Chuong 5 enzyme

• Trên bề mặt của các enzyme có một hoặc một số khe, túi- chỗ lõm gọi là vị trí hoạt động active site nơi xảy ra hoạt động xúc tác của enzyme... Ngoài hoạt tính tổng hợp, enzym này còn

Chương 5 Các enzyme chính sử dụng trong kỹ thuật di truyền

Khái niệm enzyme

• Enzyme là một protein có khả năng tham gia xúc tác các phản ứng hóa học trong và ngoài cơ thể.

“Enzyme là chất xúc tác sinh học”

Cấu trúc của Enzyme

• Enzyme đơn giản-enzyme một thành phần nghĩa là khi thủy phân chỉ cho một thành phần duy nhất là amino acid Hoạt tính của

enzyme này chỉ phụ thuộc vào cấu trúc của protein

• Enzyme phức tạp: Ngoài thành phần protein gọi là apoezyme, enzyme còn chứa thêm nhóm không phải là protein gọi là

cofactors Nhóm ngoại này rất đa dạng Có thể phân biệt ba

Cấu trúc của Enzyme

(2) Nhóm phụ gia (prosthetic group) tương tự như coezyme nhưng gắn chặt với protein enzyme bằng liên kết hóa trị chẳng hạn như enzyme catalase Giống như coenzyme nhóm prosthetic thường là thành phần cơ bản trong cơ chế xúc tác của enzyme.

(3) Nhóm ngoại là các ion kim loại như Fe, Mn, Cu, Ca, Zn, Mg Các ion

có vai trò ổn định cấu trúc của enzyme và cơ chất hoặc có thể tham gia trực tiếp phản ứng chẳng hạn như cytochrome chứa Fe tham gia vào chuỗi

chuyền điện tử.

• Một số enzyme đòi hỏi cả hai thành phần để có hoạt tính xúc tác Nhóm ngoại thường ổn định nhiệt trong khi protein enzyme bị biến tính khi bị đun nóng Phức hệ enzyme-cofactor có hoạt tính xúc tác gọi là

holoenzyme Khi cofactor bị loại bỏ thì phần protein (apoenzyme) còn lại mất hoạt tính xúc tác.

• Trên bề mặt của các enzyme có một hoặc một số khe, túi- chỗ lõm gọi là

vị trí hoạt động (active site) nơi xảy ra hoạt động xúc tác của enzyme.

Các enzyme chủ yếu sử dụng trong công nghệ gen

• Các enzym dùng để ghép nối ADN: ADN ligase

• Các enzym dùng để nhân ADN: Các polymerase

• Enzym tổng hợp ADN từ ARN: reverse transcriptase

• Các enzym sửa đổi ADN.

• Các enzym dùng để cắt ADN: Các nuclease, enzym

giới hạn.

Các ligase

• Các ADN ligase có vai trò xúc tác sự tạo thành liên kết phosphodieste giữa hai chuỗi ADN.

T4 DNA Ligase

T4 DNA Ligase: Enzym này được tách chiết từ các tế

bào E coli bị nhiễm thực khuẩn thể (phage T4)

Có khả năng sửa chữa khoảng trống nicks trong chuỗiADN (Hình thành liên kết phosphodiester giữa các

nhóm OH 3' và nhóm phosphat 5' trong các khung của hai vùng đã bị bẻ gẫy)

ADN ligase T4 có thể gắn các đoạn ADN có đầu so le cũng như đầu bằng

Quá trình nối các đầu cắt bởi RE

Hai sợi ADN bắt cặp nhờ các liên kết hydro giữa các cặp bazơ Các khoảng trống (Nicks) trong chuỗi cần được gắn lại bằng ligase

Cơ chế hoạt động của T4 DNA Ligase

Các polymerase

ADN polymerase I (pol I):

• Xúc tác sự tổng hợp một mạch đơn ADN mới, xúc tác cho sự gắn các nucleotit vào khoảng trống trên mạch polynucleotit của sợi

ADN Ngoài hoạt tính tổng hợp, enzym này còn có chức năng củamột nuclease (3'->5' proof-reading exonuclease), có khả năng phân giải các liên kết giữa các nucleotit ở đầu mạch theo cả chiều 5’ đến 3’ và 3’ đến 5’

• Klenow fragment (cải tiến từ DNA pol I (loại bỏ 323 a.a): Mất hoạt tính nuclease tuy nhiên vẫn duy trì hoạt tính của polymerase như DNA pol I Được sử dụng để đánh dấu các mẫu dò.

Các polymerase

Các polymerase

• ARN polymerase: RNA pol tham gia vào việc tổng hợp RNA theochiều 5’→ 3’, thông dụng nhất là: SP6 RNA polymerase: có nguồn

từ phage xâm nhiễm Salmonella typhimurium, T3 và T7 RNA

polymerase: có nguồn gốc từ phage xâm nhiễm E.coli.

Các polymerase - Reverse transcriptase

Enzyme phiên mã ngược

Một số DNA polymerases chịu nhiệt

• Taq polymerase của vi khuẩn Thermus aquaticus Trọng lượng

phân tử 94kD Hoạt động tối ưu ở 75-80oC nhưng vẫn bền

vững ở nhiệt độ cao hơn (i.e 90-95oC)

• Stoffel fragment: là Taq polymerase (61kD) nhưng có thể hoạt động ở nhiệt độ cao gấp 2 lần so với Taq tự nhiên.

• Một số enzym mới được phát triển gần đây, như Tli- và

Pfu-polymeraza, có độ chính xác cao hơn nhưng tốc độ tổng hợp

ADN và hiệu suất phản ứng PCR không cao bằng

Taq-polymeraza

• Recombinant Taq polymerase

có tính đồng nhất cao→ độ phân giải cao hơn

Các enzym sửa đổi ADN

1 Alkaline phosphatase

2 Polynucleotide kinase

3 Terminal deoxynucleotidyl transferase

Các enzym sửa đổi ADN

Alkaline phosphatase:

Loại bỏ nhóm photphat từ đầu 5’ của phân tử ADN và RNA, do vậy ngăn cản sự hình thành liên kết phosphodiester mới bởi

ADN Ligase

Sử dụng để xử lý vector sau khi cắt bởi

enzyme giới hạn nhằm ngăn cản quá trình

tự nối của vector (ví dụ như tự nối (khép

vòng) của plasmid)

Các enzym sửa đổi ADN

Polynucleotide kinase:

Bổ sung nhóm photphat vào các đầu 5’ của phân tử ADN

Được dùng xử lý các đoạn ADN trước khi nối với nhau (trườnghợp đoạn ADN không có gốc phosphate ở đầu 5’) hoặc dùng khi bổ sung các nhóm photphat có hoạt tính phóng xạ vào các đầu 5 của phân tử ADN

Các enzym sửa đổi ADN

Terminal deoxynucleotidyl transferase

• Bổ sung một hay nhiều nucleotid vào các đầu 3’ của phân

Enzym giới hạn (restriction enzymes - RE)

• Khái niệm: là các enzyme có khả năng nhận dạng và cắt DNA chỉ ở những vị trí đặc hiệu nhất định.

Enzym giới hạn (restriction enzymes - RE)

RE phân huỷ liên kết phosphodieste của bộ khung DNA mạch đôi mà không gây tổn hại đến bases

Phương thức hoạt động của RE

Lịch sử phát hiện

• 1952–1953 : Luria and Human and Bertani and Weigle

quan sát được hiện tượng một số dòng vi khuẩn có khả

năng chống lại sự xâm nhiễm của một số thực khuẩn thể.

• 1962: Werner Arber phát hiện các vi khuẩn này có chứa hệ thống enzyme có khả năng nhận biết và phá huỷ DNA của phage, đồng thời có khả năng tự biến đổi DNA của bản

thân để tránh bị phá huỷ (RE loại I).

• 1970, Haminton Smith at Johns Hopkins University, Phát

hiện được enzyme HindII từ Haemophilus influenzae: có

khả năng cắt đặc hiệu đồng thời tự methyl hoá DNA của tế bào chủ để tự bảo vệ (RE loại II).

Restriction-modification (R-M) system

 Restriction- modification (R-M) system

– Hoạt tính RE - Endonuclease : cắt DNA ngoại lai tại vị trí nhận biết

– Hoạt tính Methyltransferase : bảo vệ DNA tế bào chủ khỏi bị phân cắt bởi restriction enzyme.

– Methyleate 1 trong các bazơ ở mỗi sợi DNA

strand

• Restriction enzyme và hệ thống sửa đổi kèm

theo → R-M system

Dựa vào thành phần, đặc điểm, ví trí cắt và yêu cầu cofactor, các RE được phân thành 4 loại: I, II, III, và IV

II Mg 2+ • Cắt tại vị trí nhận biết hoặc rất gần vị trí nhận

biết đặc hiệu.

EcoRI, BamHI

III ATP,

Mg 2+ • Cắt ngoài vị trí nhận biết khoảng 25 – 27 bp. EcoPI,

HinfIII

IV Mg 2+

• Cắt tại vị trí hoặc rất gần vị trí nhận biết.

• Chỉ phân cắt các DNA đã bị sửa đổi (methylated, hydroxymethylated and glucosyl-

hydroxymethylated bases)

RE loại II

Jacqueline J.T Marshall1 and Stephen E Halford, Biochemical Society Transactions (2010) Volume 38, part 2

RE loại III

• Kết hợp đặc tính restriction-and-modification

• Cắt ngoài vị trí nhân biết.

• Yêu cầu 2 trình tự nhận biết ở hai phía đối diện

trong cùng một phân tử DNA.

RE loại IV

• Chỉ phân cắt các DNA đã bị sửa đổi (methylated,

hydroxymethylated and glucosyl-hydroxymethylated bases)

• Trình tự nhân biết chưa được xác định rõ

• Vị trí cắt DNA xảy ra ở ~30 bp từ vị trí nhận biết

• Sự tương đồng về trình tự cho thấy nhiều hệ thống enzyme như vậy có ở các vi khuẩn và vi khuẩn cổ khác

RE loại II

• Hữu ích nhất cho phân tích gene và nhân dòng

• Ngày nay, người ta đã phát hiện hơn 4.000 REases, nhận biếthơn 300 trình tự khác nhau

Cách gọi tên các enzym giới hạn kiểu II

– EcoRI

E = Escherichia Tên chi (genus)

co = coli Tên loài (species)

R = strain RY12 Tên strain or serotype

I = chữ số la mã = Thứ tự tìm ra enzyme

– HinDIII

Haemophilus influenza, serotype d, 3rd enzyme.

(Smith and Nathans (1973)

Đặc điểm của trình tự nhận biết của RE loại II

Don't nod Dogma: I am God Never odd or even Too bad – I hid a boot Rats live on no evil star

No trace; not one carton Was it Eliot's toilet I saw? Murder for a jar of red rum Some men interpret nine memos Campus Motto: Bottoms up, Mac

Go deliver a dare, vile dog! Madam, in Eden I'm Adam Oozy rat in a sanitary zoo

Ah, Satan sees Natasha Lisa Bonet ate no basil

Do geese see God?

God saw I was dog Dennis sinned

Trình tự nhận biết là các palindrome

Đây là đoạn DNA mạch kép, 2 mạch

bổ sung có trình tự giống nhau khi đọc

theo cùng chiều 5’→3’ hoặc ngược lại

Hind III AAGCTT TTCGAA

Pst 1 CTGCAG GACGTC Bam H1 GGATCC CCTAGG

Các kiểu cắt: Tạo đầu so le và đầu bằng

5’ overhangs

3’ overhangs

blunt ends

Kiểu cắt tạo đầu so le

Kiểu cắt tạo đầu bằng

Enzym Vi khuẩn có enzym Vùng nhận biết

EcoRI Escherichia coli GA-A-T-T - C

Enzym Vi khuẩn có enzym Vùng nhận biết

MstII Microcoleus stuarti c-c  t-n-a-g-g

Một số RE đặc biệt

Neoschizomers

• Các RE nhận biết cùng một trình

tự nhưng lại cắt ở vị trí khác nhau

được gọi là neoschizomers

isocaudomers: Các RE nhận biết các trình tự DNA khác nhaunhưng khi cắt DNA tạo ra các trình tự đầu dính giống nhau.

Một số RE đặc biệt

Tần xuất cắt của RE

• Nếu giả thiết trình tự sắp xếp của các loại base là ngẫu nhiên thìxác suất để một đoạn trình tự được nhận biết sẽ là 1/4n (n làchiều dài (bp) của chuỗi được nhận biết)

Ứng dụng của RE

• Tạo DNA tái tổ hợp

• Lập bản đồ giới hạn

Tạo phân tử DNA tái tổ hợp

BẢN ĐỒ GIỚI HẠN

• Là bản đồ thể hiện loại enzym giới hạn, số lượng

và kích thước các đoạn DNA bị cắt bằng enzym giới hạn.

• Một phân tử khi sử dụng các loại enzym khác nhau có thể cho nhiều đoạn cắt khác nhau hình thành nên các bản đồ giới hạn khác nhau.

• Được sử dụng trong xác định nguồn gốc hoặc sự khác nhau giữa các cá thể trong loài.

• Điện di kết quả trên gel agarose cùng với thang DNA chuẩn, tính toán kết quả và lập bản đồ.

Sử dụng enzym 1 để cắt đoạn ADN

nghiên cứu (kích thước 17kb) Kết quả cho 3 đoạn ADN (6kb, 3kb, 8kb) Điều này chứng tỏ enzym 1 có 2 vị trí cắt trên đoạn ADN nhưng chưa rõ đoạn 3kb nằm ở giữa hay ở cuối sợi Khi cắt sợi ADN nghiên cứu bằng enzym 2, kết quả cho 2 đoạn cắt (7kb, 10kb) chứng

tỏ enzym này chỉ có một điểm cắt trên sợi 17kb Khi cắt bằng tổ hợp hai

enzym 1 và 2 cho thấy có sự xuất hiện lại đoạn 6kb và 8kb, hai đoạn này là sản phẩm của sự hoạt động của enzym

1 Như vậy đoạn 3kb sẽ bị cắt bởi

enzym 2 (vì kết quả cắt phối hợp cho 4 đoạn (6kb, 8kb, 2kb, 1 kb) Từ đây suy

ra đoạn 3kb phải nằm ở giữa sợi

A.Nếu cắt plasmid với SalI, bao nhiêu đoạn DNA sẽ được tạp ra? Kích thước của chúng?

B.A Nếu cắt plasmid với EcoRI, bao nhiêu đoạn DNA sẽ được tạp ra? Kích thước của chúng?

C.A Nếu cắt plasmid với EcoRI + Hind III + SalI, bao nhiêu đoạn DNA sẽ

được tạp ra? Kích thước của chúng?

Vẽ kiểu băng DNA sau khi cắt plasmid ở slide trước với các RE khác nhau (xem box)