bằng dung hợp tế bào trần Tabata và cs nuôi tế bào thực vật ở quy mô công nghiệp phục vụ sản xuất shikonin chọn lọc dòng tế bào cho sản lượng các sản phẩm thứ cấp cao hơn Marton và cs [r]
Trang 1HỌC THEO CHỦ ĐỀ Ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào trong
nhân giống cây trồng nông, lâm nghiệp A-ĐẶT VẤN ĐỀ
Công nghệ sinh học là sự ứng dụng tổng hợp của sinh hóa học, vi sinh vật học và các khoa học về công nghệ để đạt đến sự ứng dụng công nghiệp các năng lực của vi sinh vật, của các tế bào, các tổ chức nuôi cấy và các thành phần của chúng
Công nghệ sinh học như một thân cây mà những rễ chính của cây này là vi sinh vật học, di truyền học, sinh hóa học, điện tử học, nông học, công nghệ học…và trên vòm lá với hàng nghìn quả đó là các loại sản phẩm phục vụ trồng trọt, chăn nuôi, y học, năng lượng mới, vật liệu mới, tuyển khoáng, bảo vệ môi trường
Nhờ ứng dụng các thành tựu mới mẻ của công nghệ sinh học như kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào, kỹ thuật tái tổ hợp di truyền, người ta có thể tạo ra được những giống cây trồng không những có năng suất cao mà còn chống chịu được với sâu bệnh, hạn hán và điều kiện nghèo phân bón Nhờ bỏ qua được việc lai chéo và khắc phục được sự tương khắc sinh sản mà việc lai tạo giống rút ngắn được nhiều thời gian Kỹ thuật tái tổ hợp AND và các kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào mở ra khả năng lai khác loài và làm tăng nhanh tính đa dạng di truyền
Đối với các loại cây trồng có giá trị thương mại lớn, kỹ thuật nuôi cấy mô
đã đem lại những hiệu quả kinh tế hết sức rõ rệt
Hiện nay, người ta đã bắt đầu ứng dụng khả năng nuôi cấy tế bào thực vật tách rời ở qui mô công nghiệp để thu nhận các sản phẩm, các hoạt chất sinh học có giá trị kinh tế cao Nuôi cấy mô tế bào thực vật là một ngành khoa học trẻ có nhiều triển vọng, được ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực kinh tế
B-NỘI DUNG
I Lịch sử hình thành và phát triển công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật.
Những năm 70 của thế kỷ XX là thập niên của sự bùng nổ công nghệ sinh học thực vật, đặc biệt là kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật Đây là công cụ nghiên cứu của rất nhiều nhà khoa học Trong vòng 30 năm trở lại
Trang 2đây, kỹ thuật này đã làm nên một cuộc cách mạng lớn trong nhân giống thực vật và hiện nay người ta đang hướng tới mục tiêu áp dụng kỹ thuật này để sản xuất cây giống thương mại Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã trở thành một phương pháp nhân giống chuẩn và phổ biến đối với nhiều loại cây trồng như: cây công nghiệp, cây lâm nghiệp, cây cảnh, cây dược liệu, cây ăn trái và rau xanh Những kiến thức về công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật ngày càng được củng cố và có nhiều bước tiến rõ rệt Với phương pháp này người ta có thể nhân giống rất nhiều loài cây từ các vùng khí hậu khác nhau trên thế giới mà các phương pháp nhân giống truyền thống không thể thực hiện được
1 Giới thiệu sơ lược về công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật
1.1 Giới thiệu
Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật là thuật ngữ mô tả các phương pháp nuôi cấy các bộ phận thực vật (tế bào đơn, mô, cơ quan) trong ống nghiệm có chứa môi trường dinh dưỡng thích hợp như muối khoáng,
vitamin, đường và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong điều kiện vô trùng
Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật cho phép tái sinh chồi hoặc cơ quan từ các mô như lá, thân, hoa, rễ, củ hoặc đỉnh sinh trưởng Trước kia người ta dùng phương pháp này để nghiên cứu các đặc tính cơ bản của tế bào như sự phân chia, đặc tính di truyền và ảnh hưởng của các hóa chất đối với tế bào và mô trong quá trình nuôi cấy Hiện nay, các nhà khoa học sử dụng hệ thống nuôi cấy mô thực vật để nghiên cứu tất cả các vấn đề có liên quan đến thực vật như sinh lý học, sinh hoá học, di truyền học và cấu trúc thực vật Kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật cũng mở rộng tiềm năng nhân giống
vô tính đối với các loài cây trồng quan trọng, có giá trị về mặt kinh tế và thương mại trong đời sống hàng ngày của con người
1.2 Lịch sử phát triển của kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật.
Việt Nam
- Công nghệ NCMTBTV du nhập vào nước ta từ năm 1960 ở miền Nam và đầu những năm 1970 ở miền Bắc, nhưng thực sự phát triển từ năm 1980
- Lĩnh vực áp dụng rộng rãi công nghệ nuôi cấy mô - tế bào thực vật là lĩnh vực nhân giống, bảo quản nguồn gen cây trồng
- Nhiều phòng tỉnh thành trong cả nước đã xây dựng nhiều phòng nghiên cứu công nghệ cao để phát triển lĩnh vực nuôi cấy mô này
Trang 3- Ở nước ta cây trồng chuyển gen mới chỉ được nghiên cứu ở các viện, các phòng thí nghiệm, mà chưa được sản xuất ở quy mô lớn, đại trà như viện Di truyền Nông nghiệp, viện Công nghệ sinh học, viên Lúa đông bằng sông Cửu Long…và một số chương trình từ dự án quốc gia
và quốc tế và thành công trong việc chuyển một số gen diệt sâu, bệnh, kháng thuốc vào một số cây như lúa, ngô, cải bắp…
- Nhìn sang các nước khác chúng ta thấy công nghệ sinh học của Việt Nam còn đi một khoảng cách khá xa: Trung Quốc, Đài Loan, Mỹ…
*Thuận lợi
- Đảng và nhà nước tạo nhiều điều kiện giúp đỡ
- Đội ngũ cán bộ nghiên cứu ngày càng được nâng cao cả về số lượng và chất lượng
- Có điều kiện làm việc học hỏi với các tổ chức nghiên cứu, đào tạo nước ngoài: Úc, Thái Lan, Singapore, Đức…
*Khó khăn còn tồn tại
- Nghiên cứu khoa học và phát triển công nghệ: Các đề tài/dự án được xây dựng và đưa vào triển khai trên cơ sở đề xuất của các cá nhân và đơn vị nghiên cứu khoa học tương tự như các đề tài/dự án khác do Bộ Nông nghiệp
và Phát triển nông thôn quản lý Chưa có các đơn đặt hàng và yêu cầu của cơ quan quản lý của các Bộ/ Ngành địa phương và doanh nghiệp
- Đào tạo sau đại học
- Xây dựng, ban hành và áp dụng các văn bản quản lý
Tại Hà Nội, Ngoài việc tạo giống mới, nhân giống nhanh phục vụ lợi ích nông nghiệp ra thì các nhà khoa học còn chú ý tạo ra ngày càng nhiều các giống hoa “cao cấp” để phục vụ cho nhu cầu của người Hà Nội và sản xuất với số lượng lớn để đáp ứng nhu cầu của các địa phương khác như Đà Lạt, các tỉnh lân cận Hà Nội: Phú Thọ, Vĩnh Phúc, Hưng Yên….
Viện Sinh học Nông nghiệp Trường Đại học Nông Nghiệp I Hà Nội là một trong 50 cơ sở chuyên môn nuôi cấy mô tế bào, bước đầu cơ sở này đã đạt những kết quả tốt: nuôi cấy các loài Phong lan, dứa Cayen, khoai tây giống siêu sạch bệnh… Hầu hết các phòng nuôi cấy mô đều có ưu thế là có sản phẩm đầu ra liên tục và ổn định…
Hiện nay nghành chuyên nghành công nghệ sinh học tế bào ở Hà Nội đang có bước phát triển nhảy vọt để phục vụ cho nền nông nghiệp, Khu nông nghiệp công nghệ cao đầu tiên đang được xây dựng tại Hà Nội:
Dự án “Xây dựng cơ sở ứng dụng, sản xuất giống và sản phẩm cây trồng chất lượng cao” được khởi công năm 2003 và dự kiến thành công vào tháng
Trang 49 năm nay với hệ thống nhà kính với trang thiết bị hiên đại rộng hàng ngàn mét vuông.
Dự án được Trung tâm kĩ thuật rau quả thuộc sở Nông Ngiệp và Phát triển Nông thôn Hà Nội đăng kí ở cấp thành phố.
Thế giới
Chia làm 3 giai đoạn:
• Khởi đầu 1902 – 1933
+ Haberlandt, Đức (1902): “Tính toàn năng của tế bào thực vật’’
Tuy nhiên ông đã không thành công với các tế bào mô mềm, biểu bì
do chúng không thể phân chia được
• Giai đoạn 1934 – 1965
+ Phát hiện ra các hoocmon sinh trưởng đầu tiên
+ Xây dựng được môi trường cơ bản: MS, N6, B5
• Giai đoạn 1965 -1978 - đến nay
Phát hiện ra các kĩ thuật nuôi cấy mô có ý nghĩa : Tạo cây đơn bội, nuôi cấy tế bào trần…
1665 Robert Hooke quan sát được tế bào sống dưới kính hiển vi và
đưa ra khái niệm tế bào
1838 Matthias Schleiden và Theodore Schwann đề xướng học thuyết
tế bào Schleiden
1902 Haberlandt lần đầu tiên thí nghiệm nuôi cấy mô cây một lá mầm
nhưng không thành công
1904 Hannig tiến hành các thí nghiệm nuôi cấy phôi đầu tiên ở các
loài họ cải Crucifers
1922 Cho hạt phong lan nảy mầm in vitro
1924 Hình thành callus từ rễ cà rốt trong môi trường có acid lactic
1925 Làm hạt phong lan nảy mầm in vitro
1929 Laibach sử dụng nuôi cấy phôi để khắc phục hiện tượng bất hoà
hợp khi lai ở Linum spp
1934 White đã thành công khi nuôi cấy mô rễ cà chua trong thời gian
dài
Trang 51934 Kogl lần đầu tiên xác định được vai trò của IAA, 1 hoocmon
thực vật đầu tiên có khả năng kích thích sự tăng trưởng và phân chia tế bào
1936 Nuôi cấy phôi các loài cây hạt trần khác nhau
1939 Gautheret, Nobecourt và White lần đầu tiên nuôi cấy mô sẹo
thành công trong thời gian dài từ mô thượng tầng (cambium) ở
cà rốt và thuốc lá
1941 Overbeek và cs đã sử dụng nước dừa trong nuôi cấy phôi non ở
cà rốt
1942 Gautheret lần đầu tiên theo dõi sự hình thành chất trao đổi thứ
cấp trong nuôi cấy mô sẹo thực vật
1944 Skoog lần đầu tiên nghiên cứu sự hình thành chồi phụ từ nuôi
cấy mô thuốc lá in vitro
1946 Sự tạo cây đầu tiên từ đỉnh chồi ở Lupinus và Tropaeolum
1948 Hình thành chồi phụ và rễ ở thuốc lá
1950 Lần đầu tiên nuôi cấy thành công cây một lá mầm bằng nước
dừa
1951 Nitsch lần đầu tiên nghiên cứu nuôi cấy noãn tách rời in
vitro
Skoog nghiên cứu sử dụng các hoá chất điều hoà sinh trưởng và phát sinh cơ quan
1952 Morel và Martin lần đầu tiên tạo được cây Dahlia sạch
virus bằng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng
Morel và Martin lần đầu tiên thực hiện vi ghép in vitro thành công
1953 Tulecke lần đầu tiên thành công trong nuôi cấy bao phấn và tạo
mô sẹo đơn bội từ hạt phấn Ginkgo biloba
1954 Muir và cs lần đầu tiên tạo được mô sẹo từ mô nuôi dưỡng
(nurse culture)
1955 Miller và cs đã phát minh cấu trúc và con đường sinh tổng hợp
kinetin
1957 Skoog và Miller đã khám phá vai trò tỷ lệ nồng độ các
chất auxin : cytokinin trong môi trường đối với sự phát sinh cơ quan (rễ hoặc chồi)
Vasil nghiên cứu nuôi cấy bao phấn tách rời ở Allium cepa
1958 Maheshwari thực hiện nuôi cấy noãn tách rời in vitro ở
Trang 6cây anh túc Papaver somniferum
Maheshwari đã tái sinh thành công phôi soma từ phôi tâm (nucella) trong nuôi cấy noãn Citrus
1959 Tulecke và Nickell thử nghiệm sản xuất sinh khối thực vật
quy mô lớn (134 L) bằng nuôi cấy chìm
Reinert và Steward lần đầu tiên tạo được phôi vô tính từ nuôi cấy mô cà rốt
1960 Kanta lần đầu tiên thực hiện thụ tinh trong ống nghiệm ở
Papaver rhoeas
Cocking lần đầu tiên đã sử dụng enzym phân giải thành tế bào để tạo ra số lượng lớn tế bào trần
Morel lần đầu tiên thành công trong nuôi cấy mô đỉnh sinh trưởng để nhân nhanh phong lan
1962 Murashige và Skoog phát minh môi trường nuôi cấy mô tế bào
thực vật- môi trường
1964 Guha và Maheshwari lần đầu tiên thành công trong tạo được
cây đơn bội từ nuôi cấy bao phấn của cây cà rốt
1967 Bourgin và Nitsch tạo cây đơn bội từ hạt phấn thuốc lá
1969 Phân lập tế bào trần từ nuôi cấy tế bào dịch lỏng (huyền phù)
của Hapopappus gracilis
1970 Chon lọc đột biến sinh hoá ở thuốc lá
1971 Takebe và cs đã tái sinh được cây từ tế bào trần mô thịt lá ở
thuốc lá
1972 Carlson và cs tạo được cây từ lai xa tế bào trần đầu tiên nhờ
dung hợp tế bào trần của 2 loài thuốc lá Nicotiana glauca và N langsdorfii
1973 Phát hiện cytokinin có khả năng phá ngủ ở Gerberas
1974 Zaenen và cs phát hiện plasmid Ti đóng vai trò là yếu tố
gây u (crown gall) ở cây trồng
Melchers và Lalib tạo được cây đa bội từ dung hợp tế bào trần đơn bội
1975 Gengenbach và Green chọn lọc dòng tế bào kháng bệnh nấm
Helminthosporium maydis trong nuôi cấy mô sẹo ngô
1977 Chilton và cs chuyển thành công T-DNA vào thực vật
Noguchi và cs nuôi cấy tế bào thuốc lá trong bioreactor 20,000L
1978 Melchers và cs tạo được cây lai soma cà chua- thuốc lá
Trang 7bằng dung hợp tế bào trần
Tabata và cs nuôi tế bào thực vật ở quy mô công nghiệp phục vụ sản xuất shikonin (chọn lọc dòng tế bào cho sản lượng các sản phẩm thứ cấp cao hơn)
1979 Marton và cs xây dựng quy trình chuyển gen vào tế bào trần
bằng đồng nuôi cấy tế bào và Agrobacterium
1980 Alfermann và cs sử dụng các tế bào nuôi cấy trong chuyển hoá
sinh học digitoxin thành digoxin
1981 Larkin và Scowcroft đưa ra thuật ngữ "biến dị soma" để chỉ các
thay đổi di truyền tính trạng xảy ra do nuôi cấy mô và tế bào in vitro
1982 Krens đã chyển DNA vào tế bào trần
Zimmerman sử dụng kỹ thuật xung điện trong dung hợp
tế bào trần
1983 Công ty Mitsui Petrochemicals lần đầu tiên đã sản xuất
chất trao đổi thứ cấp trên quy mô công nghiệp bằng nuôi cấy tế bào dịch lỏng Lithospermum spp
Zambryski và cs thiết kế các vector chuyển gen thông qua Agrobacterium
1984 Chuyển gen vào tế bào trần thuốc lá Nicotiana bằng ADN
plasmid và tái sinh cây chuyển gen
1985 Fraley và cs thiết kế vector Ti plasmid đã loại bỏ các gen
độc gây hại cho việc chuyển gen vào thực vật
Horsch và cs chuyển gen vào mảnh lá bằng
Agrobacterium tumefaciens và tái sinh cây chuyển gen
An và cs đã phát triển hệ thống hai vector cho chuyển gen thực vật
Chuyển gen vào tế bào trần cây một lá mầm và hai lá mầm bằng phương pháp điện thẩm
Flores và Filner lần đầu tiên sản xuất chất trao đổi thứ cấp
từ nhân nuôi rễ tơ ở Hyoscyamus muticus Những rễ này sản xuất nhiều hoạt chất hyoscyamine hơn cây tự nhiên
1986 Crossway và cs chuyển gen vào tế bào trần thuốc lá bằng vi
tiêm AND trực tiếp
1987 Klein và cs đã sử dụng súng bắn gen (Particle gun) mang
vi đạn trong chuyển gen và tái sinh cây biểu hiện gen chuyển
Trang 8 Bytebier và cs lần đầu tiên đã chuyển gen vào cây một lá mầm (Asparagus) bằng Agrobacterium tumefaciens
1988 Klein và cs tái sinh cây chuyển gen ổn định thông qua phương
pháp bắn gen
1991 Sản xuất cây mang gen đầu tiên ở thông Larix decidua bằng
chuyển gen qua Agrobacterium rhizogenes
1992 Lúa kháng chất diệt cỏ nhờ chuyển gen vào tế bào trần thông
qua PEG
1993 Kranz và Lorz thực hiện thụ tinh in vitro tạo ra và nuôi cấy phôi
hợp tử ở ngô Các quá trình phát triển và phân hoá của phôi sau
đó đã được quan sát dưới kính hiển vi và phân tích biểu hiện của gen nhằm xác định các gen tham gia trong từng giai đoạn phát triển của phôi
1994 Thương mại hoá giống cà chua chuyển gen 'Flavr-Savr'
1998 Hamilton và cs đã phát triển vector mang NST nhân tạo của hai
vi khuẩn (BBIC) cho chuyển gen thông qua Agrobacterium (khả năng chuyển 150 kb)
II Khái niệm về phương pháp nuôi cấy mô tế bào.
-Tế bào, mô thực vật là một phần của cơ thể nhưng chúng vẫn có tính độc lập Nếu nuôi cấy mô tế bào trong môi trường thích hợp và cung cấp đầy đủ chất dinh dưỡng gần giống như trong cơ thể sống thì mô tế bào có thể sống Qua nhiều lần phân bào liên tiếp, biệt hóa mô và cơ quan, mô tế bào có thể phát triển thành cây hoàn chỉnh
III Cơ sở khoa học
-Tế bào thực vật có tính toàn năng Bất cứ tế bào nào hoặc mô nào thuộc các
cơ quan đều chứa hệ gen quy định kiểu gen của loài vật đó Chúng đêu có khả năng sinh sản vô tính để tạo thành cây hoàn chỉnh nếu được nuôi cấy
trong môi trường thích hợp Tính toàn năng của tế bào là cơ sở khoa học của
phương pháp nuôi cấy mô tế bào
-Cơ thể thực vật là một thể thống nhất bao gồm nhiều cơ quan có chức năng khác nhau, được hình thành từ nhiều tế bào khác nhau Tất cả các tế bào này đều có chung nguồn gốc là tế bào hợp tử Ở giai đoạn đầu, tế bào hợp tử phân chia thành các tế bào phôi sinh chưa mang chức năng chuyên biệt Sau
đó tế bào phôi sinh tiếp tục biến đổi thành các tế bào chuyên háo đặc biệt
Trang 9cho các, các cơ quan khác nhau Sự chuyển hóa các tế bào phôi sinh thành các tế bào chuyển hóa đảm nhận chức năng khác nhau gọi là sự phân hóa tế bào
-Tế bào đã phân hóa thành các tế bào chuyên biệt có chức năng khác nhau không mất đi khả năng biến dổi của mình Ở điều kiện thích hợp chúng lại
có thể trở về dạng phôi sinh và phân chia mạnh mẽ Quá trình này được gọi
là phản phân hóa tế bào.
- Kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào là kĩ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật có cách định hướng dựa vào sự phân hóa, phản phân hóa trên cơ sở tình toàn năng của tế bào thực vật khi được nuôi cấy tách rời trong điều kiện nhân tạo, vô trùng
Nuôi cấy mô tế bào
IV Quy trình công nghệ nuôi cấy tế bào
1)Các bước nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào
a) Chọn vật liệu nuôi cấy
-Chọn cây mẹ khỏe, sạch bệnh để cây sinh trưởng và phát triển tốt, không
tạo cơ hội cho sâu bệnh cản trở sự sinh trưởng và ohaats triển của cây con
dẫn đến năng suất và chất lượng giảm sút
- Chọn vật liệu nuôi cấy thường là các tế bào của mô phân sinh đỉnh chồi,
đỉnh rễ, bộ phận non Vì đây là các bộ phận có khả năng phân chia nhanh, có sức sống cao hơn, sinh trưởng tốt hơn, dễ tham gia vào quá trình phân hóa
và phản phân hóa tạo nên cơ thể mới Các bộ phận này cũng thường là cấc
bộ phận chống chịu tốt và ít bị nhiễm sâu bệnh Nếu vật liệu nuôi cấy là
đoạn thân , lá, rễ già thì sự phát sinh hình thái diễn ra chậm, mẫu cây dễ bị
thối và nhiễm các loại bệnh Vì vậy, đây là quy trình quan trọng nhất
Tế bào
hợp tử phối sinh Tế bào
Tế bào chuyên hoá đặc hiệu
Cây hoàn chỉnh
Tế bào phôi sinh
Tế bào chuyên hoá đặc hiệu Cây hoàn chỉnh
Trang 10- Vật liệu nuôi cấy được trồng trong buồng cách li để tránh hoàn toàn các nguồn lây bệnh
b) Khử trùng.
- Vật liệu nuôi cấy cần được được khử trùng để tránh sự xâm nhiễm cảu nguồn bệnh
- Tiến hành: Phân cắt đỉnh sinh trưởng của vật liệu nuôi cấy thành các phần nhỏ Mẫu sau khi cắt được tẩy rửa bằng nước sạch và khử trùng
c) Tạo chồi
- Quá trình này giúp cây phất triển thân, cành
- Tiến hành: Mẫu được nuôi cấy trong môi trường dinh dưỡng nhân tạo ( thường là môi trường mới) đẻ tái tạo cây từ đỉnh sinh trưởng
d) Tạo rễ
- Cần phải có quy trình tạo rễ để giúp cây hình thành rễ, tạo cây con hoàn chỉnh để nuôi cấy
- Tiến hành: Chồi đạt tiêu chuẩn được cắt thành mảnh nhỏ, sau đó được cấy
và chuyển sang môi trường tạo rễ có bổ sung chất kích thích phân trưởng ( NAA, IBA)
e) Cấy cây vào môi trường thích hợp
- Cấy cây vào môi trường thích ứng để cây thích nghi dần với điều kiện tự nhiên Đây cũng là quá trình không thể bỏ qua vì cây con mới tạo ra rất yếu, nếu trồng trực tiếp vào môi trường tự nhiên thì cây sẽ dễ nhiễm bệnh và chết
- Tiến hành: Sau khui cây tạo rễ, cây được cấy vào môi trường gần giống với môi trường tự nhiên có nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng, khí hậu phù hợp với với cây trồng
f) Trồng cây trong vườn ươm
- Cây được chuyển sang vườn ươm để phát triển trong môi trường tự nhiên, thuận tiện cho việc chăm sóc
- Tiến hành: Sau khi cây phát triển bình thường và đạt tiêu chuẩn giống, chuyển cây ra vườn ươm
2) Áp dụng
- Khoai tây: từ 1 củ khoai tây sau 8 tháng nhân giống thu được 2 tỉ màm giống đủ trồng cho 40ha