

1.3Tính kết quả

v I |(>Ỳ>COOK Ỉ H2OH 1 ỊO^-£ÓQk

Lượng CuSO4 dư (không tham gia phản ứng) cho tác dụng với KI trong môi trưởng

H2SO4 sẽ giải phóng ra iot tự do

CuSO 4 + 4KI + H 2 SO 4 I 2 + CuI 2 + 2K 2 SO 4

Chuẩn độ lượng iot tạo thành bằng natri thiosuntat (Na2S2O3) chuẩn, qua đó tính đượclượng đưởng khử có trong dung dịch

I 2 + 2Na 2 S 2 O 3 ? Na 2 S 4 O 6 +2NaI

Dung dịch Fehling I: 34,64 g CuSO4.5H2O trong 500ml H2O

Dung dịch Fehling II: 173g Seignett + 50g NaOH trong 500ml H2O

Dung dịch KI 30%, dung dịch H2SO4 25% , dung dịch Na2S2O;0,1N

Bước 2: Đun sôi 2 phút (kể từ lúc xuất hiện bọt sôi đầu tiên) Sau khi đun sôi, dungdịch vẫn còn màu xanh đặc trưng và ở dưới có một lớp kết tủa đồng I oxit màu đỏ gạch

là được Nếu dung dịch mất màu hoàn toàn chứng tỏ lượng dung dịch Fehling cho vàokhông đủ để oxi hóa hoàn toàn lượng đường có trong dung dịch mẫu thí nghiệm.Trường hợp đó phải làm lại thí nghiệm với dung dịch đường ít hơn hoặc pha loãng dungdịch đường.Ngược lại, nếu không có lớp kết tủa đồng I oxit thì phải tăng lượng dungdịch đường, giảm nước cất (luôn đảm bảo thể tích là 5ml)

Bước 3: Làm nguội, cho thêm vào hỗn hợp 1ml H2SO4 25% và 1ml KI 30%, lắc đều

3 Định lượng đường saccarose theo phương pháp thủy phân bằng acid

Trong nhiều loại rau, củ, quả các vật phẩm thực phẩm có chứa một lượng khá lớn

saccarose cùng với đường khử.Saccarose không có tính khử nên không thể trực tiếp

xác định bằng phương pháp Bertrand.Để có thể xác định saccarose bằng phương phápnày phải thủy phân saccarose thành đường khử (glucozo và fructozo).

3.1 Nguyên tắc

Khi thủy phân dung dịch saccarose bằng axit ta được hỗn hợp của hai đường khử

ỊầccHRosỊ? cvàtWRsẫùĐv? ngượog đường khử tạo thành cho p'áp tính được lượng

3.2Tiến hành

• Lấy 10ml dung dịch mẫu thí nghiệm (đã loai bỏ protein và chuẩn bị cho xác địnhđường khử cho vào bình nón 250ml)

• Cho thêm 5ml dung dịch HCl 5%

• Đun cách thủy hỗn hợp có ống làm lạnh bằng không khí trong 30 - 40 phút, làmnguội nhanh

• Trung hòa hỗn hợp bằng dung dịch Na2CO; bão hòa đến pH 6,5 - 7,0 với chỉ thịmetyl đỏ(3 giọt)

• Thêm từng giọt kiềm cho đến khi dung dịch chuyển từ đỏ sang vàng

Xác định lượng đường bằng phương pháp Bertrand

Chú ý: Khi xác định saccarose là các dịch chiết bằng nước có thểkết quả sẽ bị sai

khác, bởi vì có một số polysacarit cao phân tử khác cũng chuyển vào dịch chiết một số

phần hay hoàn toàn.Trong quá trình thủy phân những chất này cũng tạo thành các

monosacarit.Do đó có thể chiết đường bằng cồn sao cho nồng độ của cồn trong dung

dịch đạt 75 - 80%.

3.3Tính kết quả

21

Hàm lượng saccarose của mẫu thí nghiệm được tính theo công thức:

X ? (a - b) 0,95Trong đó:

X: hàm lượng saccarose tính theo %

a: hàm lượng đường khử theo glucose của dịch đường sau khi thủy phân bằngaxit (%)

b: hàm lượng đường khửcủa dung dịch đường (trước khi thủy phân) (%)

0,95: hệ số chuyển từ glucose sang saccarose

4 Phương pháp định lượng saccarose

4.1 Nguyên tắc

_Làm trong d.una dịc'trước khi phân.cực để tránh ản' .hưởng của các phất có, gócquay cực Khác và Toại 00 các chát màu ảnh nương đên ket qua đo Cấc cnat lam trongthường sử dụng là: Axetat chì trung tính Pb(CH3COO)2.3H2O và axetat chì kiềm tính2Pb(CH3COO)2.Pb(OH)2 ở dạng bột hoặc dung dịch Axetat chì lắng hàng loạt các chấtnhư axit oxalic, oxit axit protein, saponin, các chất màu, các chất pectin, các chất màumelanoidin

Chú ý. không dùng quá lượng axetat chì vì một số kêt tủa có khả năng hòa tan khi

dư axetat chì như các protein Nitrat chì là chất làm trong mạnh hơn, đó là một hỗn hợpgồm hai dung dịch Pb(NO;)2 và NaOH 340 g Pb(NO;)2/1 lit; 32g NaOH/1 lit dùng lượngbằng nhau (5-10 ml) Khi sử dụng cho nitrat chì trước, NaOH sau.Chú ý: Lượng chì dưtrong dung dịch có thể loại bể bằng dung dịch NaH^PO4 hoặc 1 giọt axit axetic đắm đặc.Thước đo độ đường: thèo quy định thước đo độ đường trong kê chỉ 100°S khi ta hòatan 26g đường saccaroza tinh khiêt trong 100 ml nước cất và phân cực trong ống 200

mm ở 20°C 26 g gọi là lượng cân tiêu chuẩn, 200 mm là ống phân cực tiêu chuẩn Khicân mẫu với lượng cân chuẩn và phân cực kê bằng ống tiêu chuẩn, số chỉ trên thước

đo cho ta biêt % đường trong mẫu.Trong thực tê phân tích ta có thể lấy bội số hoặc ước

số của chúng Ví dụ nêu lấy13g pha trong 100ml phân cực trong ống 200 mm thì thànhphần đường sẽ là Px2

Trong đó: P - số đọc trên máy Hoặc pha 26g trong mẫu 100 ml phân cực bằng ống

100 mm thì thành phần đường cũng bằng Px2

Dung dịch axetat chì trung tính 250g Pb(CH3COO)2.3H2O + 50 ml nước cất, khuấyđều, lọc Nước lọc trung hòa bằng axit yếu.Pha nước cất đến khấc 1 lít Dung dịchaxetat chì kiềm tính: 100g oxit chì (PbO)+ 230g axit chì trung tính +50 ml nước cất Đunsôi trong % giở để thủy phân oxit Để nguội, lọc, pha bằng nước cất đến 1 lit (54Bx).

Dung dịch nitrat chì: 340 g Pb(NO;)2 trong 1 lit; 32g NaOH trong 1 lit

HCl 24,85 Bx: 510,57 ml HCl đậm đặc trong 1 lít

NaCl: 231,5 g NaCl trong 1 lít

Than hoạt tính 5g/100ml, axit axetic đậm đặc, Ete etylic, bột kẽm,

4.2Tiến hành: Xác định hàm lượng saccaroza trong đường kính

Cân 26 g đường bằng cân phân tích vào 1 cốc khô có miệng rót (đã cân trọnglượng cốc) Hòa tan đường trong cốc bằng khoảng 40 - 50 ml nước cất đã đun nóngdùng đũa thủy tinh khuấy cho đường tan hết

Rót toàn bộ dung dịch đường sang bình định mức, rửa sạch đường trong cốc, quethủy tinh và phễu bằng một ít nước cất, chuyển tất cả vào bình định mức

Thêm nước cất đến gần vạch định mức, để yên khoảng15-20 phút cho nhiệt độdung dịch đường gần bằng nhiệt độ trong phòng

Thêm nước cất đến vạch bình định mức, đậy nút bình lắc đều, để yên 1-2 phút rồilọc.Khi lọc nhớ đậy phễu, lọc bằng kính thủy tinh để tránh nước bay hơi làm thay đổinồng độ Mẻ lọc đầu đổ đi.Nước lọc phải trong suốt.Rót dung dịch vào ống phân cự 200mm; nhớ tráng ống bằng dung dịch nước lọc 1-2 lần và rót bằng cách đẩy nhẹ trên

miệng ống để tránh tạo bọt

Đậy nắp ống phân cực bằng nắp thủy tinh bằng cách đẩy nhẹ nắp trên miệngống.Giữ yên rồi vặn nút cao su vào miệng ống

Lau khô hai đầu ống bằng một miếng giấy lọc

Đưa ống ra ánh sáng quan sát, ống phải được nhìn thông suốt và không có bọt, nếu

có bắt buộc phải làm lại Đặt ống phân cực vào máy, bật điện và bắt đầu đo.Ghi kết quả

và ghi nhiệt độ t

4.3Tính kết quả

Hàm lượng đường saccaroza tính theo %; X

X = Pt [1 + 0,0003 (t - 20)]

Trong đó:

Pt : hàm lượng đưởng đọc được trên máy :

t : nhiệt độ

5 Định lượng fructose trong dung dịch có lẫn đường khử khác

Muốn biết riêng hàm lượng của glucose và tructose, ngưởi ta phải định lượngtructose.Nếu hàm lượng các đưởng khử khác không đáng kể thì hàm lượng glucosebằng hiệu hàm lượng đưởng khử và hàm lượng tructose.TrưỚc hết phải xác định lượngđưởng khử tổng số, sau đó mới xác định lượng tructose

5.1 Nguyên tắc

Đầu tiên oxi hóa glucose và các đưởng khử khác bằng dung dịch kiềm của iôt

CH 2 OH(CHOH) 4 CHO+ I 2 + 3NaOH = CH 2 OH(CHOH) 4 COONa + 2NaI + H 2 O

Trong điều kiện này, tructose không bị oxi hóa Sau đó xác định tructose bằng phươngpháp Bertrand hoặc phương pháp vi lượng

Dung dịch iot 0,2N trong KI, dung dịch NaOH 0,2N, dung dịch NaOH 5%, dung dịch

H2SO4 5%, dung dịch Na2SO3 5%, dung dịch methyl 0,02% (0,02g metylđỏ(Ci5Hi5N3O2) 60 ml cồn, 40 ml nước)

Các thuốc thử dùng để xác định đưởng khử

5.2Tiến hành

Cho vào bình nón 250ml 20ml dung dịch thí nghiệm (chứa không quá 20 mgglucose Trung hòa đến pH 6,5 - 7,0 Cho thêm 5ml dung dịch iot 0,2N và 2,5ml dungdịch NaOH 0,2N (thêm từng giọt).Giữ 15 phút ở nhiệt độ phòng

Axit hóa dung dịch bằng 2ml H2SO4 5% và loại iot dư bằng dung dịch Na2SO;5%(nhỏ từng giọt cho đến khi dung dịch mất màu vàng rơm)

Thêm vài giọt metyl đỏ và trung hòa hỗn hợp bằng NaOH 5%.Thể tích dung dịchthu được là Vđo Dịch thu được chỉ chứa tructose Phân tích tructose theo phươngpháp Bertrand hoặc theo phương pháp vi lượng.

a - số ml Na2S2O3 0,1N dùng chuẩn đội đối chứng,

b - hệ số Na2S2O; 0,1N chuẩn độ mẫu thí nghiệm,

f - hệ số chỉnh nồng độ của Na2S2O3 0,1N

3,3 - hệ số chuyển thành đường

V - tổng thể tích dịch chiết tỪm gam nguyên liệu (ml)

20 - lượng dung dịch thí nghiệm loại các đường khử khác (trừ fructose)

Rửa tinh bột bằng nước cất 2-3 lần.Chọc thủng giấy lọc và chuyển tinh bột vào bìnhcầu chứa 25ml dung dịch HCl 5%.Đậy kín bình bằng nút cao su có nắp ống làm lạnh hồilưu.

Đun cách thủy hỗn hợp 3-5 giờ Thử sự thủy phân hoàn toàn của tinh bột bằngdung dịch jot.Làm nguội, trung hòa hỗn hợp bằng dung dịch NaOH 5% đến pH 5,6-6,0(bỏ trực tiếp mẫu giày qúỳcho vào bình)

Chuyển hỗn hợp vào bình định mức 100ml Kết tủa protein bằng dung dịch chìaxetat 10% Loại bỏ chì axetat bằng dung dịch Na2SO4 hoặc NaHPO4 bão hòa.Thêmnước cất tới vạch mức, lắc đều và lọc

Định lượng đường glucose trong dung dịch (lấy 5ml hoặc 10ml) bằng phương phápBertrand, qua đó tính được hàm lượng tinh bột

V1- thể tích dung dịch đưởng (sau khi thủy phân) lấy để xác định đưởng glucose(ml)

V - dung tích bình định mức

W - khối lượng mẫu thí nghiệm (mg)

100 - hệ số chuyển thành %;

0,9 - hệ số quy chuyển glucozo thành tinh bột

7 Định lượng đường khử bằng phương pháp quang phổ so màu với thuốc thử DNS

Tương tự như phương pháp Bertand

• Tiến hành phản ứng và dựng đường chuẩn glucose

Sử dụng dung dịch glucose chuẩn 0.1%, mẫu và thuốc thử để chuẩn bị dãy ốngnghiệm sau:

Bảng 2: Chuẩn bỊ dãy ống nghiệm chuẩn và mẫu

$TT ông nghiệm ĐC l Ị 3 4 5 MSU 1 MỈU 2

m - khối lượng mẫu (g)

8 Xác định đường khử bằng phương pháp chuẩn độ oxi hóa khử với

KALIFERRYCYANURE

8.1 Nguyên tắc:

Khi rhrt forr\/n\/om iro K 3 Fofr^\R 6 nhản ứnn 1/ÁM diprvnn khTp cỏn nhấm thii Hì prvr* là

.Khi cno hiiKVkyợHUih ^K rh(.vjE.) p.i I n „ứHU vựi.vưởng-.kin , wM.ni UJJ| m LUU uượkJìferrocyanurẻ7 Dựa vào phan ứng này, ta co me suy ra lượng đương khử co mặt trongdung dịch cần xác định Việc chuẩn độ được tiến hành trong môi trương kiềm NaOH,khi đun nong với chỉ thị xanh mẻtylẻn (mẻthylẻn bluẻ)

Phương trình phản ứng:

CHÌOH-ÍCHOH^HO + K3Fe(CN)6 + 2Na()H

- >CH2OH-(CHOH)rCOONa + NaK3Fe(CN)ờf H20

Phượng pháp này đợn ai.ản hợọ xPkư.png pháp dùng dung dịp' kiềm của sulfat đồng

do không tạo tua Va phan ứng Kếtthuc rõ ràngKerqua ĩínn toán không dựa vàophượng trình lý thuyết, mà dùng công thức thực nghiệm.Độ chính xác của kết qua phụthuộc nhiều yếu tố, nhưng trình tự tiến hành và thao tác là quan trọng nhất

8.2Quy trình thực hiện

• Quy trình xử lý mẫu: tượng tự như phượng pháp Bẻrtrand

TỪ m gam (hoặc mL nếu mẫu lỏng) mẫu ban đầu, chung ta tiến hành trích ly đươngkhử và định mức thành 100 mL (dung dịch chứa đương khử thô).Cho vào burẻttẻ dungdịch mẫu chứa đương khử đã được lọc tách tạp chất

Cho vào ẻrlẻn 10mL dung dịch K3Fẻ(CN)61% và 2,5mL dung dịch NaOH 2,5N Đunsôi và chuẩn độ ngay trên bếp bằng dung dịch đương khử hoặc đương tổng từ burẻttẻ,cho từng giọt một, lắc mạnh.Dung dịch ban đầu co màu vàng chanh của fẻrrycyanurẻ.Điem dỪng chuẩn độ xác định khi màu vàng chanh biến mất, dung dịch trong suốtkhông màu trong khoang 30 giây rồi chuyển sang màu vàng rợm rất nhạt củafẻrrocyanurẻ Trong trương hợp kho nhận điểm chuyển màu, co thể kiểm tra điểm kếtthuc bằng cách nhỏ một giọt chỉ thị mẻthylẻn bluẻ và một giọt đương thừa đầu tiên sẽlàm mất màu xanh cho biết phan ứng đã kết thuc

Lưu ý:

• Kết quả lần chuẩn độ đầu tiên chỉ có giá trị tham khảo cho lần chuẩn độ thứ hai.Lần này, sau khi đun sôi dung dịch terrycyanure, xả nhanh lượng đường (theokết quả lần chuẩn độ trước), chỉ để lại khoảng dưới 1mL để chuẩn độ tiếp tìmchính xác điểm cuối.

• Kết quả tính toán chỉ sử dụng từ lần chuẩn độ thứ hai trở đi

• Thí nghiệm tương tự đối với dung dịch đường chuẩn là dung dịch glucose 0,5%

Xk- lượng đường khử, g/100g hay g/100mL

Vg- thể tích dung dịch glucose 0,5% cho chuẩn độ, mL

Vk- thể tích dung dịch đường khử cho chuẩn độ, mL

V - thể tích bình định mức, mL (100 mL)

m - lượng mẫu thí nghiệm, g hoặc Ml

PHÀN III: LIPID (CHÁT BÉO)

Lipid là dẫn xuất các acid béo cao phân tử và các alcohol.Lipid thường gặp là dầu thực

vật và mỡ động vật.ở động vật, lipid phân bố chủ yếu trong mô mỡ, não, sữa ; còn ở thực

vật thường tập trung ở hạt (nành, phộng, oliu, hướng dương, cám,.)

Chất béo có thể hoà tan trong ether, chlorotorm, hoặc các dung môi hữu cơ khác,

không, hòa tan trong nước

Các phương pháp định lượng lipid:

1 Định lượng lipid tổng trong mẫu rắn bằng phương pháp Soxhlet

1.1 Nguyên tắc

Dùng dung môi kỵ nước trích ly hoàn toàn lipid từ nguyên liệu đã được nghiền nhỏ.Một

số thành phần hòa tan trong chất béo cũng được trích ly theo bao gồm sắc tố, các vitamintan trong chất béo, các chất mùi.Tuy nhiên, hàm lượng của chúng tương đối thấp Do có lẫntạp chất, phần trích ly được gọi là lipid tổng hay dầu thô

Hàm lượng lipid tổng có thể tính bằng cách cân trực tiếp lượng dầu sau khi chưng cấtloại sạch dung môi hoặc tính gián tiếp tư khối lượng bã còn lại sau khi trích ly hoàn toànlipid bằng dung môi

1.2Quy trình thực hiện:

Sấy khô nguyên liệu đến khối lượng không đổi.Cân khoảng 5g nguyên liệu đã đượcnghiền nhỏ, cho vào túi giấy chuyên dùng cho bộ Soxhlet đã được sấy khô và biết khốilượng Đặt túi giấy vào trụchiết.Lắp cốc chứa dung môi vào các vỊ trí cố định trên thiết bị

Mểh vsaíQtìátrĩưỚtríicipíy vóo:hếiiẾniiinẾidKànheFế6c^aEicioiạỉHbộ gia nhiệt và điều chỉnh nhiệt

Trong đó:

M1 là khối lượng túi giấy và mẫu ban đầu, gM2: khối lượng túi giấy và mẫu sau khi trích lipid và sấy khô, gM: khối lượng mẫu ban đầu, g

2 Định lượng lipid tổng trong mẫu lỏng bằng phương pháp Adam Rose-Gottlieb

so với diethyl ether

Hỗn hợp sau khi bổ sung dung môi và khuấy đảo tách thành hai pha: pha nhẹ nằm ởtrên gồmduna môi và béo, pha năng nằm dưới, gồm nước và các chấtthòa tan trong nước

Ta thu pha nhẹ gồm dung môi va béo, làm Daỳmơi dung môi ta thu được tổng béo trongmẫu sữa

2.2Quy trình thực hiện

Lấy 10mL dịch sữa cho vào erlen 250mL.Sau đó bổ sung lần lược 1.5 mL dung dịch

NH3 và 10mL cồn.Lắc đều hỗn hợp trong 1 phút.Thêm từ từ 25mL diethy ether và lắc đều

hỗn hợp trong 10 phút.Cuối cùng, 25mL diethy ether được bổ sung và hỗn hợp được lắc

đó cho đĩa petri này vào tủ sấy đang ở chế độ sấy 102 ± 1 0C.Sấy đến khối lượng không đổi(khoảng 1h) Sau đó đĩa petri chứa béo được làm nguội về nhiệt độ phòng và cân địnhlượng

2.3Tính toán kết quả

Hàm lượng chất béo có trong 100mL dịch sữa được tính theo công thức sau:

• Trộn 1g mẫu và 10ml Methanol và đồng hóa bằng cấy đảo trộn trong 1 phút.

• Bổ sung 20ml Chloroform và đồng hóa trong 2 phút

• Lọc hỗn hợp qua giấy lọc ( dung môi hòa tan chất béo hoặc xác chất rắn )

• Bổ sung dịch lọc với 30ml hỗn hợp Chloroform-Methanol với tỷ lệ 2:1 và lọc lần hai

• Xấ^rte tích dịch lọc và bổ sung dung dịch KCL 0.88 % vào dịch lọc với thể tíchbằng 25% thể tích dịch lọc

• Lúc này, hỗn hợp tách làm hai lớp: lớp dưới là dung môi hòa tan béo,lớp trên chứaKCL.Ta thu nhận lớp dung môi hòa tan béo

• Xác định thể tích dịch trích và bổ sung nước với thể tích bằng 25% thể tích dịch trích

• Bổ sung Na2SO4 vào hỗn hợp để loại nước.lọc hỗn hợp qua giấy lọc, Sử dụngchloroform để rửa natri sunfat trên giấy lọc

Đặt hỗn hợp chloroform - lipid trong một bình đáy tròn và loại bỏ chloroform từ lipid bằngcách sử dụng một thiết bị bay hơi quay với nhiệt độ nước dưới 50OC, ta thu được lượng lipidtrong mẫu

4.2Ng&yêHnsc> há P Babcook

-Sử dụng H2SO4 để kết tủa protein, tạo ra nhiệt và giải phóng chất béo => hỗn hợp tựtách làm hai lớp: lớp trên là chất béo, lớp dưới là những chất hào tan => đo thể tích lớp trênchứa chất béo => % chất béo trong hỗn hợp.

4.2Quy trình:

• Cho mẫu vào chai badcook và cho acid vào,cho phép acid chạy nhẹ nhàng xuống cổ

fiỢa>i'gẵédj sácàmảemạ táỵHợ^ốn^ỉệp vàt.9iúp giải p'óng chất béo Ly tâm hỗn

• Bổ sung nước vào chai để đẩy chất béo lên trên cổ chai.Thắt chặt các nút và kết hợplắc trong 4 phút

• Đặt chai trong cốc nước 60-63°C trong 5 phút rồi xác định thể tích chất béo bằngvạch đo trên cổ chai

2,5-Thêm vào đó 20ml hổn hợp CHCI3/CH3OH với li lệ 2:1 theo thể tích, lắcmạnh trong 1 phút (có thể lắc bằng máy khuấy từ hoặc máy đồng nhất), rồi thêmvào đó 80ụl HCl 6N để yên ít nhất 2 giở, sau đó thêm 4,2ml dung dịch KCl0,37M, lắc mạnh rồi đưa vào máy li tâm quay khoảng 10 phút, lấy ra dùng pipetloại bỏ phần trên còn phần dưới cho vào đó 10 ml dung dịch H 2O/CH;OH/CHCl3,(dung dịch này pha sẵn theo tỉ lệ 47/48/3 theo thể tích), lắc mạnh rồi ly tâm, loại bỏphần trên còn phần dưới lại cho 10 ml H2O/CH3OH/CHCl3 rồi lặp lại như trên lần

2

Sau khi loại bỏ phần trên, phần còn lại cho vào phễu chiết, thêm vào đómột ít CHCl3, và nước cất lắc mạnh để lắng rồi thu hồi lấy phần dưới vào một bìnhcầu đã cân sẵn để biết trọng lượng Lại cho thêm CHCl3, và nước vào phần còn lại ởphếu chiết, lắc để thu hồi hết chất béo còn lại ở phần trên

Phần dưới lại thu hồi vào bình cầu trên, sau đó lắp bình cầu vào một bộ cấtchân không để cất đuổi CHCl3 sau đó cho ít cồn tuyệt đối vào bình cầu và cất chođốn khô Phần còn lại trong binh cầu chi là chất béo Để bình cầu vào bình hút

ẩm rồi cân (nếu trưởng hợp thấy trong bình cầu đục hoặc có cặn thì cho vào

đó ít CHCl3, và lọc qua lớp bột amiăng, cát, bông thuỷ tinh rồi rnới cất đổ tách hếtCHCl3)

G: trọng lượng mẫu phân tích (g)

PHÀN IV: PHÂN TÍCH VITAMIN

Vitamin, còn gọi là sinh tố, là một yếu tố dinh dưỡng không thể thiếu của mọi sinh

vật, đó là những hợp chất hữu cơ có trọng lượng phân tử nhỏ, có cấu tạo hóa học rấtkhác nhau, nhưng đều có hoạt tính sinh học đảm bảo cho các quá trình chuyển hóa

trong cơ thể hoạt động bình thường, và có ảnh hưởng đến sự trao đổi chất của sinh vật

Khi nói đến chất dinh dưỡng thì không ai lại không nghĩ đến vitamin, nó được coi

là một chất dinh dưỡng không thể thiếu trong bữa ăn hằng ngày Nó có vai trò rấtquan trọng đến sự sinh trưởng và phát triển của con người, nếu thiếu Vitamin thì conngười sẽ mắc một số bệnh ,như thiếu vitamin A thường có triệu chứng quáng gà, thiếuvitamin B12 dễ teo não, thiếu vitamin D có liên quan đen bệnh phổi tự miễn, Ngoài ra,chúng ta cần phải quan tâm đến hàm lượng vitamin trong thực phẩm để lựa chọn cácthực phẩm sao cho phù hợp với cơ thể để tránh tình trạng thừa vitamin

Phương pháp xác định một số vitamin:

1 Vitamin tan trong dầu

1 Caroten: Xác định caroten bằng phương pháp cột.

1.1 Nguyên tắc

so nĩátòầaoAnc^kliềt lượng nựỏPctìấiípi^ĩrbb^vàoiđươẹt, tì'ótiiắícxô6 cột Ọệữhấp thụ, cho pha động chạy qua cột do các cấu tử có ái lực khác nhau với pha tĩnh nênchất nào có ái lực mạnh hơn với pha tĩnh thì sẽ bị giữ lại lâu hơn còn những chất có áilực yếu hơn sẽ bị pha động cuốn ra khỏi cột với vận tốc khác nhau.Sau đó lấy các cấu

tử đã được tách ra đem so sánh với mẫu chuẩn

Hóa chất:

• Cát tinh chế: đổ cát qua rây có đường kính lỗ 4 - 5mm Rửa cát qua rây bằngnước máy, rồi dùng HCl( tỷ lệ 1/1) cho vào cát, khuấy kỹ, ngâm 1 đêm Rủa cátcho tới hết axit Rủa lại bằng nước cất, sấy khô

• Benzen: nhiệt độ sôi 70 - 80 0C

• Chất hấp phụ: nhôm oxit (AkOs)

• Natrisuntat khan (Na2SO4)

• Dung dịch azobenzen tiêu chuẩn

1.2 Cách tiến hành.

Cân 5g mẫu lương thực, thực phẩm khô cho vào cối sứ nghiền kỹ với 5g cát sạchtrong 30 phút Để làm khô kỹ, ta cho thêm vào cối sứ 10g Na2SO4 khan nghiền tiếp hỗnhợp trong 30 phút nữa

Phần dưới của cột sắc ký kỹ với 5g cát sạch trong 30 phút.Để làm khô kỹ, ta chothêm được nhồi bông thấm nước.Sau đo cột được nhồi nhôm oxyt khoảng 2/3 cột.Dùngđũa thủytinh nén nhôm oxyt cho chặt.Trên cùng lại đặt 1 lớp bông dày 1cm.

Bột khô từ cối được chuyển vào phần trên của cột sắc ký.Cho bezen vào cột đếnkhi thấy lớp bột không thấm benzen nữa.Sau đó dùng bơm hút nhẹ để lớp bột được rữachầm chậm bằng benzen đến khi không còn thấy những giọt màu vàng chảy ra khỏi cộtsắc ký vào bình hứng cần chú ý cho bezen phủ ngập lớp bột vì caroten dễ bị oxy hóabởi không khí

Chuyển toàn bộ caroten từ bình hứng vào bình định mức dung tích 50ml hoặc100ml (tùy thể tích nước hứng được) và thêm bezen đến vạch mức, lắc nhẹ Dung dịchcaroten này được đem so màu cùng với dung dịch azobenzen tiêu chuẩn (đã pha loãng

10 lần) Trong 1ml dung dịch có màu giống dung dịch azobenzen tiêu chuẩn chứa0,00235 mg caroten

2 Xác định vitamin A bằng phương pháp so màu.

2.1 Nguyên tắc

thưởk Aợp mớt ẫ!spbébcíỉaồĩì<?vưísfôằrìó)<tậBgi'ìầứfi egas^âư^V? vay kàmuốn xác định vitamin A phải xà phòng hóa cácsản phẩm, ròi xác định vitamin A trongphần không xà phòng hóa.Vitamin A được tách ra khỏi dung dịch không xà phòng hóabằng chlorotorm khan và nó cho phản ứng với antimony (III) clorua tạo sản phẩm màuxanh và đem so màu với dung dịch tiêu chuẩn

2.2Cách tiến hành

Cần 10 đến 20g mẫu cho vào bình nóng dung tích 250ml thêm 20ml dung dịch kalihydroxit 20% trong rượu etylic Đậy bình bằng nút bất có gắn ống làm lạnh và đun hồilưu trên nồi cách thủy ở nhiệt đọ 85-90oC trong 2 giở để xà phòng hóa Dung dịch đã xàphòng hóa được pha loãng bằng 20ml nước cất rồi chuyển vào phễu chiết thêm vàophễu chiết 50ml ete etylic và lắc kĩ ( để tránh huyền phù cần chiết dịch lúc nguội và lắcmạnh ) chiết phần không xà phòng hóa ra, tiếp tục lắc và chiết lấy lớp trên vào phễuchiết thứ 2 Rửa dịch chiết bằng nước cất trong 3-4 lần mỗi lần 20ml nước cất cho đếnkhi nước rửa có phản ứng trung tính ( thử bằng giấy quỳ) Làm khô nước chiết đã rửabằng 6gam natrisuntat khan trong 30 phút Chuyển cả dung dịch vào cốc, sau đó đunđuổi este trên nồi cách thủy

Hòa tan cặn không xà phòng hóa thu được bằng clorotorm ( sau khi đã đuổi hếteste) và chuyển vào bình định mức dung tích 25ml, thêm clorotorm cho đến vạch, lắcnhẹ

Cho vào ống nghiệm ( khô,sạch,cùng màu ,cùng kích thước như ống nghiệm chứadung dịch tiêu chuẩn) đúng 0,2ml dung dịch trong bình định mức trên, thêm 1-3 giọtanhydric axetic, 2ml dung dịch SbCl; bão hòa lắc nhanh và để không quá 10 giây đem

đo màu với ống tiêu chuẩn trong 20 giây

J Vitamin tan trong nước

3 Xác định vitamin C

3.1 Nguyền tắc

Vitamin C(axit ascorbic) có phổ biến trong cơ thể động và thực vật Trong phân tửascorbic chứa nhóm dienol (-C0H=C0H-) có tính khử mạnh vitamin C dễ bị oxy hóathành axit dehydroascorbic, phản ứng có tính thuận nghịch

Dựa trên tính khử mạnh của acid ascorbic người ta đã đề ra hàng loạt phươngpháp hóa học để định lượng nó.Tuy nhiên, cho kết quả chính xác nhất và hay dùng nhất

là phương pháp cho acid ascorbic khử muối natri của 2,6 diclophenolindophenol

Xác địn' vitamin C dựa trên nguyên , tắc: .vitamin C được chiết ra khỏi .lương thực,thực phẩm băng acid acetic hoặc acia clohydric Sau đó chuẩn độ nước chiết trong môitrường axit (pH=3-4) băng 2,6 diclophenolindophenol, rồi tính ra lượng vitamin C

3.2 Phương thức thực hiện

• Chuẩn bị mẫu thử

• Lượng cân sản phẩm lấy tùy thuộc vào hàm lượng vitamin C của nó

• Có thể dùng acid oxalic 1% để tráng cối và thêm đến vạch mức, hoặc dùngacetat chì 5%(5ml) để kết tủa protein, loại trừ chất khử và sắc tố

• Dùng pipet hút vào bình nón hoặc cốc nhỏ 5ml dịch lọc có chứa vitamin C, thêm5ml dung dịch oxalat amoni bão hòa, 10ml nước cất và định phân băng dungdịch 2,6diclophenolindophenol 0,001N từ microburet cho tới xuất hiện màu hồngbền (không mất màu trong 1 phút ).

4 Xác định vitamin B1 bằng phương pháp so màu huỳnh quang

4.1 Nguyên tắc

Vitamin B1 (thiamin) có công thức cấu tạo như sau:

Vitamin B1 bền trong môi trưởng axit, ở pH = 3 nó không bị phân hủy khi đun nóngtới 120 0C Thiamin dễ tan trong trong nước, trong rượu etylic loãng, rượu metylic,trong axit axetic và không tan trong clorotorm, rượu butylic, isobutylic, isoamylic etepetro, ete sunturic

Thiamin rất nhạy với chất oxy hóa với chất khử.Và khi bị oxy hóa nó biến thànhthiocrom.Chất này dưới tác dụng tử ngoại có màu huỳnh quang xanh.Đây là cơ sở củaphương pháp xác định vitamin B1 vì phản ứng oxy hóa vitamin thành thiocrom xảy ratheo đúng tỷ lệ đương lượng: một phân tử thiamin tạo thành một phân tử thiocrom.Đểphản ứng trên có thể xảy ra, trước hết phải giải phóng thiamin ra khỏi mẩu bằng chếphẩm men

Hóa chất:

• Rượu butylicẪ isơbutylic hoặc .i.soamylic.CáG rượu này phải .khôpg.phát huỳnhquang Cơ tnể khử cnấtphat huynh quang Dằng than hoại tinh (T5gam than chomột 1ml rượu) rượu trộn với than lắc 30 phút trên máy lắc,làm khan bằng CaCl2

và cất ở nhiệt độ thích hợp

• Chế phẩm men của vi khuẩn ti penicillum, khuẩn ti pencillium được sấy khô ởnhiệt độ dưới 40o rồi chiết lấy men bằng cách nghiền khuẩn ti với một ít dungdịch natri axetat

• Dung dịch vitamin B1 tiêu chuẩn